CN115851483A - 湿地链霉菌菌株及其发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株湿地链霉菌在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，属于农作物病害抗性治理的生物防治技术领域。生防菌株13‑3，命名为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22830。该菌株对抗苯醚甲环唑类杀菌剂的大豆炭疽病菌具有非常好的拮抗作用，其发酵液可以显著抑制抗苯醚甲环唑类杀菌剂的大豆炭疽病菌菌丝生长和分生孢子的萌发，对由抗苯醚甲环唑类杀菌剂的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病具有优良的防治效果。
Description
技术领域
本发明涉及农作物病害抗性治理的生物防治技术领域，具体为湿地链霉菌菌株及其发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用。
背景技术
大豆是一种重要粮食、油料作物，是全球食物链的重要组成部分。2019年农业农村部发布了《大豆振兴计划实施方案》，将扩大大豆种植面积，力争到2022年达到1.5亿亩。大豆炭疽病是大豆生产上的重要真菌病害之一，在世界范围内普遍发生，轻者减产，重者绝收。
目前，使用化学药剂是控制大豆炭疽病的主要手段。苯醚甲环唑是使用最广泛的三唑类杀菌剂(DMIs)之一，其通过杂环上的氮原子与羊毛甾醇14α脱甲基酶的血红素-铁活性中心结合，抑制14α脱甲基酶的活性，从而阻碍麦角甾醇的合成，最终起到杀菌的作用，对大多数子囊菌、担子菌和半知菌引起的病害均有防治效果，不仅具有高效、低毒和持续时间长的优点，还有良好的内吸性，对病害具有保护和治疗的作用。但近几十年来随着该类杀菌剂被大量推广应用，田间许多重要的靶标病原菌已逐渐对其产生了不同程度的抗药性。据报道，葡萄胶孢炭疽菌和草莓胶孢炭疽菌在田间已出现低抗苯醚甲环唑的亚群体。
农用抗生素是微生物代谢过程中产生的，在低浓度下即可用于防治植物病害、草害、虫害和抗病毒的生防制剂。因此，寻找广谱、高效、低毒及不易产生抗药性的农用抗生素一直都是研究热点。从嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophilavar.pekingensis)CB6菌株的代谢产物中提取分离的活性物质Xenocoumacin 1(Xcn1)，对棉铃疫病菌、瓜类疫病菌、马铃薯晚疫病菌、辣椒疫病菌及宝珠梨疫病菌5种病原菌有明显的抑制效果，EC50在0.25至4.17μg/mL之间。浓度为1.5μg/mL时，Xcn1不仅能100％抑制马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans菌丝的生长，而且能够抑制孢子囊的产生。浓度为12.0、6.0μg/L时，对马铃薯离体叶片感染晚疫病的抑制率分别高达100％、92.63％。盆栽试验，浓度为6.0和3.0μg/L时，对晚疫病的抑制率分别高达80.27％、70.53％，稍逊于化学杀菌剂甲霜灵。Xcn1有望成为控制马铃薯晚疫病新型的生物杀菌剂。
农用抗生素作为生物农药的重要分支，具有高效、易分解、无残留及与环境相容性等优点，应加大对其的研究，这样才能提高我国生物农药产业的整体技术水平，增强我国农副产品的国际竞争力，为我国农业的可持续发展继续做出贡献。
发明内容
本发明的首要目的在于针对大豆炭疽病发生严重，阻碍大豆产业发展，杀菌剂大量使用造成环境污染和病原菌抗药性等问题，提供湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用。
本发明的另一目的在于提供湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，所述菌株为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22830，保藏日期：2021年7月6日；所述湿地链霉菌(Streptomycespaludis)菌株13-3对抗三唑类杀菌剂的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，所述发酵液为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗三唑类杀菌剂大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液制备方法如下：将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3接种于ISP2固体培养基，发酵温度为26-28℃，发酵培养时间7-8天，采用乙酸乙酯萃取，提取液减压浓缩蒸干后用DMSO溶解，得发酵液。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的菌丝生长有抑制作用。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的孢子萌发有抑制作用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗苯醚甲环唑类(DMIs)杀菌剂的大豆炭疽病菌具有拮抗作用，其发酵液可以显著抑制抗苯醚甲环唑类(DMIs)杀菌剂的大豆炭疽病菌的孢子萌发和菌丝生长，且发酵液对由抗苯醚甲环唑类(DMIs)杀菌剂的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病的防治效果好，可用于抗性治理，这对降低化学杀菌剂的使用，降低农药污染具有重要的意义。
此外，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3是从土壤中获得的，与土壤环境和谐相容，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3在高氏一号培养基上的培养特征。
图2为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3与抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的对峙培养。注：A为抗性菌株RR1，B为抗性菌株RR2，CK为对照组。
图3为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的菌丝生长的抑制效果。注：A为抗性菌株RR1，B为抗性菌株RR2，CK为对照组。
图4为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的孢子萌发的抑制效果。注：A为菌株13-3发酵液处理后的抗性菌株RR1分生孢子的萌发，B为菌株13-3发酵液处理后的抗性菌株RR2分生孢子的萌发，CK为对照组。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例一：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的分离及鉴定。
1、土壤样品的采集
从江西井冈山采集土样3份，去除表面的土壤，采集5-20cm深处的土样，标记后带回实验室自然风干。
2、放线菌的分离
采用平板稀释法进行分离。将风干土样用研钵磨碎，称取样品1g悬浮于9mL无菌水中，于40℃、180rpm震荡30min后静置5min，依次稀释10倍，分别配制成10-2、10-3、10-4的悬浮液，分别吸取不同浓度的悬浮液各0.1mL加入到改良的HVA培养基(加入终浓度为100-200ppm的重铬酸钾)平板上，均匀涂布后倒置于28℃培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化，纯化后的菌株采用甘油法保藏于-80℃冰箱。
3、湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的鉴定
(1)形态特征观察
湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3在多数培养基上生长良好，都不产可溶性色素(表1)。光学显微镜下菌株13-3孢子丝直、柔曲、钩状、松敞及紧密螺旋形，孢子椭圆形、柱形。
表1湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3的培养特征
(2)生理生化特征
参照《链霉菌鉴定手册》中所述的方法测定湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3淀粉水解、硝酸盐还原及碳、氮源的利用等特性，结果见表2。
表2菌株13-3的生理生化特征
(3)序列分析
细菌基因组提取试剂盒提取湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3基因组DNA后，分别进行16S rRNA和rpoB基因扩增，得到的序列全长分别为1410bp和767bp，将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST比对，经形态特征、生理生化特征及16S rRNA和rpoB基因分析得出菌株13-3为湿地链霉菌。
实施例二：抗性突变体的诱导及遗传稳定性
将大豆炭疽病菌在PDA培养基上28℃恒温培养5天，从菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，接种于含有苯醚甲环唑(DMIs类杀菌剂)(EC90)的PDA平板上28℃恒温培养，待长出扇形突变后，转接至PDA平板上，28℃恒温培养5天，打取菌碟转接至下一浓度继续诱导突变体，转接浓度成倍递增，直至在含药1000μg/mL PDA平板上长出菌落为止，测定突变体的EC50值，并按下列公式计算抗性倍数，根据抗性倍数将各突变体的抗性水平划分为敏感、低抗、中抗和高抗，其中：抗性倍数≤3的为敏感菌株(S)；3<抗性倍数≤10的为低抗菌株(LR)；10<抗性倍数≤100的为中抗菌株(MR)；100<抗性倍数的为高抗菌株(HR)。抗性倍数＝抗性突变体EC50值/亲本敏感菌株EC50值
将抗性突变体和敏感菌株在不含药剂的PDA平板上继代培养8代，采用菌丝生长速率法分别测定第1代、第4代及第8代菌株对苯醚甲环唑的EC50值。按以下公式计算突变体抗药性变化系数，分析突变体的遗传稳定性。
抗药性变化系数＝抗性突变体第8代抗性倍数/抗性突变体第1代抗性倍数。
表3抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的抗性倍数及抗性稳定性
注：*S12为敏感菌株，其余菌株为抗性突变体。
结果表明，以大豆炭疽病菌S12为亲本菌株，通过室内药剂驯化获得2株抗性突变体，抗性倍数为3.41-6.12，均为低抗菌株。抗性突变体经过继代培养，第4代和第8代的抗性倍数分别为3.43-6.24和3.35-6.00，抗药性系数变化为0.98，表明抗性突变体对苯醚甲环唑的抗性能稳定遗传。
实施例三：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的拮抗测定
采用平板对峙培养法，将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗性菌株RR1和RR2进行拮抗测定。首先在PDA培养基靠边缘两侧划线接种湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3，3天后在平板中央接入直径5mm供试病原菌菌饼，28℃下培养6天测量湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对供试病原菌的抑菌带宽度(表4)，以不接拮抗菌的供试病原菌为对照。结果表明，湿地链霉菌(Streptomycespaludis)菌株13-3对抗性菌株RR1和RR2均具有非常强的拮抗作用(图2)。
表4菌株13-3对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的拮抗作用
实施例四：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的菌丝生长的抑制作用
将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3于高氏一号培养基活化，28℃恒温培养5天，将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的孢子接入ISP2固体培养基中，发酵温度为26-28℃，发酵时间7-8天，采用乙酸乙酯萃取3次，提取液减压浓缩蒸干后用DMSO溶解，制成20mg/mL的发酵液，备用。
取湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液100μL加入到100mLPDA培养基中，混匀后倒入培养皿中，将直径5mm供试病原菌菌饼接入PDA培养基平板中央，置于28℃下培养7天后测量菌落直径。以加入相同量的DMSO为对照，计算发酵液对抗性菌株RR1和RR2菌丝生长的抑制率(表5)。结果表明湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对抗性菌株RR1和RR2的菌丝生长均具有非常强的抑制效果(图3)。
表5菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的菌丝生长的抑制作用
实施例五：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的孢子萌发的抑制作用
将直径5mm供试病原菌菌饼接入PDB液体培养基中，于28℃、180rpm震荡培养7天后，过滤收集孢子悬浮液，并将其浓度调至1×105个/mL。取实施例四中的湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液1μL加入到1mL的孢子悬浮液中，以加入相同量的DMSO为对照，抗性菌株RR1和RR2的孢子悬浮液置于28℃下分别培养5h和9h后，计算湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对抗性菌株RR1和RR2孢子萌发的抑制率(表6)。结果表明，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液完全抑制抗性菌株RR1和RR2的孢子萌发(图4)。
表6菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的孢子萌发的抑制作用
实施例六：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液在防治由抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病(抗性治理)中的应用。
将抗性菌株RR1和RR2分别于28℃培养5天，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，将菌饼转入PDB液体培养基中，于150r/min、28℃黑暗振荡培养10天，用血球计数板检测分生孢子浓度，制成浓度为1×105个孢子/mL的混合孢子悬浮液，备用。
试验地点选择在福建省福州市晋安区埔党村，试验设置3个处理，分别为：A.10％苯醚甲环唑WG1500倍液、B.湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液、C.清水对照。每处理4次重复，共计12个小区，随机区组排列，每小区20m2，按每亩用水量45升喷雾。于大豆(毛豆3号)初荚后分别喷雾施药，喷雾施药24h后接种上述制备的混合孢子悬浮液(加入0.1％的吐温80)于豆荚上，每株植株喷50mL。覆膜保湿2天后打开薄膜两端通风，接种3–5天后移去薄膜。接菌10–15天后调查发病情况。
调查方法：每小区按照对角线五点取样，每点调查相连的3株大豆，每小区调查15株大豆的所有豆荚，记录总荚数、发病荚数，按照以下分级标准统计病情指数：
0级：豆荚无病斑；
1级：豆荚上有褐点型小病斑，病斑面积占整个豆荚面积的5％以下；
3级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的6％～10％；
5级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的11％～25％；
7级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的26％～50％；
9级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的50％以上；
病情指数＝∑(各级病荚数×相对病级数值)÷(调查总荚数×9)×100；
防治效果(％)＝[(CK病情指数-处理病情指数)÷CK病情指数]×100；
表7菌株13-3的发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病的防治效果
实验结果表明，A.10％苯醚甲环唑WG1500倍液、B.湿地链霉菌(Streptomycespaludis)菌株13-3的发酵液对由抗苯醚甲环唑的大豆炭疽菌引起的大豆炭疽病的防治效果分别为61.71％和67.08％，对大豆安全，未见药害。湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对由抗苯醚甲环唑的大豆炭疽菌引起的大豆炭疽病的防效与10％苯醚甲环唑WG1500倍液防效在5％显著水平上达显著水平。
由此可见，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对由抗苯醚甲环唑的大豆炭疽菌引起的大豆炭疽病的防治效果优于10％苯醚甲环唑WG1500倍液的防效，具备良好的应用前景。
Claims (7)
1.湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述菌株为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22830，保藏日期：2021年7月6日；
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗三唑类杀菌剂的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
2.根据权利要求1所述的湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
3.湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述发酵液为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗三唑类杀菌剂大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
4.根据权利要求3所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述发酵液为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
5.根据权利要求4所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于，所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液制备方法如下：
将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3接种于ISP2固体培养基，发酵温度为26-28℃，发酵培养时间7-8天，采用乙酸乙酯萃取，提取液减压浓缩蒸干后用DMSO溶解，得发酵液。
6.根据权利要求4所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的菌丝生长有抑制作用。
7.根据权利要求4所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌的孢子萌发有抑制作用。
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