CN116784353B - 野尻链霉菌菌株及其发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株野尻链霉菌及其发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用，属于农作物病害抗性治理的生物防治技术领域。生防菌株9‑13，命名为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)，于2021年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22798。该菌株对抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌具有非常强的拮抗作用，其发酵液可以显著抑制抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的菌丝生长，对由抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌引起的双孢蘑菇疣孢霉病具有优良的防治效果，且对双孢蘑菇安全。
Description
技术领域
本发明涉及农作物病害抗性治理的生物防治技术领域，具体为野尻链霉菌菌株及其发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用。
背景技术
双孢蘑菇又称白蘑菇，由于其口感好，兼具营养和药用价值，是一种重要的食药用菌。中国是世界上最大的双孢蘑菇生产国，2013年中国的双孢蘑菇产量达到全世界总产量54％。随着我国双孢蘑菇栽培面积的增长和栽培方式多样化，病害问题逐步呈现，主要表现在：病害发生较为普遍，采用传统栽培方式的菇房管理不到位，病害严重发生；部分常见病害出现了加重趋势。其中由丛梗孢科(Moniliaceae)疣孢霉属(Mycogone)真菌引起的双孢蘑菇疣孢霉病(湿泡病)在世界范围内发生，已成为为害双孢蘑菇最主要的病害之一。
目前，咪鲜胺锰盐和噻菌灵是仅有的2种在我国登记用于防治双孢蘑菇疣孢霉病的杀菌剂，其中咪鲜胺锰盐是目前蘑菇生产上最为常用的杀菌剂。咪鲜胺锰盐的功能基团为咪鲜胺，是拜耳公司开发的广谱三唑类(DMIs)杀菌剂，具有内吸传导活性，通过抑制甾醇的生物合成而起作用。由于其作用位点单一，田间许多重要的靶标病原菌已逐渐对三唑类杀菌剂产生了不同程度的抗药性。而病原菌产生抗药性对作物保护是一个持续的威胁。因此，寻求生物农药防治双孢蘑菇疣孢霉病和利用抗双孢蘑菇疣孢霉病有益微生物及其代谢产物的研究日益受到重视。
生物农药包括农用抗生素的发展符合当前农业和环境可持续发展的要求。自链霉素发现以来，放线菌受到广泛关注。放线菌是新生活性物质的主要产生菌。放线菌产生的次生代谢产物具有丰富的结构多样性。宁南霉素是从诺尔斯链霉菌西昌变种发酵液中分离出的一种农用抗生素，对多种植物病毒病有特效。具有广谱、高效、低毒和低残留的特点。嘧肽毒素是由土壤中的不吸水链霉菌辽宁变种产生的，其有效成分为胞嘧啶核苷肽类化合物，该物质既能体外钝化病毒，又能在植物体内抑制病毒的增殖。井冈霉素是70年代开发成功的生物农药，经历了多年的应用，至今仍是生产上用于防治水稻纹枯病的当家品种。
生物农药是未来农药发展的主要方向之一。微生物农药是生物农药的重要组成部分，具有活性物质结构新颖、低残留和易于开发等优点，已成为生物农药创制和开发的重要方向。
发明内容
本发明的首要目的在于针对双孢蘑菇疣孢霉病的发生阻碍了双孢蘑菇产业的安全生产，杀菌剂的使用造成病原菌产生抗药性等问题，提供野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用。
本发明的另一目的在于提供野尻链霉菌菌株发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
野尻链霉菌菌株在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用，所述菌株为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22798，保藏日期为2021年6月28日；所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对抗三唑类杀菌剂的疣孢霉菌具有拮抗作用。
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌具有拮抗作用。
野尻链霉菌菌株发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用，所述发酵液为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液，野尻链霉菌菌株9-13发酵液应用于防治由抗三唑类杀菌剂的疣孢霉菌引起的双孢蘑菇疣孢霉病。
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液应用于防治由抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌引起的双孢蘑菇疣孢霉病。
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液的制备方法如下：将野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13接种于ISP2液体培养基，发酵温度为26-28℃，发酵培养时间7-8d，微孔滤膜除菌得发酵液。
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液对抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的菌丝生长有抑制应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13对抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌具有拮抗作用，其发酵液可以显著抑制抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的菌丝生长，且发酵液对由抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌引起的双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果好，可用于抗性治理，另外对双孢蘑菇安全，这对降低化学杀菌剂的使用，降低农药污染具有重要的意义。
此外，野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13是从土壤中获得的，与土壤环境和谐相容，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13在高氏一号培养基上的培养特征。
图2为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13与抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的对峙培养。注：A为抗性菌株A1，B为抗性菌株G1，C为抗性菌株8Y，CK为对照组。
图3为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液在离体条件下对抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的菌丝生长的抑制效果。注：A为抗性菌株A1，B为抗性菌株G1，C为抗性菌株8Y，CK为对照组。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例一：野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的分离及鉴定。
1、土壤样品的采集
从江西井冈山采集土样3份，去除表面的土壤，采集5-20cm深处的土样，标记后带回实验室自然风干。
2、放线菌的分离
采用平板稀释法进行分离。将风干土样用研钵磨碎，称取样品1g悬浮于9mL无菌水中，于40℃、180rpm震荡30min后静置5min，依次稀释10倍，分别配制成10-2、10-3、10-4的悬浮液，分别吸取不同浓度的悬浮液各0.1mL加入到改良的HVA培养基(加入终浓度为100-200ppm的重铬酸钾)平板上，均匀涂布后倒置于28℃培养，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化，纯化后的菌株采用甘油法保藏于-80℃冰箱。
3、野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的鉴定
(1)形态特征观察
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13在多数培养基上生长良好，都不产可溶性色素(表1)。光学显微镜下菌株9-13孢子丝直、柔曲、钩状、松敞及紧密螺旋形，孢子椭圆形、柱形。
表1野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)9-13的培养特征
(2)生理生化特征
参照《链霉菌鉴定手册》中所述的方法测定野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)9-13硝酸盐还原及碳、氮源的利用等特性，结果见表2。
表2菌株9-13的生理生化特征
(3)序列分析
细菌基因组提取试剂盒提取菌株9-13基因组DNA后，分别进行16S rRNA和rpoB基因扩增，得到的序列全长分别为1412bp和859bp，将所得序列提交至GenBank数据库进行BLAST比对分析得出菌株9-13为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)。
野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的16s rRNA序列及rpoB基因序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
实施例二：抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的诱导及遗传稳定性。
将2株疣孢霉菌亲本菌株YBM2-2和YBM8在PDA培养基上25℃恒温培养6d，从菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，接种于含有咪鲜胺锰盐(EC90)的PDA平板25℃恒温培养，待长出扇形突变后，转接至PDA平板上，25℃恒温培养6d，打取菌碟转接至下一浓度继续诱导突变体，转接浓度成倍递增，直至在含药32.0μg/mL PDA平板上长出菌落为止，测定突变体的EC50值，并按下列公式计算抗性倍数，根据抗性倍数将各突变体的抗性水平划分为敏感、低抗、中抗和高抗，其中：抗性倍数≤3的为敏感菌株(S)；3<抗性倍数≤10的为低抗菌株(LR)；10<抗性倍数≤50的为中抗菌株(MR)；50<抗性倍数的为高抗菌株(HR)。抗性倍数＝抗性突变体EC50值/亲本敏感菌株EC50值。
将抗性突变体和敏感菌株在不含药剂的PDA平板上继代培养8代，采用菌丝生长速率法分别测定第1代及第8代菌株对咪鲜胺锰盐的EC50值。按以下公式计算突变体抗药性变化系数，分析突变体的遗传稳定性。
抗药性变化系数＝抗性突变体第8代抗性倍数/抗性突变体第1代抗性倍数
表3抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的抗性倍数及抗性稳定性
注：YBM2-2*和YBM8*为亲本敏感菌株，其余为抗性突变体。
结果表明，以疣孢霉菌YBM2-2和YBM8为亲本菌株，通过室内药剂驯化获得的3株抗性突变体，其中A1和G2的抗性倍数为4.57和4.05，为低抗菌株；8Y的抗性倍数为3.52，也为低抗菌株。抗性突变体经过继代培养，抗药性系数变化为0.91-1.04，表明3株抗性突变体对咪鲜胺锰盐的抗性能稳定遗传。
实施例三：野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对3株抗性突变体的拮抗作用测定。
采用平板对峙培养法，将野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对抗性突变体A1、G1和8Y进行拮抗测定。首先在PDA培养基靠边缘两侧划线接种野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13，3d后在平板中央接入直径5mm供试病原菌菌饼，25℃下培养5d测量野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对供试病原菌的抑菌带宽度和病原菌直径(表4)，以不接拮抗菌的供试病原菌为对照。结果表明，野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对抗性突变体A1、G1和8Y均具有非常强的拮抗作用(图2)。
表4菌株9-13对抗性突变体的拮抗作用
实施例四：野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液对抗性突变体的菌丝生长的抑制作用。
将高氏一号培养基活化的野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的孢子接入ISP2液体培养基中，发酵温度为26-28℃，发酵时间7d，0.22μm微孔滤膜除菌得发酵液，备用。
取野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液5mL加入到50mLPDA培养基中，混匀后倒入培养皿中，将直径5mm供试病原菌菌饼接入PDA培养基平板中央，置于25℃下培养5d后测量菌落直径。以空白PDA培养基为对照，计算发酵液对抗性突变体的菌丝生长的抑制率(表5)。结果表明野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液对抗性突变体A1、G1和8Y的菌丝生长均具有较强的抑制效果(图3)。
表5菌株9-13发酵液对抗性突变体的菌丝生长的抑制作用
实施例五：野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液在治理由抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌引起的的双孢蘑菇疣孢霉病中的应用。
供试的抗性突变体A1、G1和8Y 25℃培养3d，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，将菌饼转入PDB液体培养基中，于150r/min、25℃黑暗振荡培养5d，用血球计数板计数厚垣孢子浓度，制成浓度为1×104个孢子/mL的混合孢子悬浮液，备用。
试验地点选择在福建省福州市埔党村，双孢蘑菇品种为As2796。试验设置3个处理，分别为：A.50％咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米、B.野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13的发酵液、C.清水对照。每处理4次重复，共计12个小区，随机区组排列，每小区6m2。将供试浓度药液定量喷施于待覆土的定量土粒上(每平方米菇床覆盖用土约25kg，喷施药液1.5L)，拌匀，保持土壤含水量约为70％，用塑料膜覆盖闷土24h后进行覆土，然后每小区喷雾接种上述的孢子混合悬浮液120mL。于覆土7d后进行第二次发酵液喷施，将相同剂量发酵液均匀喷施于床面土粒上，以土粒湿润且不流进菌料内为度。从采收第一潮菇起开始调查，共调查3潮菇，采取全小区调查方式，于每次采收时调查记录培养料上病菇菇粒数或菌团数(菇粒或菌团≥1cm)，累计各小区的发病菇粒数，计算防治效果。
防治效果(％)＝[(对照区病菇数—处理区病菇数)/对照区病菇数]×100
表6菌株9-13的发酵液防治双孢蘑菇疣孢霉病田间药效试验
实验结果表明，A.50％咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米、B.野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13的发酵液对双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果分别为72.71％和69.74％，均对双孢蘑菇安全，未见药害。野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13的发酵液对双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果在5％显著水平上及1％极显著水平上与50％咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米防效差异均不显著。由此可见，野尻链霉菌(Streptomycesnojiriensis)菌株9-13的发酵液对双孢蘑菇疣孢霉病的防治效果与50％咪鲜胺锰盐WP1.0克/平方米防效相当，具备良好的应用前景。
Claims (4)
1.野尻链霉菌菌株在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用，其特征在于：所述菌株为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22798，保藏日期：2021年6月28日；
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13对抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌具有拮抗作用。
2.野尻链霉菌菌株发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用，其特征在于：所述发酵液为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液，所述菌株为野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22798，保藏日期：2021年6月28日；
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液应用于防治由抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌引起的双孢蘑菇疣孢霉病。
3.根据权利要求2所述的野尻链霉菌菌株发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用，其特征在于，所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液的制备方法如下：
将野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13接种于ISP2液体培养基，发酵温度为26-28℃，发酵培养时间7-8d，微孔滤膜除菌后得发酵液。
4.根据权利要求2所述的野尻链霉菌菌株发酵液在抑制抗咪鲜胺锰盐的双孢蘑菇疣孢霉菌中的应用，其特征在于：
所述野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)菌株9-13发酵液对抗咪鲜胺锰盐的疣孢霉菌的菌丝生长有抑制作用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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