CN111996274B - 一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法 - Google Patents
一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000‑10000个样品的同时检测，极大方便了大规模病原菌样品检测的需要，同时样品的检测成本也大大降低了。该发明可以用于病害在田间土壤、作物等中的定量监测，为预测和预防病害流行、传染提供可靠数据，为病害的早期预测预报提供数据支撑。因此，该方法适用于植物病害诊断和预测预报领域广泛推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及真菌定量检测技术领域，特别是涉及一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。
背景技术
植物病害当中真菌是非常重要的一个类群，常引起植株根茎叶部病害，如腐霉菌(Pythium sp.)引起苗腐和猝倒病、丝核菌(Rhizoctonia sp.)引起立枯病，尖孢镰(Fusarium oxysporum)、黄萎轮枝孢(Verticillium alboatum)等引起的萎蔫、枯死等。专业人员可以通过病害症状识别、病原真菌形态和培养性状观察以及生物学特性测定等方法鉴定和鉴别病害的种类，但是，病害症状发生后的识别往往意味着病害已经发生，防治的时效性已经大打折扣，并且这种鉴定方式的准确性和可靠性在很大程度也会因人而异，对形态和生物学特性相近真菌容易造成误判，因此，对研究者的专业技能与分类知识的掌握程度等要求较高，在病害早期诊断、检疫、监测、预测预报和病害防治等方面存在着很大的局限性。
分子诊断技术是植物真菌病害诊断技术的未来发展方向，各种基于PCR的分子检测技术由于具有灵敏、快速及特异等特点，传统PCR技术对模板DNA的来源没有特异性要求，扩增效率高，但扩增过程可能存在污染问题，造成假阳性风险。最后，病原菌在土壤中的密度是其是否具有致病性的衡量标准，而传统PCR技术分子诊断技术对病原菌的定量和定位仍然存在困难；当前尤其是多数量真菌的同时检测技术和定量技术的发展为该技术的完善注入了新的活力，基于荧光定量PCR定量检测技术多限于对一个目标病原真菌的检测，灵敏度高、快速、单一性强，但缺少多数量性，同时易污染，造成假阳性风险。
高通量测序可以揭示样品中真菌菌群的多样性，并获得特定类群真菌在群落中的相对丰度，但是却无法根据reads估算出其绝对丰度和变化，因此，对样品中病原菌诊断存在无法准确定量的问题。
发明内容
本发明就是针对目前植物真菌病害诊断中传统诊断方法和分子诊断技术存在的问题而提供一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法。本发明在高通量测序过程中引入了内标质粒，实现了对待测样本的定量检测，可以一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，其最大的优点在于高通量，依据测序深度的提高可以实现1000-10000个样品的同时检测，适用于农技部门对植物真菌、细菌等病害在田间土壤、作物等中的定量监测。
本发明的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法技术方案为，在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000-10000个样品的同时检测。
所述的一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法，具体步骤为：
(1)根据测定的目标植物病原菌设计、优化特异性引物作为高通量测序过程中文库制备和测序引物；特异性引物扩增目标区域可以有效识别种水平上的变异特征；
(2)根据特异性引物扩增序列的长度和GC含量特点，使用随机DNA生成器设计内标序列，内标序列含有特异性引物结合位点，并将其克隆到质粒pMD-18T中，形成内标质粒；
设计合成内标质粒，具有以下特征：
(a)含有病原真菌特异性引物结合位点，并能利用特异性引物PCR扩增出GC含量和长度与目标病原菌基因相似的DNA片段；
(b)内标质粒方便提取能够大量获得。
(3)在样品基因组DNA提取之前，将恒定量的内标质粒添加到样品中，并使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离；
(4)通过PCR共扩增、共测序。
收集PCR扩增样品，并等量混合即为高通量测序前处理样品，根据混样数量确定测序深度，推荐每500-1000样品混合测1G数据量。
还包括，(5)测序获得的样品病原菌丰度通过引入内标reads读数进行标准化，从而定量获得测序样品中病原菌的丰度信息。
在PCR共扩增过程中的引入Barcodes序列，不同样品使用不同的barcodes序列，不同PCR产物混合测样后可以通过barcodes序列对样品进行分拆。通常来讲，1000reads以上的样品测序读数即能比较准确的反映测序样品中特定病原菌的绝对丰度，因此在1G测序深度条件下即可对多达上千个微生物样品进行定量检测分析。并且伴随着测序深度的扩展，其样品数还可以进一步增加，极大方便了大规模病原菌样品检测的需要，同时样品的检测成本也大大降低了。
采集测定样品，主要用于土壤中病原微生物分析，但不限于土壤、也可以是植物根、茎、叶等组织样品，推荐使用土壤基因组提取试剂盒用于样品基因组DNA提取。
步骤(3)中在样品基因组DNA提取之前，按每克样品加入10-500pg内标质粒的量添加到样品中，使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离。
步骤(4)中，PCR扩增，使用病原真菌特异性引物用于样品的PCR扩增，在特异引物的正向引物的5’端引入8bp的随机DNA片段，作为barcodes序列用于测序后不同样本的分拆，不同样品使用含有不同barcode序列的正向引物，反向引物不含barcode序列。
测样样品建库使用NEB
UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒建库方法，具体流程参考试剂盒。建库完成后对文库质量进行检测，质量合格进行上机测序。
测样样品建库流程如下(使用NEB
UltraTMDNA Library Prep Kit forIllumina试剂盒建库方法)：
(1)DNA片段末端修复(末端补平和3'端加A尾)
a)将NEBNext Ultra End Prep Enzyme mix和End Repair Reaction Buffer(10X)置于冰上解冻。
b)每个样品(以60μl打断的DNA片段为例)中加入以下试剂。
c)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
d)将上述PCR管置于PCR仪，热盖设置为≥75℃，并运行以下程序：
30min 20℃
30min 65℃
Hold at 4℃
(2)连接接头
a)将NEBNext Ultra Blunt/TA Ligase Master Mix、Ligation Enhancer 和Adaptor置于冰上解冻。等上一步修复结束后直接按下表加入各反应混合物。
b)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
c)将上述PCR管置于PCR仪，并运行以下程序：
20℃ 15min
Hold at 4℃
(3)磁珠纯化连接产物
a)涡旋震荡混匀Agencourt AMPure XP Clean Beads。
b)吸取80ul(0.8X)Agencourt AMPure XP Clean Beads至100ul PCR产物中(补水至100ul)，使用移液器吹打10次混匀。室温孵育5min。
c)将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，移除上清。
d)保持EP管处于磁力架中，加入200ul新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，移除上清。
e)重复步骤5，总计漂洗两次。
f)保持EP管处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min。
g)将EP管从磁力架中取出，加入21ul灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打混匀。
h)打充分混匀，于室温放置2min。将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，小心吸20ul上清至新EP管中，-20℃保存。
(4)文库扩增
该步是将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1)于无菌管中(200ul)配制下表所示反应体系。
2)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
3)将PCR管置于PCR仪中进行扩增，反应程序如下：
(5)扩增产物磁珠纯化
a)涡旋震荡混匀Agencourt AMPure XP Clean Beads。
b)吸取40ul(0.8X)Agencourt AMPure XP Clean Beads至50ul PCR产物中(补水至50ul)，使用移液器吹打10次混匀。室温孵育5min。
c)将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，移除上清。
d)保持EP管处于磁力架中，加入200ul新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，移除上清。
e)重复步骤5，总计漂洗两次。
f)保持EP管处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min。
g)将EP管从磁力架中取出，加入31ul灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打混匀。
h)打充分混匀，于室温放置2min。将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，小心吸取30ul上清至新EP管中，-20℃保存。
纯化后扩增产物经过质量控制即可用于测序。
进行测序，得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，然后根据barcode序列对样品进行分拆，并对序列质量进行质控和过滤，然后进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，将所有优化序列比对至OTU代表序列，选出与代表序列相似性在99％以上的序列，生成OTU表格，对OTU进行物种注释，使用Blast比对NCBI NT数据库，得到每个OTU对应的物种分类信息，同时根据内标read读数，对OUT表进行标准化，根据内标计算每种病原菌在样品中的绝对丰度；可用于大量样品中病原菌的鉴定和定量分析。测序样品规模可达1000-10000份/次。
公式如下：
OTUAQ表示病原菌的绝对量(指特定基因拷贝数)
NAQ表示引入内标的绝对量(指特定基因拷贝数)
OUT表示病原菌reads数
NS表示内标reads数。
高通量测序用于小麦茎基腐病的镰孢菌属病原菌的大规模定量检测方法，
(1)用于高通量测序的镰孢菌属病原菌的特异性引物，其特征序列如下：
正向引物Fus-efF：TCCRATGTGCTGACATRCTT(SEQ ID No.1)；
反向引物Fus-efR：GCGGCTTCCTATTGACAGGT(SEQ ID No.2)；
该序列可以扩增引起小麦茎基腐病的几种主要镰孢菌，包括假禾谷镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌，扩增区域为TEF-1α基因序列，通过测序分辨不同种类镰孢菌；
(2)小麦茎基腐病的镰孢菌属病原菌的内标质粒，含有SEQ ID No.4所示片段的质粒，该片段含有权利要求1所述的镰孢菌属病原菌的特异性引物的结合位点，此序列不唯一，SEQ ID No.4仅为优选之一；
(3)小麦茎基腐病的镰孢菌属病原菌，其特征序列如下：
Fus-efF(Barcodes)：NNNNNNNNTCCRATGTGCTGACATRCTT(N表示碱基A、C、T或G)(SEQID No.3)；
(4)扩增小麦茎基腐病的镰孢菌属病原菌，PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s；45℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环，95℃变性10s；55℃退火30s，72℃延伸30s，共15-35个循环；72℃延伸5min，循环结束；
用于5000-20000规模的样品混合测序使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在样品中引入内标序列对来自高通量测序的扩增子读数进行标准化来克服目前植物真菌病害诊断中传统诊断方法和分子诊断技术存在的问题，同时，可以根据测定的目标植物病原菌设计、优化特异性引物，也可以采用多种病原菌的通用型引物用于高通量测序，由于引物专一性较强可以大大减少非靶标菌扩增，所以测序样品reads中序列以病原菌目标序列为主，通常1000左右的reads就可以比较准确反映病原菌的绝对量。因此在1G测序深度条件下即可对多达上千个微生物样品进行定量检测分析。并且伴随着测序深度的扩展，其样品数还可以进一步增加，极大方便了大规模病原菌样品检测的需要，同时样品的检测成本也大大降低了。本发明解决了荧光定量PCR的污染问题、传统PCR和多重PCR诊断无法对样品中病原真菌定量和定位的问题，可以用于病害在田间土壤、作物等中的定量监测，为预测和预防病害流行、传染提供可靠数据，为病害的早期预测预报提供数据支撑。特别方便于各级植保系统对于土传病害的早期预测预报。
1)本发明适用样本范围广，既可以是土壤样品、也可以是根、茎、叶等植物组织，既可以用于发病后样品的病原鉴定、也可以用于早期的病原丰度监测，采用病原特异性引物，检测结果精确度高。
2)本发明通量高，可以实现病原样本的大规模检测、监测。
附图说明
图1所示为高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测流程图；
图2所示为几种镰孢菌的TEF-1α的PCR产物同源性比对结果。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面以引起小麦茎基腐病的镰孢菌为例，结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
小麦茎基腐病是多种镰孢菌为主病原菌复合侵染性土传病害，在澳大利亚、美国等多个国家发生，近几年在我国也快速增长，目前主要发生在玉米小麦两熟轮作、秙杆还田较多的河南、河北、山东、安徽、江苏等地。2012年河南省率先报道茎基腐病，2016年该病在全国多个省份大发生，对小麦生产造成了严重的威胁。近年来，该病已经上升为山东、河南等我国小麦重要产区生产上的主要病害。此外，小麦茎基腐病菌侵染后还会产生真菌毒素，影响粮食品质，已经严重威胁我国小麦的安全生产。因此，对小麦茎基腐病病原菌的早期监测、分离鉴定对了解不同地区病害的病原菌组成、有效防治药剂的筛选以及早期防治，均有积极的借鉴意义。
实施例1
引起小麦茎基腐病的镰孢菌引物的设计与合成
依据镰孢菌的TEF-1α的PCR产物同源性比对(如说明书附图图2所示，图2仅显示部分结果，并不是全部)，根据镰孢菌的TEF-1α基因设计得到用于特异性扩增镰孢菌的引物，引物特征具体如下：
正向引物Fus-efF：5’-TCCRATGTGCTGACATRCTT-3’(SEQ ID No.1)；
反向引物Fus-efR：5’-GCGGCTTCCTATTGACAGGT-3’(SEQ ID No.2)。
该序列可以扩增引起小麦茎基腐病的几种主要镰孢菌，如假禾谷镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌等，理论扩增片段长度为330-350bp。
实施例2
正向引物Fus-efF引入barcode序列
引入barcode的碱基数依据需要测定的样品数量来确定，采用6bp的barcode对应1000个以下样本测序；7bp对应1000-5000个样本测序；8个对应5000-20000个样本测序。本实施采用8bp的barcode引入正向引物的5’端，其特征如下：
Fus-efF(barcode)：NNNNNNNNTCCRATGTGCTGACATRCTT(N表示A、T、G、C)
实施例3
内标质粒的合成
根据实施例1中引物扩增镰孢菌的TEF-1α基因的长度和GC含量特点，使用随机DNA生成器设计内标序列，内标序列含有特异性引物结合位点，并将其克隆到质粒pMD-18T中，形成内标质粒。序列特征如下：
TCCGATGTGCTGACATGCTTGGCACTGTGCGAAGTGTCCGGTTTAAGACTTAATGAGCCCATCGAAACGGGACGCCAGCACCCATTGTTTTTTCAATACATTTTTTTAAAACGAAACGCAAAGAATTCTAGCCTTATCGGTGGATCACTCGGCTCGTAGTTCGATGAAGAACGCAGCCAACAGCGATATTTAGTGTGAACTGCAGAAACTTTGAACACAAAACCTTCGAATGTACATGACGCCTGAGGTGTTAAATTACGTCCCTGCCCTTTGTAGCGCATCGAAAATTTGCACTATGCTTACAACAAGGCTGCCCACCACTTTGCTCAGCCTCGCCAACCTGTCAATAGGAAGCCGC
下划线部分为镰孢菌特异性引物结合位点。
实施例4
样本的前处理
采集测定样品，主要用于引起小麦茎基腐病的土壤镰孢菌的分析，但不限于土壤、也可以是植物根、茎、叶等组织样品，在基因组DNA提取之前，按每克样品加入10-500pg内标质粒的量添加到样品中，然后使用E.Z.N.A.soil DNA kit(OMEGA,USA)提取样品基因组DNA，使样品中的微生物DNA和人工合成的内标DNA共分离，放于-20℃保存备用。
利用带barcode序列的正向引物Fus-efF(barcode)和反向引物Fus-efR进行常规PCR扩增，反应体系20μL，2×Taq PCR Master Mix 10μL，Fus-efF(barcode)/Fus-efR引物各0.5μL，样本基因组DNA1μL，ddH2O补足至20μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性10s；45℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环，94℃变性10s；55℃退火30s，72℃延伸30s，共15-35个循环；72℃延伸5min，循环结束。将所有样品按照1:1的比例进行混合，混合后充分震荡均匀，用于后续的样品建库与测序。
实施例5
高通量测序混合测样样品建库流程如下(使用NEB
UltraTMDNA LibraryPrep Kit for Illumina试剂盒建库方法)：
(1)DNA片段末端修复(末端补平和3'端加A尾)
a)将NEBNext Ultra End Prep Enzyme mix和End Repair Reaction Buffer(10X)置于冰上解冻。
b)每个样品(以60μl打断的DNA片段为例)中加入以下试剂。
c)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
d)将上述PCR管置于PCR仪，热盖设置为≥75℃，并运行以下程序：
30min 20℃
30min 65℃
Hold at 4℃
(2)连接接头
a)将NEBNext Ultra Blunt/TA Ligase Master Mix、Ligation Enhancer和Adaptor置于冰上解冻。等上一步修复结束后直接按下表加入各反应混合物。
b)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
c)将上述PCR管置于PCR仪，并运行以下程序：
20℃ 15min
Hold at 4℃
(3)磁珠纯化连接产物
a)涡旋震荡混匀Agencourt AMPure XP Clean Beads。
b)吸取80ul(0.8X)Agencourt AMPure XP Clean Beads至100ul PCR产物中(补水至100ul)，使用移液器吹打10次混匀。室温孵育5min。
c)将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，移除上清。
d)保持EP管处于磁力架中，加入200ul新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，移除上清。
e)重复步骤5，总计漂洗两次。
f)保持EP管处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min。
g)将EP管从磁力架中取出，加入21ul灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打混匀。
h)打充分混匀，于室温放置2min。将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，小心吸20ul上清至新EP管中，-20℃保存。
(4)文库扩增
该步是将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1)于无菌管中(200ul)配制下表所示反应体系。
2)使用移液器轻轻吹打或震荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
3)将PCR管置于PCR仪中进行扩增，反应程序如下：
(5)扩增产物磁珠纯化
a)涡旋震荡混匀Agencourt AMPure XP Clean Beads。
b)吸取40ul(0.8X)Agencourt AMPure XP Clean Beads至50ul PCR产物中(补水至50ul)，使用移液器吹打10次混匀。室温孵育5min。
c)将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，移除上清。
d)保持EP管处于磁力架中，加入200ul新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，移除上清。
e)重复步骤5，总计漂洗两次。
f)保持EP管处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min。
g)将EP管从磁力架中取出，加入31ul灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打混匀。
h)打充分混匀，于室温放置2min。将反应管短暂离心并置于磁力架中静置。待溶液澄清(约5min)，小心吸取30ul上清至新EP管中，-20℃保存。
纯化后扩增产物经过质量控制即可用于测序。
实施例6
文库质检合格后，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序，测序深度1G。得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，然后根据barcode序列对样品进行分拆，并对序列质量进行质控和过滤，然后进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，将所有优化序列比对至OTU代表序列(表1)，选出与代表序列相似性在99％以上的序列，生成OTU表格，对OTU进行物种注释，使用Blast比对NCBI NT数据库，得到每个OTU对应的物种分类信息，同时根据内标read读数，对OUT表进行标准化，根据内标计算每种病原菌在样品中的绝对丰度(表2)。
表1高通量测序后部分样品的read读数
*spike为内标
计算公式如下：
OTUAQ表示病原菌的绝对量(指特定基因拷贝数)
NAQ表示引入内标的绝对量(指特定基因拷贝数)
OUT表示病原菌reads数
NS表示内标reads数；
根据内标质粒大小，每1ng内标质粒含tef基因的拷贝数为3.6×108，按照上述计算公式(1)可以将表1中不同样本的reads读数换算获得不同样本的镰孢菌拷贝数，结果如表2。
表2高通量测序法对22份不同小麦根际土壤中引起小麦茎基腐病的镰孢菌的检测结果
以上仅是应用本发明在小麦茎基腐病病原菌的检测方面的一种优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明除应用于植物病原真菌外，也适用于样本中病原细菌、线虫等生物的检测与定量分析，特别适用于对样品中特定类群微生物的检测和定量分析。
序列表
<110> 山东省科学院生态研究所
<120> 一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
tccratgtgc tgacatrctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
gcggcttcct attgacaggt 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
nnnnnnnntc cratgtgctg acatrctt 28
<210> 4
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 4
tccgatgtgc tgacatgctt ggcactgtgc gaagtgtccg gtttaagact taatgagccc 60
atcgaaacgg gacgccagca cccattgttt tttcaataca tttttttaaa acgaaacgca 120
aagaattcta gccttatcgg tggatcactc ggctcgtagt tcgatgaaga acgcagccaa 180
cagcgatatt tagtgtgaac tgcagaaact ttgaacacaa aaccttcgaa tgtacatgac 240
gcctgaggtg ttaaattacg tccctgccct ttgtagcgca tcgaaaattt gcactatgct 300
tacaacaagg ctgcccacca ctttgctcag cctcgccaac ctgtcaatag gaagccgc 358
Claims (7)
1.一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，在高通量测序过程中引入了内标质粒，一次性对大规模样品中病原菌种类、丰度以及种群结构进行检测，实现1000-10000个样品的同时检测；
具体步骤为：
(1)根据测定的目标植物病原菌设计、优化特异性引物作为高通量测序过程中文库制备和测序的引物；
(2)根据特异性引物扩增序列的长度和GC含量特点，使用随机DNA生成器设计内标序列，内标序列含有特异性引物结合位点，并将其克隆到质粒pMD-18T中，形成内标质粒，所述内标序列如SEQ ID No.4所示；
(3)在样品基因组DNA提取之前，将恒定量的内标质粒添加到样品中，并使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离；
(4)使用病原真菌特异性引物对步骤3)分离的DNA进行PCR共扩增，用于后续样品的建库和测序，所述特异性引物的正向引物的5’端引入8bp的随机DNA片段，作为barcodes序列用于测序后不同样本的分拆，不同样品使用含有不同barcode序列的正向引物，反向引物不含barcode序列；
所述特异性引物序列为：
正向引物Fus-efF：TCCRATGTGCTGACATRCTT，SEQ ID No.1，
反向引物Fus-efR：GCGGCTTCCTATTGACAGGT，SEQ ID No.2，
该引物扩增的区域为引起小麦茎基腐病的假禾谷镰孢菌、黄色镰孢菌和禾谷镰孢菌的TEF-1α基因序列，通过测序分辨不同种类镰孢菌。
2.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，还包括步骤5)将测序获得的样品病原菌丰度通过引入内标reads读数进行标准化，从而定量获得测序样品中病原菌的丰度信息。
3.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，在PCR共扩增过程中引入Barcodes序列，不同样品使用不同的barcodes序列，不同PCR产物混合测样后可以通过barcodes序列对样品进行分拆。
4.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，步骤3)中在样品基因组DNA提取之前，每克样品加入10-500pg内标质粒，之后使样品中的微生物和合成的内标DNA共分离。
5.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，测样样品建库使用NEB
UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒，建库完成后对文库质量进行检测，质量合格进行上机测序。
6.根据权利要求2所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，所述步骤5)具体为：进行测序，得到的PEreads首先根据overlap关系进行拼接，然后根据barcodes序列对样品进行分拆，并对序列质量进行质控和过滤，然后进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，将所有优化序列比对至OTU代表序列，选出与代表序列相似性在99％以上的序列，生成OTU表格，对OTU进行物种注释，使用Blast比对NCBI NT数据库，得到每个OTU对应的物种分类信息，同时根据内标reads读数，对OUT表进行标准化，根据内标计算每种病原菌在样品中的绝对丰度；
计算公式如下：
OTUAQ表示病原菌的绝对量，指特定基因拷贝数，
NAQ表示引入内标的绝对量，指特定基因拷贝数，
OUT表示病原菌reads数
NS表示内标reads数。
7.根据权利要求1所述的一种高通量测序用于镰孢菌属病原菌大规模定量检测的方法，其特征在于，
所述步骤4)中的PCR反应条件为：94-95℃预变性5min；94-95℃变性10s；45℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环，94-95℃变性10s；55℃退火30s，72℃延伸30s，共15-35个循环；72℃延伸5min，循环结束。
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| CN202010784739.1A CN111996274B (zh) | 2020-08-06 | 2020-08-06 | 一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法 |
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