CN105177138A - 一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用。所述用于检测橡胶树白粉菌的引物包括引物对，所述引物对为如下引物对的任一种：1)SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列及SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列组成的引物对；2)SEQ？ID？NO.1所示核苷酸序列的互补核苷酸序列及SEQ？ID？NO.2所示核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的引物对。本发明提供的用于检测橡胶树白粉菌的引物，利用PCR技术，能快速、有效地检测橡胶树白粉菌，经试验确定该引物具有较强的特异性及较高的灵敏度。

Description

一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用。
背景技术
靶基因的选择对真菌检测鉴定至关重要。目前在真菌研究中常选用的靶基因有rRNA复合体、线粒体细胞色素b(mitochondrialcytochromeb,cytb)、微管蛋白(beta-tubulin)等基因。rRNA复合体中，ITS序列含有高度的可变区，且每个基因组中含有约100拷贝，多用于设计属、种特异性引物，诊断侵袭性真菌病及分析系统发育与进化关系的研究中。目前对于橡胶树白粉菌的检测鉴定，尚未在ITS序列中找到特异性引物，故不能直接用来区分橡胶树白粉菌与其他菌。
因此，寻找一种快速检测橡胶树白粉菌的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用，本发明提供的特异性引物，利用PCR技术，能快速、有效地检测橡胶树白粉菌，经试验确定该引物具有较强的特异性及较高的灵敏度。
第一方面，本发明提供了一种用于检测橡胶树白粉菌的引物，所述用于检测橡胶树白粉菌的引物包括引物对，所述引物对为如下引物对的任一种：
1)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列及SEQIDNO.2所示的核苷酸序列组成的引物对；2)SEQIDNO.1所示核苷酸序列的互补核苷酸序列及SEQIDNO.2所示核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的引物对。
在本发明一实施例中，各引物对中的至少一条序列替换为与序列自身具有90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列。具体地，比如，SEQIDNO.1所示的核苷酸序列替换为与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供了一种用于检测橡胶树白粉菌的方法，包括如下步骤：
a.制备如第一方面所述的用于检测橡胶树白粉菌的引物；
b.提取待测样品的DNA模板；
c.配制PCR反应体系，所述PCR体系中包括所述用于检测橡胶树白粉菌的引物和所提取的待测样品的DNA；
d.采用PCR反应检测待测样品中是否含有橡胶树白粉菌。
在本发明一实施例中，所述步骤c中，所述PCR体系中的DNA模板的浓度不低于1ng/uL。
在本发明一实施例中，所述步骤c中，所述PCR体系中的每条引物的浓度均为10uM。
在本发明一实施例中，所述步骤c中，所述PCR体系中还包括：Tag聚合酶、Tag酶缓冲液、dNTP。
在本发明一实施例中，所述步骤d中，所述PCR反应的退火温度为55-60℃(进一步优选为57℃)。
第三方面，本发明提供了一种核苷酸序列，为采用如第一方面所述的引物，对橡胶树白粉菌的核酸进行特异性PCR扩增获得的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或与SEQIDNO.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在本发明一实施例中，所述核苷酸序列为如与SEQIDNO.3所示核苷酸序列具有90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列，或与SEQIDNO.3所示核苷酸序列互补的核苷酸序列具有90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供了一种检测橡胶树白粉菌的基因芯片，其具有如第一方面所述引物中的至少一种。
第五方面，本发明提供了一种检测橡胶树白粉菌的试剂盒，其具有如第一方面所述引物。进一步还包含如第二方面所述的PCR反应体系。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述引物、如第二方面所述的方法、第三方面所述的核苷酸序列在检测橡胶树白粉菌中的应用。
在本发明一实施例中，所述用于为：在制备检测橡胶树白粉菌的基因芯片或试剂盒中的应用。
本发明的有益技术效果是：据本发明提供的鉴定橡胶树白粉菌的特异性引物，可以特异性地扩增获得一段橡胶树白粉菌的标签序列。本发明所述的特异性引物还可以制备成检测用基因芯片和/或试剂盒，由于使用流程简单，操作简便，用时短、灵敏性高、具备实际可操作性，因此能够方便、快速地鉴定橡胶树白粉菌。
附图说明
图1为本发明实施例提供的橡胶树白粉菌特异性检测电泳结果；
图2为本发明实施例提供的橡胶白粉菌检测的灵敏度实验电泳结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。若无特殊说明，本发明采用试剂均为行业内常规试剂。发明采用的病原菌、所致病害名称：
本发明采用的试剂盒：
真菌基因组DNA提取参照OMEGA真菌DNA提取试剂盒(货号：D3390))；植物基因组DNA提取参照OMEGA植物DNA提取试剂盒(货号：D3485)。
本发明合成的用于检测橡胶树白粉菌的引物对：
表1.特异性引物设计与合成
实施例1特异性检测实验
将供试菌株基因组DNA及橡胶树叶片基因组DNA全部稀释成DNA浓度为1ng。用14640外引物(如表1所示)进行PCR扩增，检测其特异性，以灭菌的ddH2O为阴性对照。
PCR反应体系为：25μL反应体系10xTaqBuffer2.5μL；2.5mMdNTPs2μL；正反引物(10μM)2.5μL；模板DNA1μL；2.5UTaqDNA聚合酶0.5μL；ddH2O14μL。
反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸1min,35个循环；72℃延伸10min。扩增结束后取5μLPCR产物加入1μLLoadingbuffer于含的1.5％琼脂糖凝胶中电泳20min(120V)，在凝胶成像系统上检测并拍照。
采用该段序列引物(如表1所示)对供试菌株基因组DNA(表1所示的菌株，包括：菌株代号为OH1-OH6、CG、CC、PC、FL、CT的各菌株样品)及橡胶树叶片基因组DNA(全部稀释为1ng)进行PCR扩增。
结果如图1所示，其中，泳道M：2000bpDNAladdermarker；泳道1：ddH2O；泳道2-7：橡胶白粉菌OH1-OH6；泳道8：胶胞炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)；泳道9：橡胶树棒孢霉落叶病菌(Corynesporacassiicola)；泳道10：橡胶树茎杆溃疡病菌(Phytophthoracapsici)；泳道11：香蕉枯萎病菌(FusariumroseumLink)；泳道12：芒果露水斑病菌(Phycomycetes)；泳道13：橡胶树叶片。由图1可知：该引物对橡胶白粉菌6个菌株均能扩增出一条620bp左右的条带，而其它对照菌及双蒸水对照均无扩增产物，表明该引物具有很强的特异性。
实施例2引物检测灵敏度实验
采用实施例1的PCR扩增体系和扩增方法，不同的是DNA扩增模板来源为：将提取的橡胶白粉病菌各菌株(菌株代号为OH1-OH6)的DNA稀释成1ng、l00pg、l0pg、lpg、l00fg、l0fg、lfg、0.1fg、0.01fg9种不同浓度梯度后做PCR扩增，根据凝胶电泳结果测定引物的灵敏度。
凝胶电泳结果如图2所示，其中，泳道M:2000bpDNAladdermarker；泳道1：ddH2O；泳道2：1ng；泳道3：l00pg；泳道4：l0pg；泳道5：lpg；泳道6：l00fg；泳道7：l0fg；泳道8：lfg；泳道9：0.1fg；泳道10：0.01fg。
由图2可知：泳道2：1ng的位置出现了特异性条带，而其他泳道均无明显特异性条带出现。因此，在使用本发明提供的检测橡胶白粉病菌的引物对做常规PCR检测时，检测橡胶白粉菌的灵敏度为1ng。
将泳道2的PCR产物测序，测序结果显示：扩增产物与所设计扩增序列一致，序列为如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。
此外，本发明人将表1引物替换为ITS通用引物进行PCR，ITS通用引物如下所示：
ITS1；5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3；
ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。
结果发现，使用ITS通用引物扩增橡胶树白粉菌时无特异性，具体为：同时可以扩增出其他对照菌包括橡胶树叶片的基因片段；在使用通用引物扩增后，必须经过测序才可鉴定样品中是否含有橡胶树白粉菌。
综上，与ITS通用引物相比，本发明提供的用于检测橡胶白粉病菌的引物具有更高的特异性及更强的灵敏性，可用于橡胶树白粉菌的检测及鉴定。

Claims (10)

1.一种用于检测橡胶树白粉菌的引物，其特征在于，所述用于检测橡胶树白粉菌的引物包括引物对，所述引物对为如下引物对的任一种：
1)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列及SEQIDNO.2所示的核苷酸序列组成的引物对；2)SEQIDNO.1所示核苷酸序列的互补核苷酸序列及SEQIDNO.2所示核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的引物对。
2.如权利要求1所述的用于检测橡胶树白粉菌的引物，其特征在于，各引物对中的至少一条序列替换为与序列自身具有90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列。
3.一种用于检测橡胶树白粉菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.制备如权利要求1所述的用于检测橡胶树白粉菌的引物；
b.提取待测样品的DNA模板；
c.配制PCR反应体系，所述PCR体系中包括所述用于检测橡胶树白粉菌的引物和所提取的待测样品的DNA；
d.采用PCR反应检测待测样品中是否含有橡胶树白粉菌。
4.如权利要求3所述的用于检测橡胶树白粉菌的方法，其特征在于，所述步骤c中，所述PCR体系中的DNA模板的浓度不低于1ng/uL。
5.如权利要求3所述的用于检测橡胶树白粉菌的方法，其特征在于，所述步骤d中，所述PCR反应的退火温度为55-60℃。
6.一种核苷酸序列，其特征在于，为采用如权利要求1所述的引物，对橡胶树白粉菌的核酸进行特异性PCR扩增获得的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列或与SEQIDNO.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为如与SEQIDNO.3所示的核苷酸序列具有90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列，或与SEQIDNO.3所示核苷酸序列互补的核苷酸序列具有90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列。
8.一种检测橡胶树白粉菌的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片具有如权利要求1所述引物中的至少一种。
9.一种检测橡胶树白粉菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有如权利要求1所述引物中的至少一种。
10.一种如权利要求1所述引物、如权利要求3所述的方法、如权利要求6所述的核苷酸序列在检测橡胶树白粉菌中的应用。
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