CN117004751B - 一种茄镰孢菌(Fusarium solani)的分子检测靶标g7594及其应用 - Google Patents
一种茄镰孢菌(Fusarium solani)的分子检测靶标g7594及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种茄镰孢菌(Fusariumsolani)的检测新靶标g7594及其检测引物、检测方法和检测试剂盒，该检测靶标g7594的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示，编码该蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。同时，本发明还公开了特异性检测靶标g7594的引物及探针组合，其正向引物Fsg7594RPA‑F1序列如SEQ ID NO：3所示，其反向引物Fsg7594RPA‑R1序列如SEQ ID NO：4所示，ssDNArepoter序列如SEQ ID NO：5所示，FsCrRNA如SEQ ID NO：6所示。建立CRISPR‑Cas12a荧光检测，其特异性强，灵敏度高，证明g7594适合作为茄镰孢菌(Fusariumsolani)的检测靶标，从而实现对于植物上携带的有害病原茄镰孢菌F.solani实现分子检测。
Description
技术领域
本发明属于茄镰孢菌检测技术领域，具体涉及一种茄镰孢菌(Fusariu m solani)的特异性分子检测靶标g7594及其应用。
背景技术
茄镰孢菌(Fusarium solani)是镰刀菌属，可侵染水稻、小麦、玉米、芦笋、大蒜、洋葱等作物和杜鹃、油茶、茶花、雪松等木本植物，引起根腐病。茄镰孢菌为气生菌丝羊绒状，白色至浅灰色，大多数菌株不产生色素而呈奶油色，少数菌株菌落背面可产生紫色色素。产生大量假头生的小型分生孢子，椭圆形、卵形或肾形，大型孢子最宽处在中线上部，两端较钝，顶细胞稍弯，基细胞足跟明显或钝圆形，整个孢形态较短较胖，称为马特型。在气生菌丝上长出的产孢细胞为长筒形的单瓶梗。易产生蓝绿色粘孢团型分生孢子座。易产生球形，单生、对生或串生，直径5-10μm的厚垣孢子。层生镰孢菌的最适生长温度为25℃，35℃以上高温菌丝生长受抑制。该病害分布广、危害重且所致病史症状不易区别，防治困难，是植物生产中最严重的病害之一。当环境条件有利于根腐病发生时，可导致植物大幅度减产或者绝产。茄镰孢菌引起的根腐病是一类土传病害，在国内外均有发生。
为了阻止茄腐镰孢菌传播范围的不断扩大，使茄腐镰孢菌根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。茄腐镰孢菌的传统检测方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期作出诊断；从土壤中分离病原菌可能会同时得到多种病原菌和非病原菌，鉴定病原菌难度较大，而且采用传统检测方法难以估测病原菌量，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制，所以传统的检测方法逐步被分子检测技术所取代。近年来，一些茄镰孢菌的分子检测方法被开发出来。2017年Costa等利用翻译延伸因子(TEF-1α)序列设计茄镰孢菌(F.solani)特异性引物，采用普通PCR进行检测；2014年Murasosa等利用翻译延伸因子(TEF-1α)序列用实时荧光定量检测技术来检测茄镰孢菌(Fusarium solani)。目前开发的检测靶标方法中设计的引物的来源主要都是转录间隔区(ITS)或者TEF基因等保守基因，这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，镰孢菌的ITS序列、TEF基因等保守区域差异很小，以此为靶标设计的引物难以将不同种区分开来。不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。高精准检测技术的可靠性取决于特异性分子检测靶标。前人发掘的检测靶标，由于缺乏基因组学的支持，未经过系统筛选，造成检测结果的可信度低，因此挖掘在同种不同地域或者不同寄主来源的菌株间具较高保守性，而在种间具有明显差异性的保守基因作为检测靶标成为分子检测技术的关键。
本研究中的大量镰刀菌属菌株的全基因组被测序，全基因组序列的获得为发掘茄镰孢菌(F.solani)的检测靶标提供重要信息，对实现病原菌快速、高效、灵敏、准确的检测技术提供有力的保障。
发明内容
针对现有技术中茄镰孢菌(Fusarium solani)生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低、特异性检测靶标较少的问题，本发明提供一种新的茄镰孢菌(F.solani)的检测靶标g7594及基于新检测靶标的检测引物组合物及RPA-CRISPR-Cas12a检测技术。本发明的另一目的是提供上述茄镰孢菌(F.solani)的RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒。
第一方面，本发明提供了一种茄镰孢菌(Fusarium solani)的特异性检测靶标g7594，所述检测靶标的DNA序列如SEQ ID NO：1所示：ATGCATCTCAACCTTATTGCCTGGAACTTCTTCAACCAGGAGCTGTTCGCACCCAGAGGTCTCCGAGTCGAAATCGCGAAATTGGACGCTGTAGCTCGCTGTGCTCAGATGTCAATTCTTGACAGTGACGGCAAGATCGACAAGAACGCCTCGATCTTGCGTCCTTTGGAAGATGCTTTGGAGCAAACCTCCATGACTGCACAGCAACGAAGGCTTCAAGCACTTGAACCATGGATCGAGCCATTGGATCTCACGCCGTTTCCGGTGCATGTACCCGACAGCTTTATGGGCAAAATGCATGCTTCCACAAGTGAACGCCAACGAAAGAGAGAGGAAGAGAAAATGGCAAAGCACCGAGTCAAAGCGCATGAAGACCGGTCTAAGGATTTGCAAAAAGCGGGGGAAGACTATGAAAAGGACATCAGAAAACTTGAGAGAAAGACTATTAAGGCACAGAAGAAGCATACAAAGGACGAACAGAAGCTTGAAAAGAAGCTGGGGAAGCTGGAGCAACGAAAAGAGAAACACGAGGAGGGCTATCAGAAGGATATAAGTAAGGCGAATAAAAATTGGCGAAAGGATGACAAGGAAGAAAAGAGCGTGAGAAAGGTGTTGTGGATTCTTATTAGATCTCTAGGTAATATCCCTACTTAG
另一方面，本发明提供了一种茄镰孢菌的特异性检测靶标g7594，所述检测靶标的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示：
MHLNLIAWNFFNQELFAPRGLRVEIAKLDAVARCAQMSILDSDGKIDKNASILRPLEDALEQTSMTAQQRRLQALEPWIEPLDLTPFPVHVPDSFMGKMHASTSERQRKREEEKMAKHRVKAHEDRSKDLQKAGEDYEKDIRKLERKTIKAQKKHTKDEQKLEKKLGKLEQRKEKHEEGYQKDISKANKNWRKDDKEEKSVRKVLWILIRSLGNIPT*
另一方面，本发明还提供了一种检测茄镰孢菌的特异性检测靶标g7594的引物和探针组合，所述引物组合包括，序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物Fsg7594RPA-F1，序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物Fsg7594RPA-R1，序列如SEQ ID NO：5所示的ssDNA repoter，序列如SEQ ID NO：6所示的FsCrRNA。
Fsg7594RPA-F1：TCGATCTTGCGTCCTTTGGAAGATGCTTTGGAG(SEQ ID NO.3)；
Fsg7594RPA-R1：GACTCGGTGCTTTGCCATTTTCTCTTCCTCTC(SEQ ID NO.4)
ssDNA repoter：5’-TTATT-3’(SEQ ID NO.5)，5’端修饰6-FAM，3’修饰BHQ1FsCrRNA：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUUGGCGUUCACUUGUGGAA(SEQ ID NO.6)
另一方面，本发明还提供了所述特异性检测靶标g7594所述的引物、探针组合在检测茄镰孢菌中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种基于CRISPR-Cas12a快速可视化检测茄镰孢菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以茄镰孢菌(F.solani)的基因组中为g7594，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示，为靶基因进行重组酶聚合酶扩增；
(2)使用步骤(1)获取的重组酶聚合酶扩增(RPA)产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应；
(3)对步骤(2)的反应体系进行可视化检测。
在一个优选的实施方案中，所述RPA扩增反应使用的上游引物Fsg7594RPA-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物Fsg7594RPA-R1的序列如SEQ ID NO.4所示。
在一个优选的实施方案中，步骤(2)中，所述RPA扩增50μL的试剂体系包含：25μLReaction Buffer，4μL 10μM正/反向引物，2μL的模板DNA，3μL的启动剂，16μL的DEPC水，反应条件：37℃扩增15min。
在一个优选的实施方案中，步骤(2)中，所述50μL CRISPR/Cas12a检测体系包含步骤(1)中2μL RPA扩增产物，5μL缓冲液、1μL Lba Cas12a(2μM)、3μL FsCrRNA(1μM)、1μLssDNArepoter(10μM)、38μL DEPC水，反应条件：37℃反应15min。
在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述单链DNA荧光探针的序列如SEQ ID NO.5所示，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1。
在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述FsCrRNA引物序列如SEQ ID NO.6所示。
在一个优选的实施方案中，所述荧光检测采用470nm的BluEye蓝光切胶仪观察荧光。
第二方面，本发明还提供了基于CRISPR-Cas12a快速可视化检测茄镰孢菌(F.solani)的试剂盒，所述试剂盒包括RPA扩增试剂和CRISPR-Cas12a检测试剂，所述RPA扩增试剂中含有RPA扩增引物对，所述RPA扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示，CRISPR/Cas12a检测试剂中含有的单链DNA荧光探针序列如SEQ ID No.5所示，含有的CrRNA引物序列如SEQ ID No.6所示。
在一个优选的实施方案中，步骤(2)中，所述RPA扩增试剂含有：RPA反应液1mL(成分：556μL缓冲液、89μL引物组、355μL DEPC水和70μL启动剂)，可至少使用20次。
在一个优选的实施方案中，CRISPR-Cas12a检测试剂含有：CRISPR-Cas12a检测溶液1mL(成分：105μL缓冲液、21μL Cas12a(2μM)、63μL FsCrRNA(1μM)、21μL ssDNArepoter(10μM)、790μLDEPC水)，可至少使用20次。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明提供了一个新的且高信赖度特异性茄镰孢菌分子检测靶标g7594，为茄镰孢菌的检测提供了一个新的检测途径。
2)采用本发明提供的CRISPR-Cas12a检测方法对茄镰孢菌菌株和其他镰刀菌、真菌以及松材线虫、病原卵菌等进行检测，结果显示仅有茄镰孢菌的检测结果为阳性，能够产生荧光；同时，经过特异性实验证明，CRISPR-Cas12a法检测茄镰孢菌基因组DNA的灵敏度为1pg·μL-1。
3)本发明为茄镰孢菌(Fusarium solani)的检测提供CRISPR-Cas12a检测方法和技术平台仅需30min(15min的RPA扩增和15min的CRISPR-Cas12a反应)即可完成快速可视化检测。在病害侵染初期鉴定出病原物，本发明可以用于带菌植株组织中茄镰孢菌的快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是CRISPR-Cas12a荧光检测系统工作流程和原理示意图。
图2是茄镰孢菌(F.solani)新检测靶标g7594设计的特异性引物在其他真菌和卵菌中的CRISPR-Cas12a检测特异性验证图；选择与茄镰孢菌(Fusarium solani)不同种(尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、层出镰孢菌(F.proliferatum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、藤仓镰孢菌(Fusariumfujikuroi)、轮枝镰孢菌(Fusariumverticillioides)、松脂溃疡菌(Fusarium circinatum)等)和不同属的菌松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)、宽雄腐霉(Pythium dissotocum)、刺腐霉(Pythiumspinosum)、葡萄溃疡病菌(Botryospaeria dothidea)、暹罗炭疽菌(Colletotrichumsiamense)、旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)等的DNA作为模板，结果表明茄镰孢菌(F.solani)菌株可特异地通过470nm的BluEye蓝光切胶仪观察绿色荧光，而其余真菌或卵菌未产生绿色荧光。
图3是基于茄镰孢菌(F.solani)新检测靶标g7594设计的检测引物组合的灵敏度验证电泳图，结果显示该引物的检测灵敏度能达到1pg.μL-1。
图4为人工接种茄镰孢菌(F.solani)的感病松针茎秆图及CRISPR-Cas12a检测结果图。图4A为人工接种茄镰孢菌(F.solani)的感病松针，其中图4A中1是空白对照的松针茎秆，4A中2-4是人工接种松针茄镰孢菌(F.sol ani)致病的松针茎秆；图4B为人工接种松针茎秆病原菌茄镰孢菌(F.solani)的发病松针的CRISPR-Cas12a检测结果。图4B为基于RPA-CRISPR-Cas12a检测结果。从左边到右边分别为：1，茄镰孢菌(F.solani)病原菌作为阳性对照；2-4，人工接种茄镰孢菌(F.solani)的松针(Cedrus dedara)提取的DN A；5，人工接种琼脂块的松针提取的DNA；6，NC(阴性对照)。阳性对照和人工接种茄镰孢菌菌的松针提取的DNA通过470nm的BluEye蓝光切胶仪均能观察到绿色荧光。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本研究根据镰孢菌部分属基因组序列(F.solani、F.proliferatum、F.circinatum、F.o xysporum、F.graminearum、、F.fujikuroi、F.verticillioides、F.odoratissimum、F.vanettenii、F.virguliforme、F.clavum、F.mangiferae、F.cerealis、F.redolens、F.sacchari、F.flagelliforme、F.sporotrichioides等共计20种镰孢菌属的全基因组序列分析，通过Blast序列搜索，序列提取、比对与分析，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标。通过全基因组比对，共计获得茄镰孢菌(F.solani)特异性检测靶标1000个以上；随机从茄镰孢菌(F.solani)1000多个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因，设计了并筛选特异性引物，表1列出其余4个靶标基因(表1)。
表1茄镰孢菌(Fusarium solani)病原菌其余4个代筛选基因序列表
2、RPA扩增
RPA扩增50μL的试剂体系包含：25μL Reaction Buffer，2μL 10μM正/反向引物，2μL的模板DNA，2μL的启动剂，16μL的DEPC水，反应条件：37℃扩增15min。RPA扩增产物使用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。
3、CRISPR荧光检测反应体系
CRISPR-Cas12a荧光检测反应体系50μL包含：1μL的2μM Lba Cas12a，3μL的1μMCrRNA，5μL的10×ReactionBuffer，1μL的10μM单链DNA荧光探针以及DEPC水补充至50μL。
4、CRISPR检测结果
使用470nm的BluEye蓝光切胶仪观察荧光。若有绿色荧光发出则结果为阳性，若无绿色荧光发出，则结果为阴性。对候选靶标进行筛选，每个实验至少重复三次。
实施例2
为了验证茄镰孢菌(F.solani)的检测的特异性，本实施例以茄镰孢菌(F.solani)菌株和病原真菌以及其它卵菌为供试材料(表2)，采用CTAB法提取发病组织中茄镰孢菌(F.solani)的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc(pH5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg/mLRNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。
表2用于茄镰孢菌RPA-CRISPR-Cas12a检测的真菌和卵菌菌株
按照实施例1的方法进行检测，基于g7594靶标建立的CRISPR-Cas12a检测技术如图2所示，茄镰孢菌菌株菌株均可特异地通过470nm的BluEye蓝光切胶仪观察绿色荧光，而其余真菌或卵菌未产生绿色荧光。选择与茄镰孢菌(Fusarium solani)不同种(尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、藤仓镰孢菌(Fusariumfujikuroi)、轮枝镰孢菌(Fusariumverticillioides)、松脂溃疡菌(Fusarium circinatum)等)和不同属的菌松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、宽雄腐霉(Pythium dissotocum)、刺腐霉(Pythiumspinosum)、葡萄溃疡病菌(Botryospaeria dothidea)、暹罗炭疽菌(Colletotrichumsiamense)、旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)等的DNA作为模板，均不能观察到绿色荧光。结果表明基于g7594靶标建立的RPA-CRISPR-Cas12a荧光检测系统具有良好的特异性。其余靶标如g8314、g9158等，经RPA扩增后，其特异性较差。图2结果证明基于g7594靶标所设计的特异性引物具有种的特异性，g7594靶标是一个特异性较强的新检测靶标，这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织中茄镰孢菌的检测鉴定。
实施例3
用茄镰孢菌(Fusarium solani)的菌株的不同浓度的基因组DNA作为扩增模板，进行RPA-CRISPR-Cas12a扩增反应，使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度为100ng.μL-1。将其依次稀释为10ng.μL-1、1ng.μL-1、100pg.μL-1、10pg.μL-1、1pg.μL-1、100fg.μL-1、10fg.μL-11fg.μL-1，进行扩增DNA。对不同浓度的DNA进行RPA-CRISPR-Cas12a检测，结果如图3所示，基于g7594靶标建立的CRISPR-Cas12a的荧光检测系统可以检测到1pg·μL-1的茄镰孢菌。
实施例4
当用于发病组织中存在茄镰孢菌(F.solani)时，采用NaOH快速裂解法提取茄镰孢菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mMTris(pH 8.0)，混匀后取1μL直接用于RPA-CRISPR-Cas12a反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无抑制物存在。
采用NaOH碱裂解法提取接种茄镰孢菌(F.solani)菌的发病松针组织的DNA，将其作为模板用于RPA-CRISPR-Cas12a扩增。取1uL DNA溶液，按实施例2的方法，进行RPA-CRISPR-Cas12a反应。图4A为人工接种茄镰孢菌的感病松针，其中图4A中1是空白对照的松针茎秆，4A中2-4是人工接种松针茄镰孢菌致病的松针茎秆；图4B为人工接种松针茎秆病原菌茄镰孢菌(F.solani)的发病松针的CRISPR-Cas12a检测结果。图4B为基于RPA-CRISPR-Cas12a检测结果。从左边到右边分别为：1，松树脂溃疡病病原菌作为阳性对照；2-4，人工接种茄镰孢菌(F.solani)的松针提取的DNA；5，人工接种琼脂块的松针提取的DNA；6，NC(阴性对照)。阳性对照和人工接种茄镰孢菌菌的松针提取的DNA通过470nm的BluEye蓝光切胶仪均能观察到绿色荧光。因此，基于RPA-CRISPR-Cas12a对茄镰孢菌(F.sol ani)的荧光检测方法具有好的灵敏度以及大大缩短了检测所需要的时间。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (6)
1.一种基于CRISPR-Cas12a快速可视化检测茄镰孢菌(Fusarium solani)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以茄镰孢菌(Fusarium solani)的基因组中g7594为靶基因进行重组酶聚合酶RPA扩增，所述g7594的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组酶聚合酶RPA扩增采用序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物Fsg7594RPA-F1和序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物Fsg7594RPA-R1；
(2)使用步骤(1)获取的重组酶聚合酶扩增RPA产物，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应，所述单链DNA探针的核苷酸序列为：5’-TTATT-3’，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1，所述crRNA分子序列如SEQ ID NO.6所示；
(3)对步骤(2)的反应体系进行可视化荧光反应检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述RPA扩增采用50μL的试剂体系，包含：25μL ReactionBuffer，4μL 10μM正/反向引物，2μL的模板DNA，3μL的启动剂，16μL的DEPC水，反应条件：37℃扩增15min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CRISPR-Cas12a技术检测体系包含步骤(1)RPA扩增产物，2μM的Lba Cas12a，1μM的CrRNA，10×ReactionBuffer，10μM的单链DNA探针以及DEPC水，反应条件：37℃反应15min。
4.基于CRISPR-Cas12a快速可视化检测茄镰孢菌(Fusarium solani)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA扩增试剂和CRISPR-Cas12a检测试剂，所述RPA扩增试剂中含有RPA扩增引物对，所述RPA扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，CRISPR/Cas12a检测试剂中含有单链DNA探针序列和CrRNA分子，所述单链DNA探针的核苷酸序列为：5’-TTATT-3’，所述单链DNA探针在5’端被标记荧光基团6-FAM，在3’端被标记荧光淬灭基团BHQ1，所述CrRNA分子的序列如SEQ ID No.6所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂含有：RPA反应液1mL，成分：556μL缓冲液、89μL引物组、355μLddH2O和70μL启动剂，至少使用20次。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，CRISP-Cas12a检测试剂包含有：CRISPR-Cas12a检测溶液1mL，成分：105μL缓冲液、21μL浓度为2μM的Cas12a、63μL浓度为1μM的CrRNA、21μL浓度为10μM的单链DNA探针、790μL ddH2O，至少使用20次。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109825628A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-05-31 | 南京林业大学 | 一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的引物和探针组合及其应用 |
| CN113667765A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-11-19 | 浙江大学 | 一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测金黄色葡萄球菌的方法 |
| CN114032331A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-02-11 | 南京林业大学 | 一种层出镰孢菌的特异性检测靶标fpro_09882及其应用 |
| CN114807311A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-29 | 南京林业大学 | 基于CRISPR-Cas12a检测松树脂溃疡病原菌的方法及应用 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109825628A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-05-31 | 南京林业大学 | 一种基于rpa-侧流层析技术检测茄腐镰孢菌的引物和探针组合及其应用 |
| CN113667765A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-11-19 | 浙江大学 | 一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测金黄色葡萄球菌的方法 |
| CN114032331A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-02-11 | 南京林业大学 | 一种层出镰孢菌的特异性检测靶标fpro_09882及其应用 |
| CN114807311A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-29 | 南京林业大学 | 基于CRISPR-Cas12a检测松树脂溃疡病原菌的方法及应用 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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