CN116058387A - 湿地链霉菌菌株及其发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株湿地链霉菌在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，属于农作物病害抗性治理的生物防治技术领域。生防菌株13‑3，命名为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22830。该菌株对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌具有拮抗作用，其发酵液可以显著抑制不同抗性水平大豆炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发，且发酵液对由抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病的防治效果好，可用于抗性治理，对降低化学杀菌剂的使用。
Description
技术领域
本发明涉及农作物病害的防治技术领域，具体为湿地链霉菌菌株及其发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用。
背景技术
大豆作为人类植物油和蛋白质来源以及牲畜和水产养殖的饲料来源，在世界农业生产中占有重要地位。大豆炭疽病是世界上大豆产区的重要真菌病害之一，主要危害豆荚、豆秆和幼苗，对我国大豆产业的安全已构成严重威胁。
目前防治大豆炭疽病主要依靠抗病品种和使用杀菌剂，而鲜食大豆中缺乏对炭疽病高抗的品种，杀菌剂仍然是防控大豆炭疽病的主要手段。啶氧菌酯是使用比较广泛的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(QoIs)之一，其通过作用于细胞色素bc1复合物中的线粒体内膜外壁(Qo位点)，抑制氢醌与Qo位点的结合并阻止复合物III中电子从细胞色素b到细胞色素c1的传递，从而抑制病原菌ATP的产生，对叶枯病、叶锈病、颖枯病、褐斑病、白粉病、炭疽病等具有良好的防治效果。由于QoIs类杀菌剂作用位点单一，多种植物病原菌对其产生了抗药性。抗药性问题出现后，农民为提高防效通常加大杀菌剂使用剂量，这对生态环境构成了威胁。因此，生物农药和有益微生物及其代谢产物在植物病害防治中的研究日益受到重视。
放线菌是具有重大使用价值的一类微生物，在商业和医用中使用的抗生素75％由链霉菌产生，在农用抗生素中已获得登记的仅有十余种，且主要用于防治水稻及大田农作物的病害，而用于防治果蔬类重要真菌病害的则很少。近年来利用放线菌产生的抗生素所制备的新农药已逐渐成为无公害农药的主体，活性化合物的筛选和应用也已成为农业微生物领域的研究重点。黄世文等筛选出一株淡紫灰吸水链霉菌对稗苗、稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较好的抑制作用。陶黎明等筛选到一株具有除草活性的淡紫灰链霉菌。谢晨昭研究表明，淡紫灰链霉菌B1菌株对10种植物病原真菌和3种植物病原细菌均有抑制作用，有较广的抑菌谱。
生物防治以其安全、高效及无污染等特点已经成为植物病害防治的重要途径，利用生物防治治理大豆炭疽病菌抗药性值得深入研究。
发明内容
本发明的首要目的在于针对大豆炭疽病发生严重，阻碍大豆产业发展，杀菌剂大量使用造成环境污染和病原菌抗药性等问题，提供湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用。
本发明的另一目的在于提供湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，所述菌株为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.22830，保藏日期：2021年7月6日；
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，所述发酵液为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液制备方法如下：将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3接种于ISP2固体培养基，发酵温度为26-28℃，发酵培养时间7-8天，采用乙酸乙酯萃取，提取液减压浓缩蒸干后用DMSO溶解，得发酵液。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的菌丝生长有抑制作用。
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的孢子萌发有抑制作用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗啶氧菌酯(QoIs)的大豆炭疽病菌具有拮抗作用，其发酵液可以显著抑制不同抗性水平大豆炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发，且发酵液对由抗啶氧菌酯(QoIs)的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病的防治效果好，可用于抗性治理，对降低化学杀菌剂的使用，降低农药污染具有重要的意义。
此外，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3是从土壤中获得的，与土壤环境和谐相容，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3在高氏一号培养基上的培养特征。
图2为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3与抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的对峙培养。注：A为中抗菌株R1，B为中抗菌株R2，C为高抗菌株R3，D为高抗菌株R4，CK为对照组。
图3为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的菌丝生长的抑制效果。注：A为中抗菌株R1，B为中抗菌株R2，C为高抗菌株R3，D为高抗菌株R4，CK为对照组。
图4为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯大豆炭疽病菌的分生孢子萌发的抑制效果。注：A为菌株13-3发酵液处理后的中抗菌株R1分生孢子的萌发，B为菌株13-3发酵液处理后的中抗菌株R2分生孢子的萌发，C为菌株13-3发酵液处理后的高抗菌株R3分生孢子的萌发，D为菌株13-3发酵液处理后的高抗菌株R4分生孢子的萌发，CK为对照组。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例一：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的分离及鉴定。
1、土壤样品的采集
从江西井冈山采集土样3份，去除表面的土壤，采集5-20cm深处的土样，标记后带回实验室自然风干。
2、放线菌的分离
采用平板稀释法进行分离。将风干土样用研钵磨碎，称取样品1g悬浮于9mL无菌水中，于40℃、180rpm震荡30min后静置5min，依次稀释10倍，分别配制成10-2、10-3、10-4的悬浮液，分别吸取不同浓度的悬浮液各0.1mL加入到改良的HVA培养基(加入终浓度为100-200ppm的重铬酸钾)平板上，均匀涂布后倒置于28℃培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化，纯化后的菌株采用甘油法保藏于-80℃冰箱。
3、湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的鉴定
(1)形态特征观察
湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3在多数培养基上生长良好，都不产可溶性色素(表1)。光学显微镜下菌株13-3孢子丝直、柔曲、钩状、松敞及紧密螺旋形，孢子椭圆形、柱形。
表1湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3的培养特征
(2)生理生化特征
参照《链霉菌鉴定手册》中所述的方法测定湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3淀粉水解、硝酸盐还原及碳、氮源的利用等特性，结果见表2。
表2湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3的生理生化特征
(3)序列分析
细菌基因组提取试剂盒提取湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3基因组DNA后，分别进行16S rRNA和rpoB基因扩增，得到的序列全长分别为1410bp和767bp将所得序列提交至GenBank数据库进行BLAST比对，经形态特征、生理生化特征及16S rRNA和rpoB基因分析得出菌株13-3为湿地链霉菌。
实施例二：抗啶氧菌酯突变体的诱导及遗传稳定性。
将大豆炭疽病菌在PDA培养基上28℃恒温培养5天，从菌落边缘打取直径5mm的菌饼，接种于含有啶氧菌酯(QoIs类杀菌剂)(EC90)的PDA平板28℃恒温培养，待长出扇形突变后，转接至PDA平板上，28℃恒温培养7天，打取菌碟转接至下一浓度继续诱导，转接浓度成倍递增，直至在含药1000μg/mL PDA平板上长出菌落为止，测定突变体的EC50值，并按下列公式计算抗性倍数，根据抗性倍数将各突变体的抗性水平划分为敏感、低抗、中抗和高抗，其中：抗性倍数≤3为敏感菌株(S)；3<抗性倍数≤10为低抗菌株(LR)；10<抗性倍数≤100为中抗菌株(MR)；100<抗性倍数为高抗菌株(HR)。抗性倍数＝抗性突变体EC50值/亲本敏感菌株EC50值
将抗性突变体和敏感菌株在不含药剂的PDA平板上继代培养8代，采用菌丝生长速率法分别测定第1代、第4代及第8代菌株对啶氧菌酯的EC50值。按以下公式计算突变体抗药性变化系数，分析突变体的遗传稳定性。
抗药性变化系数＝抗性突变体第8代抗性倍数/抗性突变体第1代抗性倍数
表3抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的抗性倍数及抗性稳定性
注：*S11为敏感菌株，R1和R2为中抗突变体，R3和R4为高抗突变体。
结果表明，以大豆炭疽病菌S11为亲本菌株，通过室内药剂驯化获得的4株抗性突变体，其中R1和R2的抗性倍数为15.79和18.34，为中抗菌株；R3和R4的抗性倍数大于100，为高抗菌株。抗性突变体经过继代培养，抗药性系数变化为1.18-1.20，表明抗性突变体对啶氧菌酯的抗性能稳定遗传。
实施例三：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的拮抗测定。
采用平板对峙培养法，将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4进行拮抗测定。首先在PDA培养基靠边缘两侧划线接种湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3，3天后在平板中央接入直径5mm供试病原菌菌饼，28℃下培养6天测量湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对供试病原菌的抑菌带宽度(表4)，以不接拮抗菌的供试病原菌为对照。结果表明，湿地链霉菌(Streptomycespaludis)菌株13-3对中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4均具有非常强的拮抗作用(图2)。
表4菌株13-3对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的拮抗作用
实施例四：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的抑制作用。
湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3在高氏一号培养基活化，28℃恒温培养5天，将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的孢子接入ISP2固体培养基中，26-28℃发酵7-8天，乙酸乙酯萃取3次，提取液减压浓缩蒸干后用DMSO溶解，制成20mg/mL的发酵液，备用。
取湿地链霉菌(Streptomyces paludis)13-3菌株的发酵液100μL加入到100mLPDA培养基中，混匀后倒入培养皿中，将直径5mm供试病原菌菌饼接入PDA培养基平板中央，置于28℃下培养7天后测量菌落直径。以加入相同量的DMSO为对照，计算发酵液对中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4的菌丝生长的抑制率(表5)。结果表明湿地链霉菌(Streptomycespaludis)菌株13-3的发酵液对中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4的菌丝生长均具有非常强的抑制作用(图3)。
表5菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的菌丝生长的抑制作用
实施例五：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的孢子萌发的抑制作用。
将直径5mm供试病原菌菌饼接入PDB液体培养基中，于28℃、180rpm震荡培养7天后，过滤收集孢子悬浮液，并将其浓度调至1×105个/mL。取实施例四中的湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液1μL加入到1mL的孢子悬浮液中，以加入相同量的DMSO为对照，中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4的孢子悬浮液置于28℃下分别培养4.5h、4.5h、6h和6h后，计算湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4孢子萌发的抑制率(表6)。结果表明，湿地链霉菌(Streptomycespaludis)菌株13-3的发酵液显著抑制中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4的孢子萌发(图4)。
表6菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的孢子萌发的抑制作用
实施例六：湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液在防治由抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病(抗性治理)中的应用。
将中抗菌株R1、R2和高抗菌株R3、R4分别于28℃培养5天，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，将菌饼转入PDB液体培养基中，于150r/min、28℃黑暗振荡培养7天，用血球计数板检测分生孢子浓度，分别制成浓度为1×105个孢子/mL中抗菌株R1和R2混合的孢子悬浮液及高抗菌株R3和R4混合的孢子悬浮液，备用。
试验地点选择在福建省福州市晋安区埔党村，试验设置6个处理。
接种R1和R2混合孢子悬浮液的处理分别为：A.22.5％啶氧菌酯SC1500倍液，B.湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液，C.清水对照。
接种R3和R4混合孢子悬浮液的处理分别为：D.22.5％啶氧菌酯SC1500倍液，E.湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液，F.清水对照。
每处理4次重复，共计24个小区，随机区组排列，每小区20m2，按每亩用水量45升喷雾。于大豆(毛豆3号)初荚后分别喷雾施药，喷雾施药24h后分别接种上述制备中抗菌株及高抗菌株的孢子混合悬浮液(加入0.1％的吐温80)于豆荚上，每株植株喷50mL。覆膜保湿2天后打开薄膜两端通风，接种3–5天后移去薄膜。接菌10–15天后调查发病情况。
调查方法：每小区按照对角线五点取样，每点调查相连的3株大豆，每小区调查15株大豆的所有豆荚，记录总荚数、发病荚数，按照以下分级标准统计病情指数：
0级：豆荚无病斑；
1级：豆荚上有褐点型小病斑，病斑面积占整个豆荚面积的5％以下；
3级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的6％～10％；
5级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的11％～25％；
7级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的26％～50％；
9级：豆荚上出现典型病斑，病斑面积占整个豆荚面积的50％以上；
病情指数＝∑(各级病荚数×相对病级数值)÷(调查总荚数×9)×100；
防治效果(％)＝[(CK病情指数-处理病情指数)÷CK病情指数]×100；
表7 13-3发酵液对由抗啶氧菌酯菌株引起的大豆炭疽病的防治效果
实验结果表明：
A.22.5％啶氧菌酯SC1500倍液、B.湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对由中抗菌株引起的大豆炭疽病的防治效果分别为65.36％和67.43％，对大豆安全，未见药害。湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对由中抗菌株引起的大豆炭疽病的防效与22.5％啶氧菌酯SC1500倍液防效在5％显著水平和1％极显著水平上差异均不显著。
D.22.5％啶氧菌酯SC1500倍液、E.湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对由高抗菌株引起的大豆炭疽病的防治效果分别为55.23％和67.67％，对大豆安全，未见药害。湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对由高抗菌株引起的大豆炭疽病的防效与22.5％啶氧菌酯SC1500倍液防效在5％显著水平和1％极显著水平上差异均达显著水平。
由此可见，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3的发酵液对由高抗菌株引起的大豆炭疽病的防治效果优于22.5％啶氧菌酯SC1500倍液的防效，具备良好的应用前景。
Claims (7)
1.湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述菌株为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22830，保藏日期：2021年7月6日；
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
2.根据权利要求1所述的湿地链霉菌菌株在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌具有拮抗作用。
3.湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述发酵液为湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液，湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
4.根据权利要求3所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液应用于防治由抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌引起的大豆炭疽病。
5.根据权利要求3所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于，所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液制备方法如下：
将湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3接种于ISP2固体培养基，发酵温度为26-28℃，发酵培养时间7-8天，采用乙酸乙酯萃取，提取液减压浓缩蒸干后用DMSO溶解，得发酵液。
6.根据权利要求4所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的菌丝生长有抑制作用。
7.根据权利要求4所述的湿地链霉菌菌株发酵液在治理大豆炭疽病菌抗药性中的应用，其特征在于：
所述湿地链霉菌(Streptomyces paludis)菌株13-3发酵液对抗啶氧菌酯的大豆炭疽病菌的孢子萌发有抑制作用。
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| CN115851483B (zh) * | 2022-06-15 | 2024-06-04 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 湿地链霉菌菌株及其发酵液在抑制抗苯醚甲环唑的大豆炭疽病菌中的应用 |
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