CN109943660A - 用于检测橡胶树白粉病菌的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明“用于检测橡胶树白粉病菌的引物对、试剂盒及方法”，属于分子检测领域。所述引物对包括：具有如下核苷酸序列的上下游引物：上游引物：5‑CCCGTGTCGATTTGTATCTT‑3；下游引物：5‑CTTTAAGGGCCGCCGTATC‑3。本发明还提供基于所述引物对的试剂盒和检测方法。所述引物和方法在橡胶树白粉菌的检测中具有较高的特异性、可靠性、准确性和时效性，可用于橡胶树白粉病的鉴定、检测和调查测报，尤其适用于橡胶树白粉病的早期筛查预警，可实现早发现早防治。

Description

用于检测橡胶树白粉病菌的引物对、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种用于检测橡胶树白粉病菌的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

天然橡胶是重要的国家战略物资，海南和云南的橡胶种植面积占全国的95％以上。由专性寄生的橡胶树粉孢Oidium heveae Steinm引起的白粉病是我国橡胶树上危害最严重的叶部病害，2008年云南西双版纳所有胶园(300多万亩)均不同程度地发病受害，多数开割胶园病情指数达60或以上，部分甚至超过90，造成损失数亿元(陈瑶等，2008)。2017年云南省橡胶树白粉病大流行，大片胶林因白粉病落叶推迟割胶30～90d，据测算仅西双版纳地区天然橡胶损失金额超过1.7亿元。近年来白粉病在海南农垦发生面积超过260万亩，占海南农垦橡胶种植面积的70％以上，且重病年发生频率越来越高(海南农垦科技编委会，2005；曹学仁等，2015)。

由于迄今还未选出一个能在生产上大规模推广的抗病品系(Liyanage等，2016)，针对橡胶树白粉病的防治还是以化学药剂为主，因此病害准确鉴定和调查测报在病害防治体系中显得尤为重要。但由于受物候和温度的影响，白粉病在橡胶树叶片上的病斑类型有5种，即发病初期嫩叶上形成大小不一的新鲜白粉斑，如遇高温嫩叶上的白粉斑发展为红斑，再遇低温时红斑又可转变为新鲜白粉斑，随着胶树叶片物候进入老化期，病斑上的孢子大量死亡，进一步发展为老叶癣状斑、黄斑和褐色坏死斑(李增平和郑服丛，2015)。同时，橡胶树一旦感染白粉病菌，在感染早期，病斑较小，不好准确判断，如若将叶片斜对着阳光，可能看到微小银白色的蛛丝状白粉病症状，而若将叶片与地面平行，眼睛往下看，可能看不见微小菌丝，而且病斑还容易与叶片上的灰尘等混淆，从而造成误诊。另外作为一种专性寄生菌，无法在室内培养基上人工培养，导致仅仅依靠人工肉眼根据症状很难准确进行病害鉴定和调查。因此十分有必要建立一种能准确、高效地鉴定橡胶树白粉病菌的、尤其在植株感染早期就能快速尽早鉴定是否感染白粉病菌的分子检测方法。

发明内容

本发明基于上述领域的需求，目的在于提供一种用于分子检测橡胶树白粉病菌的引物及其检测方法，能快速、准确待检测样品中的橡胶树白粉病菌，尤其对早期染病的植株而言意义重大，可尽早判断哪些植株感染，尽早防治；也可对橡胶树群体进行大面积筛查，起到预防的作用。

本发明的技术方案如下：

用于检测橡胶树白粉病菌的引物对，其特征在于，包括：具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

用于检测橡胶树白粉病菌的试剂盒，其特征在于，包括：具有如下引物对：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

所述的试剂盒，其特征在于，还包括：用于PCR扩增的试剂，和/或，用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

所述用于PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、双蒸水；或，包含DNA聚合酶、dNTP、缓冲液在内的PCR扩增用混合液；

所述用于琼脂糖凝胶电泳的试剂包括琼脂糖、双蒸水、电泳缓冲液、溴化乙锭；

优选地，所述PCR扩增用混合液为2×Taq PCR Forest Mix。

用于检测橡胶树白粉病菌的试剂盒，和/或，用于早期鉴定橡胶树感染白粉病菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，在标有检测橡胶树白粉病菌检测用途的商品包装盒内放置有具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

用于检测橡胶树白粉病菌的方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3

以待测橡胶树材料的DNA为模板进行PCR扩增并进行电泳检测。

所述PCR扩增的反应体系为：模板0.04μL/μL，2×Taq PCR Forest Mix 0.5μL/μL，上下游引物5μmol/L，其余为双蒸水；

优选地，所述电泳检测指：将所述PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察；

优选地，所述橡胶树材料选自：橡胶树叶片。

所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min；以95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，为1个循环，共35个循环；72℃延伸7min。

于早期筛查、鉴定橡胶树感染白粉病菌的方法，其特征在于，采用所述的引物，和/或，所述的试剂盒，以待测橡胶树材料的DNA为模板进行PCR扩增并电泳检测。

所述橡胶树为未出现病斑，或已出现疑似病斑的橡胶树。

一种橡胶树白粉病菌分子检测的引物，序列如下：

正向引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

反向引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

上述特异性引物对橡胶树白粉病菌的能特异的扩增出一条392bp的条带。

利用本发明所述的引物对橡胶树白粉病菌的分子检测方法的步骤如下：

1)提取待测橡胶树叶片基因组DNA；

2)以待测样品DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增；

3)反应结束后扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测；

4)根据扩增产物大小进行结果判定，如能扩增出一条392bp的条带，则待测样品中存在橡胶树白粉病菌。

所述PCR扩增反应体系为：DNA模板1μL，2╳Taq PCR Forest Mix 12.5μL，上下游引物各1μL(5μmol/L)，ddH₂O 9.5μL。

所述PCR反应条件为:95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸7min。

本发明所用的引物是用于橡胶树白粉病病原菌分子检测的理想引物。本发明的检测方法对橡胶树白粉菌能扩增出392bp的特征条带，而对橡胶树上的胶孢炭疽菌、尖胞炭疽菌、棒孢霉落叶病菌、腐皮镰刀菌、麻点病菌等真菌及茎点霉、木贼镰孢菌和健康叶片均未扩增出目的条带，加上橡胶树白粉菌是一种专性寄生菌。因此所述方法在橡胶树白粉菌的检测中具有较高的特异性和可靠性，可用于橡胶树白粉病的鉴定、检测和调查测报。

本发明涉及一种用于分子检测橡胶树白粉病菌的引物及其检测方法，属于植物病害的分子检测领域。以橡胶树白粉病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖电泳和结果判定。若样品中存在橡胶树白粉菌，利用该引物能扩增出一条392bp的目的条带，而在胶孢炭疽菌、尖胞炭疽菌、棒孢霉落叶病菌等其他橡胶树病害病原菌均没有扩增产物，因此可用于橡胶树白粉病的鉴定、检测和调查测报。除了具有较高的特异性，本发明的引物及检测方法灵敏度高，最低检出限为10pg/μL，时效性高，可在侵染/接种36小时即可检测到。

附图说明

图1为本发明引物分子检测的特异性扩增凝胶电泳图；其中：点样孔中的样品从左至右分别是阴性对照(无菌水)、3个橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)、2个胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、2个尖胞炭疽病菌(C.acutatum)、2个棒孢霉落叶病菌(Corynespora cassiicola)、1个橡胶树麻点病菌(Bipolaris sp.)、2个腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、1个茎点霉(Phoma sp.)、1个木贼镰孢菌(F.equiseti)和4个橡胶树健康叶片。Marker条带大小从下往上依次为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp和1500bp。

图2为本发明特异性检测引物检测待检样品DNA扩增后的凝胶电泳图；其中：点样孔中的样品从左至右分别为阴性对照(无菌水)、阳性对照(橡胶树白粉菌基因组DNA)、15个田间发病橡胶树叶片样品(采自海南不同植胶区包括乐东、白沙、儋州、琼海、三亚、五指山、海口、琼中、屯昌和云南西双版纳等地)和3个健康橡胶树叶片。Marker条带大小从下往上依次为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp和1500bp。

图3为本发明特异性检测引物灵敏度结果；其中：点样孔中橡胶树白粉菌模板DNA浓度从左至右分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、阴性对照(无菌水)。Marker条带大小从上往下依次为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp和1500bp。

具体实施方式

以下参考具体实施方式对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅作为解释和说明，而不能理解为对本发明的限制。

生物材料的来源

3个橡胶树白粉病菌Oidium heveae采自海南白沙、乐东和儋州，2个胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides采自琼中和白沙，2个尖胞炭疽病菌C.acutatum采自琼中和白沙，2个棒孢霉落叶病菌Corynespora cassiicola采自澄迈和白沙，1个橡胶树麻点病菌Bipolaris sp.采自白沙，2个腐皮镰刀菌(Fusarium solani)采自琼海和万宁、1个茎点霉(Phoma sp.)采自琼中、1个木贼镰孢菌(F.equiseti)采自万宁，以上病原菌均通过形态学和ITS序列测定后鉴定。

橡胶树健康叶片通过室内培养获得。

橡胶树白粉病叶片采自海南不同植胶区包括乐东、白沙、儋州、琼海、三亚、五指山、海口、琼中、屯昌和云南西双版纳等地。

橡胶树白粉菌分生孢子在橡胶树品种热研7-33-97上繁殖。

其余真菌菌丝均通过在PDA培养基上分离、培养获得。

第1组实施例、本发明的引物对

本组实施例提供一种用于检测橡胶树白粉病菌的引物对，其特征在于，包括：具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

第2组实施例、本发明的试剂盒

本组实施例提供一种用于检测橡胶树白粉病菌的试剂盒，其特征在于，包括：具有如下引物对：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

在进一步的实施例中，所述的试剂盒还包括：用于PCR扩增的试剂，和/或，用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

在具体的实施例中，所述用于PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、双蒸水；或，包含DNA聚合酶、dNTP、缓冲液在内的PCR扩增用混合液；

所述用于琼脂糖凝胶电泳的试剂包括琼脂糖、双蒸水、电泳缓冲液、Goldview核酸染色剂；

在优选的实施例中，所述PCR扩增用混合液为2×Taq PCR Forest Mix。

第3组实施例、本发明试剂盒的制备方法

本组实施例提供一种用于检测橡胶树白粉病菌的试剂盒，和/或，用于早期鉴定橡胶树感染白粉病菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，在标有检测橡胶树白粉病菌检测用途的商品包装盒内放置有具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

第4组实施例、本发明的检测方法

本组实施例提供一种用于检测橡胶树白粉病菌的方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3

以待测橡胶树材料的DNA为模板进行PCR扩增并进行电泳检测。

在具体的实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：模板0.04μL/μL，2×Taq PCRForest Mix0.5μL/μL，上下游引物5μmol/L，其余为双蒸水；

优选地，所述电泳检测指：将所述PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察；

优选地，所述橡胶树材料选自：橡胶树叶片。

在一些实施例中，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min；以95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，为1个循环，共35个循环；72℃延伸7min。

第5组实施例、本发明的早期筛查、鉴定方法

本组实施例提供一种用于早期筛查、鉴定橡胶树感染白粉病菌的方法，其特征在于，采用第1组实施例任一所述的引物，和/或，第2组实施例任一所述的试剂盒，以待测橡胶树材料的DNA为模板进行PCR扩增并电泳检测。

在一些实施例中，所述橡胶树为未出现病斑，或已出现疑似病斑的橡胶树。

实验例1、本发明的引物特异性验证

DNA提取：

收集3个橡胶树白粉病菌分生孢子，其余病原菌的菌丝，并采集室内培养的健康橡胶树叶片和田间发病橡胶树叶片，加入液氮研磨后，移入2ml灭菌后的离心管中，利用TIANGEN新型植物基因组提取试剂盒提取病原菌DNA(天根生化科技(北京)有限公司)，提取方法参见试剂盒说明书。

引物合成：

本发明根据橡胶树白粉病菌的保守序列，运用primer-BLAST设计引物，并经BLASTn进行检验，设计出一对特异性引物(由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)。

正向引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

反向引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

引物特异性验证：

以提取的橡胶树白粉病菌、其他真菌和健康橡胶树叶片的DNA为模板，用特异性引物进行PCR反应，每个反应均设一个阴性对照(以无菌水作为模板)。

PCR扩增反应体系为：DNA模板1μL，2╳Taq PCR Forest Mix 12.5μL，上下游引物各1μL(5μmol/L)，ddH₂O 9.5μL。

PCR反应条件为:95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸7min。

扩增产物经琼脂糖电泳后，在凝胶成像系统上检测并拍照。从电泳照片上可以看出(图1)。利用本发明设计的引物均能对3个橡胶树白粉病菌扩增到392bp的条带，而阴性对照、橡胶树上的胶孢炭疽菌、尖胞炭疽菌、棒孢霉落叶病菌、腐皮镰刀菌、麻点病菌等病原真菌及茎点霉、木贼镰孢菌和健康叶片均未扩增到该目的条带。

田间发病样品检测：

以田间采集的发病样品和健康橡胶树叶片的DNA为模板，用特异性引物进行PCR反应，每个反应均设一个阴性对照(以无菌水作为模板)和阳性对照(橡胶树白粉菌基因组DNA)，PCR扩增反应的体系和条件如上所述。电泳检测结果如图2所示，结果表明，阳性对照和田间发病样品中均扩增出了392bp的目的条带，而阴性对照和健康橡胶树叶片中均未扩增出该目的条带。

实验例2、本发明的引物灵敏度验证

将橡胶树白粉菌模板DNA梯度稀释至浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL。以稀释后的橡胶树DNA为模板，利用本发明设计的引物进行PCR反应，PCR扩增反应的体系和条件如上所述。电泳检测结果表明，从10pg/μL的模板DNA中检测到392bp的目的条带。

实验例3、本发明的引物用于早期筛查橡胶树感染白粉病菌的时效性验证

同时进行室内接种，在接种6h、12h、24h、36h、48h和72h后取样，提取样品的DNA后，采用本发明的引物进行分子检测，并观察侵染多少时间后才能显症，结果发现，采用本发明的引物和方法在接种36h后就可以检测到目的片段的存在，而白粉菌侵染后至少需要72h才能用肉眼观察到症状。说明本发明的引物及方法早期筛查橡胶树白粉病菌的时效性高。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 用于检测橡胶树白粉病菌的引物对、试剂盒及方法

<130> P190296/HZS

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 1

cccgtgtcga tttgtatctt 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

ctttaagggc cgccgtatc 19

Claims (10)

1.用于检测橡胶树白粉病菌的引物对，其特征在于，包括：具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

2.用于检测橡胶树白粉病菌的试剂盒，其特征在于，包括：具有如下引物对：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：用于PCR扩增的试剂，和/或，用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、双蒸水；或，包含DNA聚合酶、dNTP、缓冲液在内的PCR扩增用混合液；

所述用于琼脂糖凝胶电泳的试剂包括琼脂糖、双蒸水、电泳缓冲液、溴化乙锭；

优选地，所述PCR扩增用混合液为2×Taq PCR Forest Mix。

5.用于检测橡胶树白粉病菌的试剂盒，和/或，用于早期鉴定橡胶树感染白粉病菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，在标有检测橡胶树白粉病菌检测用途的商品包装盒内放置有具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

6.用于检测橡胶树白粉病菌的方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的上下游引物：

上游引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

下游引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3

以待测橡胶树材料的DNA为模板进行PCR扩增并进行电泳检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：模板0.04μL/μL，2×Taq PCR Forest Mix 0.5μL/μL，上下游引物5μmol/L，其余为双蒸水；

优选地，所述电泳检测指：将所述PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察；

优选地，所述橡胶树材料选自：橡胶树叶片。

8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min；以95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，为1个循环，共35个循环；72℃延伸7min。

9.用于早期筛查、鉴定橡胶树感染白粉病菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物，和/或，权利要求2-5任一所述的试剂盒，以待测橡胶树材料的DNA为模板进行PCR扩增并电泳检测。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述橡胶树为未出现病斑，或已出现疑似病斑的橡胶树；

一种橡胶树白粉病菌分子检测的引物，序列如下：

正向引物：5-CCCGTGTCGATTTGTATCTT-3；

反向引物：5-CTTTAAGGGCCGCCGTATC-3。

上述特异性引物对橡胶树白粉病菌的能特异的扩增出一条392bp的条带。

利用本发明所述的引物对橡胶树白粉病菌的分子检测方法的步骤如下：

1)提取待测橡胶树叶片基因组DNA；

2)以待测样品DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增；

3)反应结束后扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测；

4)根据扩增产物大小进行结果判定，如能扩增出一条392bp的条带，则待测样品中存在橡胶树白粉病菌。

所述PCR扩增反应体系为：DNA模板1μL，2╳Taq PCR Forest Mix 12.5μL，上下游引物各1μL(5μmol/L)，ddH₂O 9.5μL。

所述PCR反应条件为:95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸7min。