CN111549166B - 一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用 - Google Patents

一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明为一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用，公开一种引起双孢蘑菇湿泡病的疣孢霉菌新种的快速检测方法及其在双孢蘑菇湿泡病早期诊断中的应用。具体公开了一种快速检测和鉴定疣孢霉菌新种的特异引物及检测方法，以样品DNA为模板，通过设计的一对鉴别疣孢霉菌新种的特异引物T‑7‑1F/AT‑3R进行PCR扩增，如果扩增出228bp的条带，则检测出疣孢霉菌新种，否则未检出。本发明提供的疣孢霉菌新种的检测引物和检测方法具有灵敏度高、简单快速、稳定性好、适用性广的特点。可以有效地从引起双孢蘑菇湿泡病的疣孢霉属中区分出新种，还能有效区分双孢蘑菇干泡病、软腐病等相似病害；且可用于双孢蘑菇湿泡病的早期诊断和新种的监测和鉴定。

Description

一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用
技术领域
本发明涉及一种双孢蘑菇疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)的分子检测引物及应用；专用于疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)的快速、灵敏和特异性分子检测，同时可用于双孢蘑菇湿泡病的早期诊断和疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)的鉴定和监测。属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
背景技术
双孢蘑菇又称白蘑菇，由于其口感好，兼具营养价值和药用价值，是一种重要的食药用菌。我国是世界上最大的双孢蘑菇生产国，2013年我国的双孢蘑菇产量达到全世界总产量的54％。随着我国双孢蘑菇栽培面积的增长和栽培方式多样化，病害问题逐步呈现，主要表现为：病害发生较为普遍，采用传统栽培方式的菇房管理不到位，病害严重发生；部分常见病害出现了加重趋势。其中由丛梗孢科(Moniliaceae)疣孢霉属(Mycogone)真菌引起的双孢蘑菇湿泡病已成为危害双孢蘑菇最主要的病害之一。对该病害的防治呈现两个特点：缺少具有抗病性的双孢蘑菇商业栽培品种；疣孢霉菌与其寄主双孢蘑菇同属真菌，杀菌剂对两者均有抑制作用，评价杀菌剂药效的同时还需考虑对双孢蘑菇的安全性，迄今登记用于防治双孢蘑菇湿泡病的杀菌剂较少。因而双孢蘑菇湿泡病的早期检测对预防该病害具有重要意义。
前期，我们大量研究了全国双孢蘑菇湿泡病的病原菌。结果表明，除菌盖疣孢霉和红丝疣孢霉外，还有一个新种同样造成我国双孢蘑菇湿泡病，并且该病原菌在我国上海、新疆等多个双孢蘑菇产区发生为害，我们将其命名为Mycogone huxienia，这是世界范围内首次发现。该病原菌对双孢蘑菇的致病力强，造成重大的质量和产量损失。但是，Mycogonehuxienia在形态学上与菌盖疣孢霉、红丝疣孢霉极其相似，造成的病害症状也相似。因此，利用传统的形态学方法难以区分和辨别疣孢霉属属下菌盖疣孢霉、红丝疣孢霉和Mycogonehuxienia，且工作量大，鉴定成本高，周期长，对经验的依赖程度高，且准确性低。通过形态学和多基因联合的系统发育分析方法，由于需要对多个基因进行测序，工作量更大，鉴定周期更长，实用性也较差，影响病原菌的诊断速度。
因此，发明一种快速准确的检测和鉴定方法尤为重要，不仅可有效快速地从引起双孢蘑菇湿泡病的各病原菌中检测和鉴定出Mycogone huxienia，而且这将对疣孢霉菌的分类、群体多样性及科学防治具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中根据形态学特征鉴定疣孢霉菌对经验依赖度高，程序繁琐，准确性低的问题，以及现有分子检测技术以ITS序列设计检测引物，造成因rDNA-ITS序列差异小，难以区分近缘种的技术缺陷，提供了一种基于Tef-1α基因的疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用。利用本发明所述的特异引物及检测方法可实现对疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)简便快速、灵敏准确的检测。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
1.疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)PCR特异性引物：
通过测定疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)、疣孢霉属其它种(Mycogone spp.)及双孢蘑菇其它病原菌的Tef-1α基因序列，对疣孢霉属不同种间及与双孢蘑菇其它病原菌间Tef-1α基因进行比对分析，设计筛选出对疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)具有特异性扩增作用的一对引物，其核苷酸序列为：
T-7-1F:5'-GCGGCTTCCTATAGACCGTC-3'
AT-3R:5'-TCCCTTTGCCCTCCCTCGAT-3'。
2.一种疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)的快速检测方法：
S1.提取待测疣孢霉菌的基因组DNA；
S2.利用所述引物T-7-1F:5'-GCGGCTTCCTATAGACCGTC-3'、AT-3R:5'-TCCCTTTGCCCTCCCTCGAT-3'对步骤S1提取的DNA进行PCR扩增；
扩增反应体系为：
Figure BDA0002484198570000021
Figure BDA0002484198570000031
扩增反应条件为：
94℃预变性5min，94℃变性30sec，59.6℃退火30sec，72℃延伸45sec，36个循环，最后72℃下延伸10min。
S3.取步骤S2的PCR扩增产物3.0μL用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，如果扩增出228bp的条带，则所鉴定的疣孢霉为疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)。
3.上述特异性引物和检测方法在双孢蘑菇湿泡病的早期诊断和病菌监测、鉴定上的应用。具体为：提取待测的双孢蘑菇的基因组DNA，利用2中所述的方法进行PCR扩增，如果能特异性扩增出228bp的产物，则可判定所述的双孢蘑菇中存在疣孢霉菌新种(Mycogonehuxienia)，否则所述的双孢蘑菇中不存在疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.特异性强、准确性高：本发明所设计的引物对Mycogone huxienia具有很强的特异性，并已经对不同地理来源的Mycogone huxienia、Mycogone perniciosa、Mycogonerosea、双孢蘑菇干泡病菌、红粉病菌、绿霉病菌、软腐病菌及其它土壤习居菌等进行了验证，只有Mycogone huxienia及携带该病菌的双孢蘑菇子实体上能特异性地扩增出228bp的条带，说明本发明的引物具有很强的特异性、准确性。
2.灵敏度高：本发明设计的特异性引物对Mycogone huxienia的检测灵敏度在DNA水平上可达2×10-2ng/μL。
3.简单快速：本发明既可以对Mycogone huxienia菌株进行检测也可以直接对田间双孢蘑菇进行检测，可实现不用分离病原菌就可以进行快速准确的鉴定和检测，与传统的鉴定方法相比，极大缩短了检测时间，简单便捷，省时省工。
4.适用性广、实用性好：本发明既可以对Mycogone huxienia菌丝体进行检测，也能对感染Mycogone huxienia的双孢蘑菇进行检测，可实现田间病害的早期检测和监控。
附图说明
图1为特异引物对T-7-1F/AT-3R对疣孢霉菌新种的特异性检测的电泳图：其中泳道M为5kb DNA marker，泳道c1–c2为Mycogone huxienia菌株，泳道c3–c4为Mycogoneperniciosa菌株，c5–c6为Mycogone rosea菌株，c7为阴性对照。
图2为特异引物对T-7-1F/AT-3R对疣孢霉菌新种的特异性验证电泳图：其中泳道M为5kb DNA marker，泳道1–5为Mycogone huxienia菌株，泳道6–10为Mycogone perniciosa菌株，泳道11–15为Mycogone rosea菌株，泳道16–24分别为：双孢蘑菇(Agaricusbisporus)、双孢蘑菇绿霉病菌(Trichoderma harzianum)、双孢蘑菇红粉病菌(Trichothecium roseum)、双孢蘑菇干泡病菌(Lecanicillium fungicola)、双孢蘑菇软腐病菌(Cladobofryum dendroides)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、阴性对照。
图3为特异引物对T-7-1F/AT-3R对疣孢霉菌新种扩增灵敏性检测的电泳图。其中泳道M为5kb DNA marker，泳道1–7为2，2×10-1，2×10-2，2×10-3，2×10-4，2×10-5，2×10- 6ng/μL。
图4为特异引物对T-7-1F/AT-3R在双孢蘑菇湿泡病早期诊断的扩增电泳图。其中泳道M为5kb DNA marker，泳道1–7为接种Mycogone huxienia的双孢蘑菇，泳道8–14为接种Mycogone perniciosa的双孢蘑菇，泳道15–21为接种Mycogone rosea的双孢蘑菇，泳道22为阴性对照。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中使用的疣孢霉菌株来自全国多个地区，为本实验室分离、保存。菌株种类为Mycogone huxienia，Mycogone perniciosa，Mycogone rosea。
下述实施例中使用的双孢蘑菇品种为W192，双孢蘑菇绿霉病菌(Trichodermaharzianum)、双孢蘑菇红粉病菌(Trichothecium roseum)、双孢蘑菇干泡病菌(Lecanicillium fungicola)、双孢蘑菇软腐病菌(Cladobofryum dendroides)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)均为本实验室分离和保存。
实施例1、疣孢霉菌新种特异引物设计及特异性检测方法的建立
1、菌株：每种疣孢霉选用2株菌株，Mycogone huxienia菌株为201，225；Mycogoneperniciosa菌株为21，81；Mycogone rosea菌株为56，59。
2、方法：
1)菌株培养：使用PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，121℃，20min，湿热灭菌后备用)于25℃下培养疣孢霉菌。7d后收集菌丝体，液氮冷冻后–80℃保存，用于提取基因组DNA。
2)分别提取各供试疣孢霉菌的基因组DNA：
采用CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取适量经液氮冷冻的菌丝，研钵研磨至粉末状，置于1.5mL离心管中；加入900μL 2％CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15min；
(2)取上清液700μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(各体积比为25:24:1)，温和摇动，室温条件下，8000r/min离心10min；
(3)取上清液500μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000r/min离心10min；
(4)取上清液350μL，加入1/10体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，–20℃沉淀60min，4℃条件下，8000r/min离心5min；
(5)弃去上清液，加入700μL体积浓度为70％冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000r/min离心10sec，晾干，加入50μL TE缓冲液，–20℃保存备用。
3)疣孢霉菌Tef-1α序列的测定
以引物EF1-728F(5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3')/EF2(5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3')对疣孢霉菌的DNA进行PCR扩增，扩增反应体系为：
Figure BDA0002484198570000051
Figure BDA0002484198570000061
PCR反应条件为：94℃预变性2min；95℃变性30sec，58℃退火50sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；所得PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
4)基因登录号的获得：
将上述测序所得的3个不同种的疣孢霉菌的Tef-1α序列提交至GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中，并获得登录号。其中菌株201，225的Tef-1α序列的登录号为MN412545，MN412551；菌株21，81的Tef-1α序列的登录号为MN412526，MN412527；菌株56，59的Tef-1α序列的登录号为MN412537，MN412538。
疣孢霉新种(Mycogone huxienia)201号菌株的Tef-1α序列参见序列表SEQ IDNO.3；疣孢霉新种(Mycogone huxienia)225号菌株的Tef-1α序列参见序列表SEQ ID NO.4。
5)疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)特异分子检测引物的设计：
将上述测序所得的3个不同种的疣孢霉菌的Tef-1α序列及与GenBank中双孢蘑菇干泡病菌等其它双孢蘑菇病原菌进行同源性分析和差异位点比较，并根据表1设计的特异性引物组合出12对PCR引物对，以筛选出对疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)可以特异性扩增的引物。
表1用于疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)特异性扩增的引物
Figure BDA0002484198570000062
Figure BDA0002484198570000071
6)疣孢霉菌新种特异检测方法的建立：
以上述设计的12对引物对疣孢霉菌的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系如下：
Figure BDA0002484198570000072
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，退火过程按以下温度做梯度优化(每次PCR设定的退火温度分别为：65℃，64.5℃，63.5℃，61.7℃，59.6℃，57.8℃，56.6℃，56.0℃，退火时间均为30sec)，72℃延伸45sec，36个循环，最后72℃下延伸10min。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
结果如图1所示，引物对T-7-1F/AT-3R在退火温度为59.6℃时，只能从疣孢霉新种中特异性扩增出228bp条带，而不能从另外两种疣孢霉菌中扩增出条带。
实施例2、疣孢霉菌新种的特异性检测
1.菌株：双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、双孢蘑菇绿霉病菌(Trichodermaharzianum)、双孢蘑菇红粉病菌(Trichothecium roseum)、双孢蘑菇干泡病菌(Lecanicillium fungicola)、双孢蘑菇软腐病菌(Cladobofryum dendroides)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)各2株；Mycogone huxienia、Mycogone perniciosa、Mycogonerosea各20株。
2.方法：
1)菌株培养：同实施例1中的方法。
2)分别提取上述菌株的基因组DNA：采用CTAB法，同实施例1中的方法。
3)以上述的DNA分子作为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0002484198570000081
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，59.6℃退火30sec，72℃延伸45sec，36个循环，最后72℃下延伸10min。电泳检测扩增产物。
4)特异性扩增结果：
结果如图2所示，只有Mycogone huxienia可以特异性扩增出228bp的条带，而Mycogone perniciosa、Mycogone rosea、双孢蘑菇、双孢蘑菇干泡病菌、双孢蘑菇红粉病菌、双孢蘑菇绿霉病菌、双孢蘑菇软腐病菌及其它土壤习居菌和阴性对照均无扩增条带。表明本发明的分子检测引物可以将疣孢霉菌新种与另两种疣孢霉菌及其它病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于疣孢霉新种的特异性扩增。
实施例3、疣孢霉菌新种的灵敏性检测
采用CTAB法提取疣孢霉菌新种225号菌株的基因组DNA；经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
以配制成的系列浓度DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同实施例2中一致。
结果如图3所示，疣孢霉菌新种DNA浓度为2×10-2ng/μL仍可获得可视条带。因此，其检测灵敏度可达到2×10-2ng/μL。
实施例4、双孢蘑菇子实体中疣孢霉菌新种的检测
1.菌株：每种疣孢霉选用7株菌株，Mycogone huxienia菌株为201，202，211，212，213，214，225；Mycogone perniciosa菌株为13，21，81，91，101，105，108；Mycogone rosea菌株为42，52，56，59，206，214，231。
2.方法：
1)菌株培养：将供试疣孢霉菌株置于PDA培养基平板上25℃培养7d后，用无菌水洗下分生孢子和厚垣孢子，用血球计数板计算分生孢子和厚垣孢子浓度，配制成分生孢子和厚垣孢子浓度为1×105个/mL悬浮液，备用。
2)双孢蘑菇菌床分别接种不同的疣孢霉菌菌株：
从山东莘县富邦菌业有限公司采购已接上双孢蘑菇菌的培养料(50cm*40cm*15cm)，每块重18kg，双孢蘑菇品种为W192。于23℃的温室中进行14天发酵培养后，用大约40mm厚的土层进行灭菌覆土。然后将1×105个/mL孢子悬浮液均匀喷施于灭菌的覆盖土中，按每平方米覆盖土50mL接种悬浮液，每株疣孢霉菌3次重复，以喷施无菌水为对照。然后于17–19℃的温度和85–90％的RH下进行出菇培养。
2)双孢蘑菇子实体基因组DNA的提取及扩增：
采用CTAB法提取不同处理及对照的双孢蘑菇子实体的基因组DNA；以DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同实施例2中一致。
结果如图4所示，接种Mycogone huxienia的双孢蘑菇子实体中可扩增出228bp的可视条带，而接种Mycogone perniciosa、Mycogone rosea的双孢蘑菇子实体中，及对照健康双孢蘑菇子实体中均无任何条带出现，表明本发明的引物和检测方法还可用于田间感染Mycogone huxienia的双孢蘑菇的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gcggcttcct atagaccgtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 533
<212> DNA
<213> 疣孢霉新种(Mycogone huxienia)
<400> 3
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gttagccagc agaagaggtg gggtgagatt tgggagcaac gacgtaccaa tgacggtgac 120
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cccccccccc caaaaaaaaa ttgggcgcgg atgggagcaa aattaggagt ctt 533

Claims (5)

1.一种Mycogone huxienia的分子检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：
T-7-1F: 5'-GCGGCTTCCTATAGACCGTC-3'
AT-3R: 5'-TCCCTTTGCCCTCCCTCGAT-3'。
2.根据权利要求1所述的分子检测引物进行疣孢霉菌新种快速鉴定的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 提取待测疣孢霉菌的基因组DNA；
S2. 对步骤S1提取的DNA进行PCR扩增；
S3. 取步骤S2的PCR扩增产物3.0 μL用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离，如果扩增出228bp的条带，则所鉴定的疣孢霉为Mycogone huxienia。
3.根据权利要求2所述的疣孢霉菌新种快速鉴定的方法，其特征在于，步骤S2中的扩增反应体系为：
反应体系20μL：Taq PCR Master Mix 10μL、10 μmol/L引物T-7-1F 0.5μL、10 μmol/L引物AT-3R 0.5μL、模板DNA 1μL、ddH2O 8μL。
4.根据权利要求2所述的疣孢霉菌新种快速鉴定的方法，其特征在于，步骤S2中的扩增反应条件为：
94°C预变性5 min，94°C变性30 sec，59.6°C退火30 sec，72°C延伸45 sec，36个循环，最后72°C下延伸10 min。
5.根据权利要求2所述的方法在双孢蘑菇湿泡病的Mycogone huxienia的早期诊断和病菌监测、鉴定上的应用。
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