CN111154909B - 一种土赤壳属真菌的特异性引物、试剂盒及分子检测方法 - Google Patents

一种土赤壳属真菌的特异性引物、试剂盒及分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测土赤壳属真菌的特异性引物对及其应用，具体公开了通过PCR扩增检测土赤壳属真菌的特异性引物、检测方法及试剂盒。本发明的引物对、试剂盒以及检测方法能够对样品中是否存在土赤壳属真菌的进行检测，具有特异性强、灵敏度高、简单快速的特点，可用于快速、灵敏地检测植物、土壤、水等环境中的土赤壳属真菌，对快速诊断、早期预警病害发生和指导病害防治具有重要意义。

Description

一种土赤壳属真菌的特异性引物、试剂盒及分子检测方法
技术领域
本发明属于病原菌检测领域，尤其是涉及植物病原真菌的分子检测。
背景技术
土赤壳属(Ilyonectria)是2011年建立的新属，在分类地位上属于子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycotina)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、丛赤壳科(Nectriaceae)。“ilyo”在希腊语中是“泥土”的意思，因其为土壤栖居菌而获此属名，通常以无性型进行繁殖与侵染，其模式种为I.radicicola，有性型特征为子囊壳单生，表面具有疣状物，子囊壳壁外层由薄壁的球形大细胞构成，子囊孢子表面光滑；无性型以产生小分生孢子和厚垣孢子而区别于其他属(Booth,1996；Mantiri et al.,2001；Samuels and Brayford,1990)。
土赤壳属真菌引起多种植物根部病害，并且同一种植物病害通常由多种土赤壳真菌引起。例如引起西洋参锈腐病的病原菌主要包括I.crassa、I.mors-panacis和I.vredehoekensis(Cabral et al.,2012a；Seifert et al.,2003；Zhang et al.,2019)。引起葡萄黑根病的病原菌包括I.estremocensis、I.alcacerensis、I.novozelandica、I.macrodidyma和I.vivaria等(Cabral et al.,2012b；Berlanas et al.,2020)。引起山龙眼科花卉植物黑根病的病原菌包括I.capensis、I.leucospermi、I.protearum和I.vredehoekensis等(Lombard et al.,2013)。在我国，共报道了10个种的Ilyonectria属真菌：I.mors-panacis,I.robusta,I.changbaiensis,I.communis、I.qitaiheensis、I.vredehoekensis、I.hubeiensis、I.radicicola、I.estremocensis、I.pseudodestructans(Lu et al.,2019；Zhang et al.,2019；Zhuang et al.,2007；Zeng&Zhuang,2013；Mao et al.,2014；Lu et al.,2014；王玉君等，2015)，他们大多数为人参、西洋参、三七等名贵中药材的病原菌，给这些名贵中药材的生产带来了严重的经济损失。
土赤壳属真菌多为土壤习居菌，寄生性较弱，能够产生大量厚垣孢子在土壤中长期存活(Chaverri et al.,2011)，只有当环境条件适宜时才会侵染寄主植物引起病害的发生(Tewoldemedhin et al.,2011a；Tewoldemedhin et al.,2011b)。因此，通常情况下，即使田间未观察到病害，土壤或植物体内也很有可能已经存在该类病原物，所以及时检测土壤、植物体中的土赤壳属真菌，尽早采取病害预防措施以避免病害的发生发展尤为重要。
目前对于土赤壳属真菌的检测主要采用常规分离培养鉴定的方法。然而，土赤壳属真菌的生长速度通常较慢，常受其他真菌菌落的限制，甚至被其他真菌菌落覆盖而影响分离；培养鉴定对操作人员的技术要求高，时间周期长。分子检测的方法有多重巢式PCR(multiplex nested PCR)，需要采用两对引物分别进行PCR，不仅耗时，而且多次PCR可能增加系统误差(Agustí-Brisach et al.,2013)。所以需要改进现有的土赤壳属真菌的检测方法，建立高效、省时、简便、高灵敏度，并且满足同时检测引起同一种病害的所有土赤壳属真菌要求的方法。
发明内容
本发明的发明人对土赤壳属真菌的多个种，以及其他与土赤壳属相近的非土赤壳真菌的多个种进行了分子系统学研究和分析总结，选取翻译延伸因子1-α(translationelongation factor 1-alpha，tef1-α)基因作为分子检测的靶标片段，设计了基于tef1-α基因在土赤壳属内具有通用性的特异性引物，并建立了PCR检测方法，以检测样本的总DNA为模板，检测结果可靠，易于操作，特异性强，扩增效率高，对于Ilyonectria属真菌引起的病害的早期诊断、病情预报及综合防治具有重要意义。
第一方面，本发明提供了一种用于检测样本中土赤壳属真菌的如下引物对：
(1)正向引物EFF1：CAAAATTTTTCACCCACCCTCTATTG(SEQ ID NO：1)；
和
反向引物EFR1：GTGAGAGTTAGAATGTGCCAAGTG(SEQ ID NO：2)；
或
(2)正向引物EFF2：CTCTTCACACGCTATGCACAG(SEQ ID NO：3)和
反向引物EFR1：GTGAGAGTTAGAATGTGCCAAGTG(SEQ ID NO：2)。
所述引物对可以检测样本的总DNA作为模板通过PCR扩增对土赤壳属真菌进行快速检测。
本发明的引物对是土赤壳属真菌的通用引物。
优选地，所述样本可以为植物、土壤、水、微生物等。因此，检测样本的总DNA可以为植物、土壤、水、微生物等样品的总DNA。
第二方面，本发明提供了一种用于检测土赤壳属真菌的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面的引物对。
优选地，所述试剂盒还包含用于进行PCR的其他试剂，具有使用方便的优点。
所述引物对是土赤壳属真菌的通用引物。
第三方面，本发明提供了用于检测土赤壳属真菌的方法，所述方法包括使用第一方面的引物对或第二方面的试剂盒进行检测。
优选地，利用本发明的引物对或利用本发明的试剂盒对土赤壳属真菌进行检测的方法中，以待测样本总DNA为模板，利用引物对EFF1/EFR1或EFF2/EFR1进行PCR扩增，PCR反应程序为：预变性94℃10min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃下延伸5min。反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物是否为～350bp或～240bp的片段来判定待测样本中是否含有土赤壳属真菌。
PCR扩增中，反应退火温度为55-65℃。
所述引物对是土赤壳属真菌的通用引物。
第四方面，本发明提供了第一方面的引物对或第二方面的试剂盒在检测样本中土赤壳属真菌中的应用。
所述样本可以为植物、土壤、水、微生物等。
优选地，本发明的土赤壳属真菌包括但不限于：Ilyonectria mors-panacis，Ilyonectria changbaiensis，Ilyonectria communis，Ilyonectria vredehoekensis，Ilyonectria robusta和Ilyonectria qitaiheensis。
本发明的用于检测土赤壳属真菌的试剂盒和利用所述试剂盒检测土赤壳属真菌的方法具有灵敏度高、特异性好、简单快速、稳定性好的特点。尤其是，即使以检测样本(例如，植物、土壤、水等环境的样本)的总DNA作为模板，也能高效、高灵敏度地扩增出赤壳属真菌～350bp或～240bp的特异性片段，从而确定检测样本所来源的环境是否存在土赤壳属真菌。因此，特别适合快速、灵敏地检测植物、土壤、水等环境中土赤壳属真菌的发生发展动态，对病害的发生进行快速诊断和早期预警，对于指导及时采取病害防治策略具有重要意义。
而且，本发明的引物及PCR扩增用试剂可制备成试剂盒，使用方便。而且，更重要的是所适用的PCR扩增模板非常多样，适用范围广，可以是多种样品的DNA，如菌丝体、植物、土壤、水等提取的总DNA，大大增加了检测对象的范围。
重要的是，本发明的特异检测引物和试剂盒在病原菌侵染早期，甚至是尚未侵染植物时就能特异性的检测出赤壳属真菌，为病原菌引起病害的早期检测以及病害的预防提供了一种简单快速的方法，便于及时采取病原菌防治措施，以延缓和控制病害的发生和发展，具有重要的实际应用意义。
附图说明
图1为实施例1中凝胶电泳检测引物EFF1/EFR1(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)扩增20株真菌基因组DNA的PCR产物。
图2为实施例1中凝胶电泳检测引物EFF2/EFR1(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2)扩增20株真菌基因组DNA的PCR产物。
图3为实施例2中凝胶电泳检测EFF1/EFR1(左)(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)及引物对EFF2/EFR1(右)(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2)扩增土赤壳属6种真菌基因组DNA的PCR产物。
图4为实施例3中凝胶电泳检测引物EFF1/EFR1(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)扩增人工接种后发病西洋参根组织DNA的PCR产物(注：1～7号泳道的PCR模板为西洋参根接种病原菌1～7天后提取的DNA；8号泳道的PCR模板为病原菌菌丝DNA)。
图5为实施例4中凝胶电泳检测引物EFF1/EFR1(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)扩增田间发病西洋参DNA的PCR产物(注：1号泳道的PCR模板为西洋参健康根DNA；2号泳道的PCR模板为田间罹根腐病根DNA；3号泳道的PCR模板为土赤壳属真菌Ilyonectria mors-panacis基因组DNA)。
图6为实施例5中凝胶电泳检测EFF1/EFR1(左)(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)及引物对EFF2/EFR1(右)(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2)扩增土壤接种孢子提取DNA的PCR产物(注：1～7号泳道PCR模板分别为孢子接种量为7个/g、7×10个/g、7×102个/g、7×103个/g、7×104个/g、7×105个/g、7×106个/g的土壤DNA，8号泳道PCR模板为病原菌菌丝DNA)。
图7为实施例5中凝胶电泳检测EFF1/EFR1(左)(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)及引物对EFF2/EFR1(右)(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2)扩增土壤添加菌丝体提取DNA的PCR产物(注：1号泳道PCR模板为灭菌土壤DNA，2～4号泳道PCR模板分别为灭菌土壤添加I.robusta、I.communis、I.mors-panacis菌丝体后提取DNA)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中使用的真菌菌株为表1、表3所示，其中B8采自中国北京，H107、H309-1、H310-2和H309采自中国黑龙江省，4060和4065采自中国山东省，其他菌株采自中国吉林省，所有菌株均经过形态学和分子生物学方法鉴定至相应种属。菌株保藏于中国医学科学院药用植物研究所生物技术中心分子生态研究室。
以下实施例是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。
实施例一用于检测土赤壳属真菌的引物对的特异性验证
1、菌株：采用20个菌株，见下表1所示：
表1
Figure BDA0002395299390000051
2、方法：
1)模板：分别以上述菌株的基因组DNA为模板。
2)tef-1α基因部分片段的PCR扩增：
引物对1EFF1/EFR1：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(参见表2)。
引物对2EFF2/EFR1：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2(参见表2)。
表2
Figure BDA0002395299390000061
3)PCR反应采用博迈德公司试剂2×Taq PCR Master Mix，30μL反应体系中包括1μL模板DNA(30-50ng)，15μL PCR mix，每条引物(10μM)0.4μL，13.2μL ddH2O，反应体系根据后续实验需要进行成倍增减。反应程序为：预变性94℃10min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃下延伸5min。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。
3、结果：
PCR产物凝胶电泳结果(参见图1和图2)表明引物组合EFF1/EFR1，从Ilyonectria属真菌基因组DNA中扩增获得～350bp的目标条带，而采用另一对引物EFF2/EFR1从Ilyonectria属真菌基因组DNA中扩增获得～240bp的目标条带。因此，可以看出，这两对引物未从与Ilyonectria属真菌相近的其他属Fusarium、Dactylonectria、Neonectria的菌株基因组DNA中扩增获得PCR产物，表明这两对引物对于Ilyonectria属真菌均具有较高的特异性，不检出与之近似的真菌，更不必说与之相差较远的真菌。
实施例二用于检测土赤壳属真菌的引物对在土赤壳属真菌中的通用性验证
1、菌株：采用土赤壳属6个种的菌株，参见表3所示。
表3
Figure BDA0002395299390000062
Figure BDA0002395299390000071
2、方法：
1)模板：分别以上述菌株的基因组DNA为模板。
2)tef-1α基因部分片段的PCR扩增
引物对1EFF1/EFR1：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
引物对2EFF2/EFR1：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2。
3)PCR反应体系及程序与实施例一相同。
3、结果：
采用引物对1EFF1/EFR1(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)从土赤壳属6个种Ilyonectria mors-panacis、I.changbaiensis、I.communis、I.vredehoekensis、I.robusta、I.qitaiheensis菌株基因组DNA中扩增获得目标条带(参见图3)。采用引物对2EFF2/EFR1(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2)从土赤壳属5个种I.mors-panacis、I.changbaiensis、I.communis、I.robusta、I.qitaiheensis菌株基因组DNA中扩增获得目标条带(参见图3)。因此，结果显示引物对1EFF1/EFR1能够检测本发明所验证的所有6种土赤壳属的真菌，引物对2能够检测所验证的6种土赤壳属真菌中的5种，表明两对引物对土赤壳属真菌均具有通用性，其中引物对1EFF1/EFR1的通用性效果更好。
实施例三人工接种西洋参病根中土赤壳属真菌的检测
1、西洋参病根
采用离体参根接种法。将强壮土赤壳菌(Ilyonectria robusta)接种到PDA平板上活化产孢，用灭菌水洗下孢子，并将孢子浓度调整到1×106个/mL。选用2年生健康的西洋参根，流水洗净，采用0.8％次氯酸钠溶液浸泡10min进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次。将西洋参根自上而下针刺10个2mm深的针孔，然后在孢子悬液中浸泡5min进行接种。处理后将西洋参根置于25℃培养箱中暗培养，于接种后1～7天每天取样，以接种点为中心，用无菌解剖刀切下直径约5mm、厚度2mm的根组织，使用植物全基因组DNA快速提取试剂盒(FastDNAplant Kit，北京博迈德科技发展有限公司)和多功能样品均质器(
Figure BDA0002395299390000072
柏林，法国)根据说明书提取植物基因组DNA。
2、PCR检测
1)模板：以步骤1得到的西洋参根DNA为模板。
2)tef-1α基因部分片段的PCR扩增
引物对1EFF1/EFR1：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
3)PCR反应体系及程序与实施例一相同。
3、结果
PCR产物凝胶电泳结果表明，采用本发明的引物对1EFF1/EFR1(SEQ ID NO：1和SEQID NO：2)，能够从人工接种I.robusta 6天后在接种点初现根腐病病斑的西洋参根上扩增获得～350bp的目标条带(参见图4)，证明在病原菌侵染的早期可以扩增检测土赤壳属真菌，这对于植物病害的提早防治非常重要。
实施例四田间罹根腐病西洋参根中土赤壳属真菌的检测
1、植物组织总DNA的提取
采集田间罹根腐病西洋参病根，流水洗净，用灭菌的解剖刀切下病斑组织。以健康西洋参根的无病组织作为对照。采用三步消毒法对根组织进行表面消毒，依次用75％乙醇浸泡1min，3.25％次氯酸钠浸泡5min后用无菌水冲洗3次，再用75％乙醇浸泡0.5min。将根组织置于灭菌研钵中，加入液氮进行充分研磨，然后取少量装入冻存管，使用植物全基因组DNA快速提取试剂盒(FastDNA plant Kit，北京博迈德科技发展有限公司)和多功能样品均质器(
Figure BDA0002395299390000081
柏林，法国)根据说明书提取植物基因组DNA。
2、PCR检测
1)模板：以步骤1得到的西洋参根组织提取DNA为模板。
2)tef-1α基因部分片段的PCR扩增
引物对1EFF1/EFR1：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
3)PCR反应体系及程序与实施例一相同。
3、结果
采用含本发明的引物对1EFF1/EFR1(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)的试剂盒，能够从罹根腐病的西洋参根上扩增获得～350bp之间的目标条带，而从健康西洋参根上未扩增得到目标条带(参见图5)。
实施例五土壤中土赤壳菌的检测
1、土壤接种
实验材料：自然土壤采自中国医学科学院药用植物研究所试验田；接种用的土赤壳属真菌Ilyonectria孢子液为无菌水配置的含不同浓度I.robusta孢子液；菌丝体为I.robusta、I.communis、I.mors-panacis接种到PDA培养基平板上活化10天后，每种菌刮取3板培养皿上的菌丝。
处理一：用离心管称取自然土壤0.4g，分别加入100μL各浓度的I.robusta孢子液，配制成含水量约为20％的带菌土，土壤接菌量分别为7个孢子/g、7×10个孢子/g、7×102个孢子/g、7×103个孢子/g、7×104个孢子/g、7×105个孢子/g、7×106个孢子/g，利用MPbio土壤DNA提取试剂盒提取土壤总DNA。
处理二：将自然土壤0.5g灭菌后分别添加每个菌刮取3板培养皿上的I.robusta、I.communis、I.mors-panacis菌丝体，以未接种的土壤为对照(CK)，随后利用MPbio土壤DNA提取试剂盒提取土壤总DNA。
2、PCR检测
1)模板：以步骤1处理后的土壤DNA为模板。
2)tef-1α基因部分片段的PCR扩增
引物对1：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
引物对2：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2。
3)PCR反应体系及程序与实施例一相同。
3、结果
电泳结果表明，自然土壤接种孢子量达到7×104个孢子/g以上，分别采用含两对引物对的试剂盒均可用于土赤壳属真菌的检测(参见图6)。采用两对引物对均未从灭菌土壤(CK)中扩增出目标条带，添加I.robusta、I.communis、I.mors-panacis菌丝体后，两对引物对均可扩增出目标条带，引物对1扩增添加I.mors-panacis土壤样品的条带比引物对2的条带更明亮易读(参见图7)。因此，可以看出，以土壤的总DNA为模板可以对土赤壳属真菌进行检测，而且接种孢子量达到7×104个孢子/g以上可以检出。
结论：
从以上5个实施例可以看出，基于基因序列分析，筛选得到属间变异明显、属内相对保守的序列区域，设计出2对土赤壳属特异性引物，在属内具有通用性，采用含两对引物对的试剂盒，可以对植物、土壤、水中的土赤壳属真菌进行快速检测，为根病快速诊断、病情预测预报及防治措施的制订提供支持。

Claims (7)

1. 一种用于检测样本中土赤壳属真菌的方法，其特征在于使用引物对或包含所述引物对的试剂盒进行PCR扩增的步骤；所述引物对为：
(1)SEQ ID NO：1所示的正向引物EFF1；和
SEQ ID NO：2所示的反向引物EFR1；或
(2)SEQ ID NO：3所示的正向引物EFF2；和
SEQ ID NO：2所示的反向引物EFR1；
所述土赤壳属真菌选自Ilyonectria mors-panacis，Ilyonectria changbaiensis，Ilyonectria communis，Ilyonectria vredehoekensis，Ilyonectria robusta和Ilyonectria qitaiheensis。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物对能以样本的总DNA作为模板通过PCR扩增对土赤壳属真菌进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述样本为植物、土壤、水或微生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述试剂盒还包含用于进行PCR扩增的其他试剂。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于在所述PCR扩增中的退火温度为55-65℃。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于所述方法还包括检测350bp或240bp的PCR扩增片段的步骤。
7.权利要求1-6任一项的方法在检测样本中土赤壳属真菌中的应用。
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新丛赤壳属真菌DNA条形码研究;赵鹏等;《中国科学:生命科学》;20111231(第07期);565-576 *
草莓土赤壳菌根腐病病原鉴定及生物学特性;申光辉等;《西北农业学报》;20180702(第07期);114-122 *

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