CN114540249B - 拮抗菌株1x1y及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及拮抗菌株1X1Y及其应用，属于植物病害生物防治技术领域，本发明提供的拮抗菌株1X1Y可显著抑制多种疮痂链霉菌和致病疫霉菌生长，能有效防治马铃薯疮痂病和晚疫病，可为马铃薯疮痂病和晚疫病的防治提供新的生防资源。

Description

拮抗菌株1X1Y及其应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株抑制多种马铃薯疮痂链霉菌和多个晚疫病菌生理小种生长的拮抗菌株1X1Y。

背景技术

马铃薯疮痂病(Potato Common Scab)是由链霉菌(Streptomyces.spp)侵染引起的一种典型的土传病害，链霉菌只侵染马铃薯表皮，不深入薯肉，在块茎表面结痂形成平状、凸状、凹状等病斑，致使薯块外观品质下降，严重影响马铃薯产业，特别是种薯产业的发展。目前，国内外学者报道了很多关于马铃薯疮痂病的防治方法，主要集中在抗病品种选育、水分调控、土壤酸碱度调节、轮作并施用绿肥、化学防治和生物防治等方面。查阅文献可知，目前已经鉴定的马铃薯疮痂病原菌种类有S.scabies、S.acidiscabies、S.turigidiscabies等26种。据有关资料报道，对马铃薯疮痂病病原菌有一定抑制作用的拮抗菌株主要有：简单芽孢杆菌、卡氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、棉铃虫拟青霉菌、棘孢木霉、桔假丝酵母菌等，但并不是拮抗菌株都对所有的疮痂链霉菌具有抑制活性。对于马铃薯疮痂病生防资源而言，生防资源较为匮乏，主要以芽孢杆菌为主，抑菌谱单一，抑菌作用不明显，加之疮痂病原菌种类繁多，组成复杂，这给马铃薯疮痂病的防治带来了挑战。因此，需要筛选更多对多种疮痂链霉菌具有良好抑制效果的生防菌。

马铃薯晚疫病(Potato Late Blight)是由卵菌纲致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)de Bary]引起的一种毁灭性病害，晚疫病菌能够侵染马铃薯全株，叶、叶柄、茎及块茎均能被危害。生理小种也被称为致病型，是晚疫病菌重要的表现型之一，其组成与变异直接关系到马铃薯晚疫病的发生与流行。随着国内外学者对晚疫病菌生理小种的深入研究，越来越多的生理小种类型被鉴定出来，世界各国的生理小种组成趋于复杂化，生理小种类型由单基因小种向多基因小种发展，优势小种的毒力基因组成日趋复杂，这必将导致马铃薯品种对晚疫病抗性的下降，加大了马铃薯晚疫病的防治难度。目前在国内外对马铃薯晚疫病的防治措施中，化学防治仍然占据重要地位。在晚疫病流行期，化学防治是目前控制马铃薯晚疫病流行的主要措施，以喷施甲霜灵类、烯酰吗啉、霜霉威氟吡菌胺等药剂并结合使用预警系统的方式指导马铃薯晚疫病的防控，可收到很好的防病增产的效果。虽然化学防治是预防马铃薯病害的有效手段，也是最广泛采用的措施之一，但是长期频繁使用化学药剂容易污染环境，致使农产品农药残留超标；同时也会导致病原菌对化学药剂产生耐药性甚至抗药性，使晚疫病防治效果下降，甚至完全失效。采用生物防治植物病害是利用自然界中原本存在的有益微生物对靶标病原微生物的拮抗作用，来控制病原微生物的危害，具有较小的环境风险，是一种与环境友好的防治技术。随着人们对食品安全、生态安全的重视，生物防治已经成为实现现代农业可持续发展的重要策略之一，利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。因此，需要筛选对多个晚疫病菌生理小种具有良好抑制活性的拮抗菌株，对于马铃薯晚疫病的生物防治具有重要意义。

发明内容

本发明旨在提供一株可显著抑制多种疮痂链霉菌和多个晚疫病菌生理小种生长的拮抗菌株，能有效防治马铃薯疮痂病和晚疫病。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌1X1Y(Bacillus velezensis 1X1Y)，目前保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(China CenterFor Type CultureCollection,CCTCC))，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2022139，保藏日期为2022年02月21日。

本发明提供了该拮抗菌株1X1Y在防治植物病害中的应用；植物病害为马铃薯的晚疫病或疮痂病。

本发明提供了该拮抗菌株1X1Y在制备植物病害或病原菌抑制剂中的应用；病原菌为疮痂链霉菌或致病疫霉菌；所述植物病害为马铃薯的晚疫病或疮痂病。

本发明还提供了一种病原菌抑制剂，包含该拮抗菌株1X1Y和/或拮抗菌株1X1Y的菌液或发酵液。

本发明的有益效果：

本发明从马铃薯疮痂病发病较重的田块中健康植株的根际土壤中取样分离拮抗菌株，通过平板对峙法和纸片法筛选拮抗菌株并验证其抑制活性，主要从形态学、生理生化和分子生物学的角度对所获拮抗菌株进行种类鉴定，旨在为马铃薯疮痂病和晚疫病的防治提供新的生防资源。该拮抗菌株1X1Y可显著抑制多种疮痂链霉菌和致病疫霉菌生长，能有效防治马铃薯疮痂病和晚疫病。

附图说明

图1是菌株1X1Y对马铃薯疮痂链霉菌的抑制效果-平板对峙试验；a：S.turigidiscabies在OMA培养基上的生长状况；b：菌株1X1Y与S.turigidiscabies的对峙培养试验；c：S.acidiscabies在OMA培养基上的生长状况；d：菌株1X1Y与S.acidiscabies的对峙培养试验；

图2是菌株1X1Y对马铃薯晚疫病病菌的抑制效果-平板对峙试验；

图3是菌株1X1Y基于16SrDNA序列构建的系统发育进化树；

图4是菌株1X1Y在NA培养基上的菌落形态；

图5是菌株1X1Y的生理生化测定-糖酵解试验；从左往右依次为葡萄糖糖酵解对照、菌株1X1Y葡萄糖酵解、乳糖糖酵解对照、菌株1X1Y乳糖糖酵解；

图6是菌株1X1Y的生理生化测定-大分子物质的水解试验；a：对照；b：菌株1X1Y；

图7是菌株1X1Y的生理生化测定-IMViC试验；a：对照；b：菌株1X1Y。

图8是菌株1X1Y菌悬液和发酵液对马铃薯疮痂病链霉菌S.acidiscabies的抑制效果；a：菌悬液；b：发酵液；

图9是菌株1X1Y菌悬液和发酵液对马铃薯疮痂病链霉菌S.turigidiscabies的抑制效果；a：菌悬液；b：发酵液；

图10是菌株1X1Y菌体对多个晚疫病菌生理小种生长的抑制效果；

图11是菌株1X1Y发酵液对多个晚疫病菌生理小种生长的抑制效果；a：CK1；b：CK2；C：菌株1X1Y发酵液。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例1：拮抗菌株1X1Y的分离与纯化

1.土样采集

从云南的马铃薯疮痂病发病田块中采集健康植株及其周围土壤，采用抖落法收集健康植株的根际土壤，用无菌自封袋密封好后带回实验室，保存于4℃冰箱，用于拮抗菌株的分离。

2.供试靶标病原微生物

2株马铃薯疮痂链霉菌(S.acidiscabies、S.turigidiscabies)，3株马铃薯晚疫病菌(P.infestans)，菌株编号及生理小种类型分别为SNK-Q9(1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11)、DQ-1(1.2.3.4.5.10)、ML-S13-418(1.2.4.5.6.10)，上述菌株均由云南农业大学植物保护学院马铃薯病害研究室提供。

3.供试培养基

马铃薯疮痂链霉菌扩繁培养和对峙培养分别采用高氏一号培养基和燕麦琼脂培养基，细菌培养采用Luria-Bertani培养基。马铃薯晚疫病菌扩繁培养和对峙培养均采用黑麦番茄培养基。具体培养基配方如下：

高氏一号培养基：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂条20g、水1000ml，pH7.2-7.4；

燕麦琼脂培养基(OMA)：20g燕麦片、20g琼脂条、水1000ml，pH7.2-7.4；

Luria-Bertani培养基(LB)：5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g氯化钠、去离子水1000ml，20g琼脂条，pH7.4；

黑麦番茄培养基：750ml黑麦汁、150ml番茄汁、水100ml、0.6g碳酸钙、17g琼脂条，自然pH；

4.拮抗菌株1X1Y的分离和纯化

将10g根际土样、90ml无菌水和少许无菌玻璃珠倒入到300ml无菌三角锥形瓶中，置于震荡培养箱中，于28℃、150rpm条件下震荡培养20min，室温静置20min，制成土壤菌悬液；将土壤菌悬液稀释10000倍后，吸取100μl稀释液均匀涂抹于含有疮痂链霉菌菌液的培养基平板上，封口膜密封后，写好标记，将平板放置于28℃微生物培养箱后培养5天，观察培养平板中是否有抑菌圈出现，挑取具有抑制活性的菌株进行划线分离纯化为单菌落，纯化3次后，无菌竹签挑取纯化菌株于含有70％无菌甘油的冻存管中，-80℃超低温冰箱保存备用。

5.OMA培养基的制备：按照上述培养基配方称取各物质后，将燕麦片放入400ml水中浸泡30min，剪刀将20g琼脂条剪碎并倒入凉水中将其加热煮化，利用果汁机将燕麦片打碎后倒入锅中和水琼脂均匀混合，加水定容至1000ml，待培养基冷却后，1mol/L氢氧化钠溶液调节培养基pH为7.2-7.4，分装于2个1000ml三角瓶中，每瓶500ml，密封好后放入高压灭菌锅中于121℃灭菌20min，待气压降至0Mpa时，再灭菌一次，将培养基倒入90mm培养平板，超净工作台冷却吹干备用。

6.链霉菌菌悬液的制备：吸取100μl本实验室保存的链霉菌菌株菌悬液于高氏一号培养基平板上进行活化，待高氏一号培养基平板表面完全布满链霉菌时，于超净工作台上往长满链霉菌的培养皿中加入2ml无菌水，利用无菌刮铲将链霉菌从培养基表面轻轻刮下，1ml移液枪吸取皿内液体冲刷培养基表面2-3次，将皿内液体转移至5ml无菌离心管中，放置震荡混匀器中震荡120s后方可制成链霉菌菌悬液。

7.拮抗菌株的筛选

采用平板对峙培养法初步测定菌株1X1Y对疮痂链霉菌的抑制作用。具体操作方法为采用三点接种法挑取菌株1X1Y菌体接种于涂有疮痂链霉菌菌悬液的OMA培养基平板表面，封口膜密封后放置于28℃培养箱中暗培养7天，以只接种疮痂链霉菌菌悬液的OMA平板为对照，培养时间截止时，根据培养基平板是否出现抑菌圈及抑菌圈大小来筛选出抑菌效果较好的菌株；结果表明，对照培养基中2种疮痂链霉菌均能够在OMA培养基中正常生长并能布满整个培养基表面，没有出现抑菌圈；而接种1X1Y菌株的培养基表面均出现了抑菌圈，说明菌株1X1Y均能抑制疮痂链霉菌S.turigidiscabies、S.acidiscabies的生长，对2种疮痂链霉菌具有抑制性(图1)。

采用平板对峙培养法测定菌株1X1Y对致病疫霉菌的拮抗作用，使用5mm无菌打孔器分别在长满含有致病疫霉菌菌丝的黑麦番茄培养基平板和单独的黑麦番茄培养基平板上进行打孔，将含有致病疫霉菌丝的菌饼倒扣于黑麦培养基平板中央的小孔内，将菌株1X1Y的菌体挑至含有致病疫霉菌菌饼的黑麦番茄培养基平板上，放置于20℃微生物培养箱中暗培养10天，培养结束时，观察致病疫霉菌生长状况，根据疫霉菌是否能够长满整个培养基表面来判断致病疫霉菌生长是否受到抑制，之后采用称重法测定菌丝重量。结果显示，对照培养基中致病疫霉均能够正常生长并能长满整个黑麦番茄培养基平板，菌丝重量为0.1033g，而接种有菌株1X1Y菌体的致病疫霉菌丝重量为0.0641g，与对照相比均有显著性差异(P<0.05)，说明菌株1X1Y对致病疫霉菌生长具有显著的抑制作用(表1、图2)。

表1菌株1X1Y对马铃薯晚疫病病菌的抑制效果

注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性

综上所述，根据平板对峙培养的结果，获得了一株对马铃薯疮痂链霉菌和致病疫霉菌生长有抑制作用的菌株，将其命名为1X1Y。

实施例2：拮抗菌株1X1Y的分子生物学鉴定

1.细菌基因组DNA的提取

将实施例1制备并挑取纯化培养的菌株1X1Y单菌落接种于LB培养基平板上进行扩繁，28℃暗培养120小时后将其制成菌悬液，吸取200μl菌悬液于LB液体培养基中进行过夜培养。培养结束后采用上海生工细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取菌株1X1Y的基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取1ml过夜培养的细菌菌液，加入到1.5ml无菌离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入180μl 20mg/ml溶菌酶溶液重悬菌液，37℃水浴30-60min，再加入400μl的Buffer Digestion溶液，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。水浴后加入20μl的10mg/ml RNaseA溶液，室温放置2-5min。

(2)加入200μl的BufferPB，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。(若上清液浑浊，可加入等体积氯仿混匀，12000rpm离心取上清。)

(3)室温10000rpm离心5min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中。

(4)加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使其充分混匀，室温放置2-3min。室温10000rpm离心5min弃上清。

(5)加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1-3min，10000rpm离心2min，弃上清。

(6)重复步骤5一次。

(7)开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。

(8)得到的DNA用50-100μl的TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2.16SrDNA序列的扩增

以菌株1X1Y基因组DNA为模板，使用细菌通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增菌株1X1Y的16SrDNA。PCR扩增条件为预变性94℃/4min，变性94℃/45s，退火55℃/45s，延伸72℃/1min，循环30次，最后延伸72℃/10min，4℃/∞。PCR反应体系如下：

表2 PCR反应体系

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明能够获得一条明亮的条带，获得大约1500bp左右的扩增产物，电泳条带回收后再使用上述引物对上述扩增基因片段进行测序，测序工作交由上海生工生物工程有限公司完成，测得该菌株的16SrDNA的核苷酸序列长度为1444bp，16SrDNA基因测序结果如下：TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA

将测序结果输入至美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中，使用BLAST软件在GenBank中与其他的16SrDNA序列进行同源性比较，结果显示菌株1X1Y的16SrDNA序列与贝莱斯芽孢杆菌的多个菌株的16SrDNA序列完全吻合。选择相近的序列与菌株1X1Y的序列，使用系统分化分析软件MEGA7.0以邻接法(Neighbor-Joining Method)构建系统发育进化树(图3)，结果显示菌株1X1Y与贝莱斯芽孢杆菌聚(Bacillus velezensis MF 565847.1)在同一系统进化分支，进化关系最近，同源性达到99％以上，初步判断该菌株1X1Y为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

实施例3：拮抗菌株1X1Y形态学鉴定

挑取分离纯化的菌株1X1Y单菌落划线于NA培养基上培养48小时，观察菌落的形态特征，菌株1X1Y在NA培养基上生长良好，其单菌落形态为圆形、近圆形或椭圆形，不透明，周围无色素产生，菌落颜色为乳白色或微黄色，培养初期菌落表面光滑，边缘湿润整齐，后期表面粗糙有褶皱，边缘不整齐，向四周呈云雾状扩散，菌落中央有凸起。挑取时表面有较薄皮层，内部湿润有粘液。革兰氏染色呈阳性，菌体呈杆状，伴有芽孢(图4)。

实施例4：拮抗菌株1X1Y生理生化测定结果

参见《常见细菌系统鉴定手册》对其菌体进行糖类发酵、明胶液化试验、硫化氢产生试验、淀粉水解试验、甲基红试验、VP试验、吲哚产生试验、牛奶石蕊试验、柠檬酸盐利用试验、脲酶产生试验等生理生化指标的测定。结果表明菌株1X1Y可分解葡萄糖产酸、产生明胶酶分解明胶、可利用柠檬酸盐，使淀粉水解，可产生脲酶分解尿素，VP试验、牛奶石蕊试验结果为阳性；菌株1X1Y不降解乳糖，不产生硫化氢气体，甲基红试验、吲哚产生试验结果均为阴性(见表3、图5-图7)。

表3拮抗菌株1X1Y的生理生化特征

注：表中“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

综上所述，根据菌株1X1Y 16SrDNA序列分析、形态特征、生理生化特性，结合《常见细菌系统鉴定手册》判断该菌株1X1Y属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，且该菌株对多种马铃薯疮痂链霉菌和致病疫霉菌具有显著的抑制作用，可有效防治马铃薯疮痂病和晚疫病。

实施例5：拮抗菌株1X1Y菌悬液和发酵液对马铃薯疮痂链霉菌生长的影响

1.材料与方法

供试材料：

供试菌株：S.acidiscabies、S.turigidiscabies；

其他材料：18mm和22mm定性圆形滤纸片、金属涂布棒、90mm培养皿、封口膜、移液枪、离心管、无菌水、果汁机、金属刮铲、金属镊子、数显式游标卡尺；

试验方法：

OMA培养基和链霉菌菌悬液的制备方法同实施例1。

拮抗菌株菌悬液的制备：无菌枪头挑取已经纯化的拮抗菌株1X1Y于含有5ml无菌水的10ml无菌离心管中，使用震荡混匀器涡旋震荡120s后备用。

拮抗菌株发酵液的制备：以牛肉膏蛋白胨液体培养基为发酵培养基，吸取1ml拮抗菌株1X1Y菌悬液加入到含有150ml液体培养基的锥形瓶中，放置震荡培养箱中于28℃、150rpm黑暗条件下发酵培养7d，培养结束后方可获得拮抗菌株1X1Y发酵液。

采用纸片法开展拮抗菌株1X1Y菌悬液和发酵液对疮痂链霉菌生长的影响试验，具体步骤为吸取100μl链霉菌菌悬液于OMA培养基平板，使用无菌金属涂布棒将其涂抹均匀，无菌镊子夹取无菌滤纸片将其放置于培养平板中央，并沿周边轻按滤纸片，使其紧贴于培养基表面，移液枪分别吸取50μl、100μl菌株1X1Y菌悬液和发酵液，缓慢释放于滤纸片，待纸片表面晾干后，封口膜密封后将其放置微生物培养箱，28℃暗培养5天，以在涂有疮痂链霉菌菌悬液的OMA培养基平板上接种无菌水和放置滤纸片作为对照，培养时间截止后，采用十字交叉测量法测定抑菌圈直径。

2.结果与分析

2.1菌株1X1Y对马铃薯疮痂病原菌S.acidiscabies生长的影响

采用抑菌圈法再次检测菌株1X1Y对疮痂链霉菌S.acidiscabies的抑制性。结果表明：测定结果为空白对照(CK1)和纸片对照(CK2、CK3)均能长满培养基表面，没有出现抑菌圈，说明滤纸片不会影响疮痂链霉菌S.acidiscabies的正常生长。加入待测菌株1X1Y菌悬液的培养基表面出现了抑菌圈，抑菌圈直径分别为28.63mm、35.53mm，且与对照(0mm)相比均有显著性差异(p<0.05)，说明菌株1X1Y能够显著抑制疮痂病原菌S.acidiscabies的生长；加入菌株1X1Y发酵液的培养基表面也出现了抑菌圈，抑菌圈直径分别为28.91mm、35.40mm，且与对照(0mm)相比均有显著性差异(p<0.05)，说明菌株1X1Y发酵液能够显著抑制疮痂病原菌S.acidiscabies的生长(图8)。

表4菌株1X1Y对马铃薯疮痂病原菌S.acidiscabies生长的影响

注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性

2.2菌株1X1Y对马铃薯疮痂病原菌S.turigidiscabies生长的影响

采用抑菌圈法再次检测菌株1X1Y对疮痂链霉菌S.turigidiscabies的抑制性。结果表明：测定结果为空白对照(CK1)和纸片对照(CK2、CK3)均能长满培养基表面，没有出现抑菌圈，说明滤纸片不会影响疮痂链霉菌S.turigidiscabies的正常生长。加入待测菌株1X1Y菌悬液的培养基表面出现了抑菌圈，抑菌圈直径分别为25.86mm、31.40mm，且与对照(0mm)相比均有显著性差异(p<0.05)，说明菌株1X1Y能够显著抑制疮痂病原菌S.turigidiscabies的生长；加入菌株1X1Y发酵液的培养基表面也出现了抑菌圈，抑菌圈直径分别为29.30mm、34.35mm，且与对照(0mm)相比均有显著性差异(p<0.05)，说明菌株1X1Y发酵液能够显著抑制疮痂病原菌S.turigidiscabies的生长(图9)。

综上，菌株1X1Y的菌悬液和发酵液均对疮痂链霉菌S.acidiscabies和S.turigidiscabies的生长具有良好的抑制活性。

表5菌株1X1Y对马铃薯疮痂病原菌S.turigidiscabies生长的影响

注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性

实施例6：拮抗菌株1X1Y对多种马铃薯致病疫霉菌生长的影响

1.材料与方法

供试致病疫霉菌菌株编号及生理小种类型：SNK-Q9(1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11)、DQ-1(1.2.3.4.5.10)、ML-S13-418(1.2.4.5.6.10)。

其他材料：牛津杯、耙式竹签、5mm打孔器、90mm培养皿、封口膜、万分之一天平。

试验方法:

黑麦番茄培养基制备方法同实施例1。菌株1X1Y发酵液制备方法同实施例5。

采用平板对峙培养法测定菌株1X1Y对致病疫霉菌的拮抗作用。具体操作方法为：使用无菌打孔器分别在长满含有致病疫霉菌菌丝的黑麦番茄培养基平板和单独的黑麦番茄培养基平板上进行打孔，将含有致病疫霉菌丝的菌饼倒扣于黑麦培养基平板中央的小孔内，将待测菌株的菌体挑至含有致病疫霉菌菌饼的黑麦番茄培养基平板上，放置于20℃微生物培养箱中暗培养7-10天，培养结束时，采用耙式竹签将培养皿中的致病疫霉菌菌丝从黑麦番茄培养基表面剥离，放置万分之一天平进行称重，以菌丝重量作为衡量菌丝生长的指标。

采用牛津杯法评价菌株1X1Y发酵液对致病疫霉菌菌丝生长的影响。具体操作步骤为使用无菌打孔器分别在长满含有致病疫霉菌菌丝的黑麦番茄培养基平板和单独的黑麦番茄培养基平板上进行打孔，将含有致病疫霉菌丝的菌饼倒扣于黑麦培养基平板中央的小孔内，无菌镊子夹取无菌牛津杯放置于黑麦培养基平板中央两侧3厘米处，垂直插入黑麦培养基中，挤压固定好牛津杯，移液枪吸取70μl菌株1X1Y发酵液加至牛津杯中，待牛津杯中发酵液晾干后，封口膜密封后放置于20℃微生物培养箱中暗培养7-10天，培养结束时，采用耙式竹签将培养皿中的致病疫霉菌菌丝从黑麦番茄培养基表面剥离，放置万分之一天平进行称重，以菌丝重量作为衡量菌丝生长的指标。

2.结果与分析

测定在菌株1X1Y胁迫下ML-S13-418、DQ-1、SNK-Q93个致病疫霉菌菌丝的重量。结果表明，对照培养中3个菌株均能够正常生长，菌丝重量分别为0.0241g、0.0374g、0.1037g，而接种有菌株1X1Y的培养基中，ML-S13-418、DQ-1、SNK-Q9菌丝重量均显著低于对照(p<0.05)，说明在菌株1X1Y的胁迫下，菌丝生长均受到了显著抑制，且随着1X1Y接种量的增加，菌丝生长抑制愈加明显(图10)。

表6菌株1X1Y对马铃薯晚疫病病菌菌丝生长量的影响

注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性

利用牛津杯法测定菌株1X1Y发酵液对致病疫霉菌ML-S13-418、DQ-1、SNK-Q9菌丝生长的影响。结果表明，空白对照培养皿(CK1)中3个菌株均能够正常生长，菌丝重量分别为0.0218g、0.0384g、0.1533g，牛津杯对照(CK2)中个菌株均能够正常生长，菌丝重量分别为0.0220g、0.0387g、0.1516g，与空白对照相比，菌丝重量没有显著性差异(p>0.05)，说明牛津杯对致病疫霉菌菌丝生长没有影响；而接种有菌株1X1Y发酵液的培养基中，ML-S13-418、DQ-1、SNK-Q9菌丝重量均显著低于对照(p<0.05)，说明在菌株1X1Y发酵液能够显著抑制致病疫霉菌的生长(图11)。

表7菌株1X1Y发酵液对马铃薯晚疫病病菌菌丝生长量的影响

注：表中小写字母表示0.05水平下的差异显著性

综上，菌株1X1Y菌悬液和发酵液均显著抑制多种疮痂链霉菌和致病疫霉菌的生长，为马铃薯疮痂病和晚疫病的生物防治提供了优良的微生物资源。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 拮抗菌株1X1Y及其应用

<130> 2022.01.22

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt 60

gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120

ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac 180

ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240

aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300

gggactgaga cacggcccag actctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 360

cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg 420

ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga 480

aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540

gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg 600

ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat 660

tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc 720

tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 780

tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840

tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 900

gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960

aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg 1020

cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080

ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga 1140

ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200

ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc 1260

caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg 1320

gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380

accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga 1440

gcca 1444

Claims (6)

1.拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌1X1Y Bacillus velezensis 1X1Y，其特征在于：保藏号为CCTCC M 2022139。

2.权利要求1所述的拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌1X1Y Bacillus velezensis 1X1Y在防治马铃薯病害中的应用。

3.权利要求1所述的拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌1X1Y Bacillus velezensis 1X1Y在制备马铃薯病害或病原菌抑制剂中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述病原菌为疮痂链霉菌或致病疫霉菌。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述马铃薯病害为马铃薯的晚疫病或疮痂病。

6.一种病原菌抑制剂，其特征在于：包含权利要求1所述的拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌1X1Y Bacillus velezensis 1X1Y和/或拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌1X1Y Bacillusvelezensis 1X1Y的菌悬液或发酵液。

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