CN109750113B

CN109750113B - 一种解析植物内生细菌菌群的方法

Info

Publication number: CN109750113B
Application number: CN201711057190.0A
Authority: CN
Inventors: 张莉莉; 陈丽莹
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN109750113A

Abstract

本发明公开了一种解析植物内生细菌菌群的方法。本发明提供了用于解析植物内生细菌菌群的引物对，其靶序列为细菌16SrDNA的V3‑V4区的全长或部分；且所述引物对中的一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16S rDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。本发明设计了一对引物322F‑1和796R，选择了具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶，共同实现了同时避开宿主植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA两种序列污染的目的，从而获得了纯的细菌菌群16S扩增子文库。

Description

一种解析植物内生细菌菌群的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种解析植物内生细菌菌群的方法，特别涉及一种利用引物对322F-1/796R解析植物内生细菌菌群结构的方法。

背景技术

自然条件下，植物的诸多器官内外都定殖着大量的复杂多样的微小生物，包括细菌、真菌、古菌、原生动物等等，它们影响着植物的生长发育和健康状态。在这些微小生物中，细菌在数量上占绝对优势，按照这些细菌定殖在植物组织的表面或者内部，它们被分为两类，分别叫做植物表面菌群和植物内生菌群。

植物内生菌的研究方法有培养法和非培养法两类，借助于16S rDNA扩增子测序的二代测序是是非培养法中经典研究方法，也是目前应用最普遍的一种方法。细菌的16SrDNA由10个序列保守区和9个序列高变区交替排列组成，保守区序列在不同的细菌中几乎是一致的，而高变区则具有物种特异性，因此，16S rDNA是公认的细菌分类鉴定的分子钟。应用上，可以根据16S rDNA的的序列保守区设计一对引物，扩增出含有几个高变区的序列片段，然后根据高变区的序列特异性进行菌种的分类鉴定。基于此原理，借助于16S rDNA扩增子测序的二代测序被发展起来，并广泛应用与动植物菌群的多样性解析。

对于植物内生菌群的解析，由于植物的叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA与细菌的16S rDNA有很高的同源性，导致16S扩增子文库中会出现极高比例的宿主DNA污染，严重干扰后续的多样性分析。

目前，为了实现通过16S扩增子测序方法解析植物内生菌群的目的，急需设计合适的扩增引物及可行的扩增方案来避开宿主植物DNA的污染从而获得纯的菌群16S扩增子，从而为植物内生菌群的解析提供测序实验平台。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于解析植物内生细菌菌群的引物对。

本发明提供的引物对，其靶序列为细菌16SrDNA的V3-V4区的全长或部分(与细菌16SrDNA完全相同)；

且所述引物对中的一条引物与植物线粒体18SrDNA中区域甲对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域甲中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域甲的差异位点大于等于3个；

所述区域甲与所述一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均相同或互补；

所述引物对中的另一条引物与植物叶绿体16S rDNA中区域乙对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域乙中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域乙的差异位点大于等于3个；

所述区域乙与所述另一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均互补或相同。

且所述引物对中的一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16S rDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。

上述引物对中，所述引物对由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列2。

上述中，引物1和引物2的一端均可添加区分不同样本的Barcode序列。

上述的引物对中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。

本发明另一个目的是提供用于解析植物内生细菌菌群的试剂。

本发明提供的试剂，包括上述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶。

本发明第3个目的是提供用于解析植物内生细菌菌群的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述引物对或上述的试剂。

上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在解析植物内生细菌菌群中的应用也是本发明保护的范围；

或上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在制备解析植物内生细菌菌群产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在避开植物宿主DNA污染且获得植物内生细菌菌群16S扩增子中的应用也是本发明保护的范围；

或上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在构建植物内生菌群测序文库中的应用也是本发明保护的范围；

或上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在植物内生菌群测序中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第4个目的是提供一种解析植物内生细菌菌群的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)提取待测植物组织基因组DNA，用上述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶扩增，得到PCR扩增产；

2)对所述PCR产物进行测序，根据测序结果鉴定待测植物组织内生细菌菌群，从而解析植物叶际内生细菌菌群结构。

上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

或，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述单子叶植物具体为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；

所述双子叶植物具体为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。

本发明的实验证明，本发明设计了一对引物322F-1和796R，优化了PCR扩增方案——选择了具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶，两个引物的组合及Platinum Taq DNA polymerase的特性共同实现了同时避开宿主植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA两种序列污染的目的，从而获得了纯的细菌菌群16S扩增子文库，使后续的菌群大数据多样性分析成为可能；结合Illumina二代测序平台建立了适用于多种植物内生菌群解析的测序实验平台。

附图说明

图1为本发明的引物对及扩增方案的扩增产物凝胶电泳图。

图2为实施例3高通量测序实验中4个样品的样品稀释曲线图。

图3为实施例3高通量测序实验中4个样品的两个alpha多样性指数柱形图。

图4为实施例3高通量测序实验中4个样品的门水平相对丰度柱形图。

图5为实施例3高通量测序实验中4个样品的属水平相对丰度柱形图。

图6为引物322F-1与多种植物线粒体18S rDNA的比对结果。

图7为引物796R与多种植物叶绿体16S rDNA的比对结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、解析植物内生细菌菌群的引物设计及合成

本发明设计避开宿主植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA，根据细菌16SrDNA的V3-V4区设计引物对如下：

一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16S rDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。

根据上述设计原则设计合成如下引物对：

322F-1：5’ACGGHCCARACTCCTACGGAA3’(序列1)

796R：5’CTACCMGGGTATCTAATCCKG3’(序列2)；

实施例2、解析植物内生细菌菌群的方法的建立

一、PCR扩增

以2016年9月12日采于福建农林大学水稻试验田健康水稻叶片的总DNA为模板，用实施例1的引物322F‐1和796R，以及具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen，USA)，进行PCR扩增。

上述PCR扩增的反应体系如下：

上述反应体系中，各个引物的终浓度为终浓度为0.2μM；Taq酶的终浓度为2U/rxn；MgCl₂的终浓度为1.5mM。

上述PCR反应程序如下：

结果如图1所示，Marker：DNA MarkerⅡ(TIANGEN)，1、2、3：三个重复样品，4：空对照(PCR体系不加DNA模板)；得到长度为470bp左右PCR扩增产物，为细菌菌群16S rDNA的V3-V4区。

二、单克隆测序及比对分析

1、回收上述一得到的PCR扩增产物，连接到pGEM-T Vector(Promega，Madison，USA)，得到连接PCR产物的pGEM-T质粒。

将连接PCR产物的pGEM-T质粒转化至感受态细胞并蓝白斑筛选阳性转化子。

2、测序

将筛选出的29个阳性转化子挑单斑送中美泰和生物公司进行测序，得到29个阳性转化子所含有的PCR扩增产物测序结果。

将上述所有测序结果在NABI数据库中进行Blast从而鉴定PCR扩增产物。

测序结果比对鉴定结果如表1所示：

表1为PCR扩增产物测序结果比对后隶属

从表1中可以看出，29个单克隆所含有的PCR产物全部为细菌16S rDNA序列，没有线粒体18S rDNA和叶绿体16S rDNA序列，经BLAST鉴定后该29个单克隆分属13个菌种。

上述结果表明，本发明所设计的引物和扩增方案可用于解析植物内生细菌菌群，实现了避开宿主DNA污染从而获得纯的菌群16S扩增子的目的。

实施例3、高通量测序解析植物内生细菌菌群的方法

一、PCR扩增

1、扩增引物

将实施例1设计合成的引物322F-1和796R的5’端均加上6个随机碱基用于区分不同样品的Barcode。每个样品的引物Barcode组合均不同，用于后续高通量测序的样品标识，Barcode序列信息由北京诺禾致源科技股份有限公司提供，扩增产物也由北京诺禾致源科技股份有限公司进行后续的建库及上机测序；每个样品的PCR设置4个扩增重复，共获得200μl的扩增终产物，共4个样品。

2、扩增

提取2017.7.17采于河南开封黄金晴水稻叶片样本的总DNA。每份DNA由同一株水稻的三个叶片均一化后提取，共4份DNA。

以上述4份DNA为模板，分别用上述添加了的Barcode的引物322F-1和796R和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen，USA)，进行PCR扩增，得到所有样本的16S rDNA的V3-V4区。

将所有样本的16S rDNA的V3-V4区利用北京诺禾致源科技股份有限公司的Illumina HiSeq PE250测序平台，对扩增产物16S rDNA的V3-V4区进行高通量(每个样品数据量≥5W条)测序。

结果如下：

(1)如图2所示，4个样品的稀释曲线最终都趋于平缓，且数据量在4万条以上，说明本次测序结果可以进行后续数据分析。Alpha多样性分析(图3)中，每个样品的物种数目(observed species)都在100以上，覆盖度指数(goods_coverage)均为1，说明本次测序的数据量及多样性都是足够的。

(2)从门水平物种相对丰度柱形图(图4)和属水平相对丰度柱形图(图5)的结果可以看出，本次测序的4个样品在物种组成上，除不足0.2％的线粒体(mitochondria)外，其余全部为细菌，门水平相对丰度排名前十的是图4.所示的10个门，图5.所示是相对丰度排名前二十的属。

本次测序从大数据的统计结果上说明，本发明所设计的引物及扩增方案实现了避开宿主DNA污染从而获得纯的菌群16S扩增子的目的，并结合Illumina二代测序建立了植物内生菌群的测序实验平台。

实施例4、本发明在植物内生菌领域的应用范围

挑选了目前植物菌群研究比较常用的十余种植物材料，包括拟南芥(A.thaliana)、小麦(wheat)、玉米(Z.mays)、花生(peanut)、水稻(O.stavia)、大麦(barley)、大豆(soybean)、葡萄(grape)高粱(sorghum)、番茄(tomato)。这些物种的线粒体18S rDNA序列和叶绿体16S rDNA序列均从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载得到。

分别将这些植物的线粒体18S rDNA序列(简记为M 18S)和引物322F-1、叶绿体16SrDNA序列(简记为C 16S)与引物796R利用软件Vector NTI(Invitrogen)进行序列比对。

图6可以看出，引物322F-1可以避开所有这些植物的线粒体18S rDNA序列，图7则说明引物796R可以避开所有这些植物的叶绿体16S rDNA序列。

这一结果表明，本发明所设计的引物及扩增方案可以适用于上述所有植物物种的内生细菌菌群解析，并且，根据序列同源性推断，本发明还可以适用于上述植物之外的多种植物物种。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种解析植物内生细菌菌群的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>5

<223>h=a或c或t/u

<221>misc_feature

<222>9

<223>r= g或a

<400> 1

acgghccara ctcctacgga a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>6

<223>m=a或c

<221>misc_feature

<222>9

<223>k=g或 t/u

<400> 2

ctaccmgggt atctaatcck g 21

Claims

1.用于解析植物内生细菌菌群的引物对，由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列1；

所述引物2的核苷酸序列为序列2。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。

3.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于：

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；

所述双子叶植物为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。

5.用于解析植物内生细菌菌群的试剂，包括权利要求1或2所述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于：

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；

所述双子叶植物为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。

8.用于解析植物内生细菌菌群的试剂盒，包括权利要求1或2所述引物对或权利要求5所述的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；

所述双子叶植物为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。

11.权利要求1或2所述引物对或权利要求5所述的试剂或权利要求8所述试剂盒在解析植物内生细菌菌群中的应用；

或权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求5所述的试剂或权利要求8所述试剂盒在制备解析植物内生细菌菌群产品中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；

所述双子叶植物为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。

14.权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求5所述的试剂或权利要求8所述试剂盒在避开植物宿主DNA污染且获得植物内生细菌菌群16S扩增子中的应用；

或权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求5所述的试剂或权利要求8所述试剂盒在构建植物内生菌群测序文库中的应用；

或权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求5所述的试剂或权利要求8所述试剂盒在植物内生菌群测序中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；

所述双子叶植物为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。

17.一种解析植物内生细菌菌群的方法，包括如下步骤：

1）提取待测植物组织基因组DNA，用权利要求1-3中任一所述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶扩增，得到PCR扩增产物；

2）对所述PCR产物进行测序，根据测序结果鉴定待测植物组织内生细菌菌群，从而解析植物叶际内生细菌菌群结构。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱或大麦；

所述双子叶植物为拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄。