JP2007174973A - Ssrプライマーを用いるマルチプレックスpcrによる品種識別法。 - Google Patents
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Abstract
【課題】 農産物(穀類、野菜)、畜産物(肉類)、水産物(魚介類)、毛髪、体液、微生物等の検体に含まれるDNAを高精度、迅速、簡便且つ安価にDNA増幅及び解析することのできる技術を提供する。
【解決手段】 検体中のDNAをPCRで増幅するに際して複数のSSRプライマー対を用いるマルチプレックスを行い、PCR産物の分離・解析を2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲル電気泳動により行う。SSRプライマーとして、RAPD−STS化法のマルチプレックスと同様にPCR産物のサイズが重ならないプライマー対だけでなく、PCR産物のサイズが重なるプライマー対を用いる。
【選択図】 図1
【解決手段】 検体中のDNAをPCRで増幅するに際して複数のSSRプライマー対を用いるマルチプレックスを行い、PCR産物の分離・解析を2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲル電気泳動により行う。SSRプライマーとして、RAPD−STS化法のマルチプレックスと同様にPCR産物のサイズが重ならないプライマー対だけでなく、PCR産物のサイズが重なるプライマー対を用いる。
【選択図】 図1
Description
本発明は、DNA分析により、各種の検体(生物試料)において特定の品種を識別したり他品種の混入を検知するための新規な技術に関する。
DNA分析は、学問の分野においてのみならず、産業上または社会的ないろいろな要求からも益々重要になっている。例えば、食品産業の分野においては、食品の偽装表示問題などに因り食品原材料のDNA分析の必要性が高まっており、この要求を満たすとともに食品の流通を妨げないために迅速な分析結果が求められている。DNAの分析は、大略、DNAの抽出、DNAの増幅、および解析の各工程から成り、このうちDNAの増幅は、ターゲットとする遺伝子部位が多いほど高精度となるが、その半面、一度に分析できる検体数を減少させ、作業効率を大幅に低下させる。また、DNAの解析は、アガロースゲルよりアクリルアミドゲルやバイオアナライザー等の機器を使用したほうが多型を多く得られるが、その反面、数bpの誤差が生じることから、解析結果の信頼性が疑われる可能性がある。
PCR(polymerase chain reaction)は、DNA(遺伝子)の増幅に多用される基本技術であり、SSRプライマーまたはRAPD(RAPD−STS)プライマー等が用いられる。このうち、SSR法によりDNAを増幅するための従来から知られている手法は、単一のチューブごとに単一の組(セット)プライマー(プライマー対)を用いてPCR反応を実施している。その後、DNAの解析は、PCR産物をアクリルアミドゲル、バイオアナライザー等の分離能力の高い機器を用いてPCR産物のサイズを決定している。これはSSRプライマーによって増幅される部位の差が比較的小さいことによるものである。しかしながらこれらの機器は、数bpの差を検出できるが、泳動による誤差が生じるという難点があった。
一方、RAPD−STS化法においては従来からマルチプレックス法が知られている(例えば、非特許文献1:「DNA分析による稲品種の識別」独立行政法人食品総合研究所発行)。増幅させるDNAサイズの差が大きいことから、1チューブごとに2〜5組(セット)のプライマー(プライマー対)のPCR反応を実施できるが、検出感度が低下することやRAPD法自体の再現性が低いこと、混合したサンプルをまとめて分析することができないという難点があった。
DNA分析による稲品種の識別」独立行政法人食品総合研究所発行
DNA分析による稲品種の識別」独立行政法人食品総合研究所発行
本発明の目的は、上述したような問題を解決して、高精度、迅速、簡便且つ安価にDNA増幅及び解析することのできる新しい技術を提供することにある。
本発明者は、従来には無いSSRプライマーの使用方法によるPCR法を実現することにより如上の目的を達成できることを見出し、本発明を導き出したものである。
かくして、本発明に従えば、検体中の特定の品種を識別しおよび/または他の品種の混入を検知する方法であって、検体中のDNAをPCR反応で増幅する工程、および増幅後のPCR産物を分離し解析する工程を含む方法において、前記PCR増幅工程が複数のSSRプライマー対を用いるマルチプレックスによって行われることを特徴とする方法が提供される。
かくして、本発明に従えば、検体中の特定の品種を識別しおよび/または他の品種の混入を検知する方法であって、検体中のDNAをPCR反応で増幅する工程、および増幅後のPCR産物を分離し解析する工程を含む方法において、前記PCR増幅工程が複数のSSRプライマー対を用いるマルチプレックスによって行われることを特徴とする方法が提供される。
本発明の特に好ましい態様に従えば、前記PCR産物の分離・解析工程が2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種及び混入の可能性のある品種のPCR産物の電気泳動バンドが重ならないような複数のSSRプライマー対を用いる。本発明の更に別の特に好ましい態様に従えば、前記PCR産物の分離・解析工程が2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種のPCR産物の電気泳動バンドは重なるが、混入の可能性のある品種のPCR産物の電気泳動バンドは重ならないような複数のSSRプライマー対を用いる。
本発明によれば、高精度で簡便かつ確実、安価にDNA増幅及び解析が可能である。SSRプライマーを用いる本発明のマルチプレックス法によるDNA増幅及び解析を実施すれば、例えば、従来の手法では96穴PCRプレート使用の場合、1PCR反応において16検体しか処理出来なかったものが、2〜4倍の32〜64検体の同時処理が可能となる。また、アガロースゲルを使用することにより、数bpの差を検出することは出来ないが、その反面、泳動による誤差が少ないことから誤判定し易いという難点も解消される。
本発明に関連して用いる以下の用語は、当該技術分野でよく知られているように、それぞれ、下記の意味を有するものである。
SSR:「simple sequence repeat」の略称であり、DNAに存在する単純繰り返し配列である。
マルチプレックス:1つのPCR反応において複数の組(セット)のプライマー(プライマー対)を使用することであり、同時に複数のゲノム領域を増幅することができる。
RAPD−STS:ランダムな配列をプライマーとしてPCRを行い、増幅されるDNA断片のパターンの違いで元の配列の差異を検出する(random amplified polymorphic DNA)に際して、STS(sequence tagged site)化、すなわち、RAPDプライマーによるDNA増幅断片の塩基配列を調べて新たに1対のプライマーを設計することで特異性を高めることができる。
背景技術に関連した既述の説明から理解されるように、SSR法によるDNA増幅及び分析するための従来の手法においては、単一のチューブごとに単一のプライマー(プライマー対)を用いてPCR反応を実施し、後続のDNA解析では、アクリルアミドゲル、バイオアナライザー等の分離能力の高い機器を用いてPCR産物のサイズを決定している。また、RAPD−STS化法のように増幅させるDNAサイズの差が大きい場合には、十分に分離できる手法としてアガロースゲルが用いられている。
SSR:「simple sequence repeat」の略称であり、DNAに存在する単純繰り返し配列である。
マルチプレックス:1つのPCR反応において複数の組(セット)のプライマー(プライマー対)を使用することであり、同時に複数のゲノム領域を増幅することができる。
RAPD−STS:ランダムな配列をプライマーとしてPCRを行い、増幅されるDNA断片のパターンの違いで元の配列の差異を検出する(random amplified polymorphic DNA)に際して、STS(sequence tagged site)化、すなわち、RAPDプライマーによるDNA増幅断片の塩基配列を調べて新たに1対のプライマーを設計することで特異性を高めることができる。
背景技術に関連した既述の説明から理解されるように、SSR法によるDNA増幅及び分析するための従来の手法においては、単一のチューブごとに単一のプライマー(プライマー対)を用いてPCR反応を実施し、後続のDNA解析では、アクリルアミドゲル、バイオアナライザー等の分離能力の高い機器を用いてPCR産物のサイズを決定している。また、RAPD−STS化法のように増幅させるDNAサイズの差が大きい場合には、十分に分離できる手法としてアガロースゲルが用いられている。
これに対して、本発明のDNA増幅及び解析法は、従来行われていないSSRプライマーをマルチプレックスにしている。本発明は、RAPD−STS化法のマルチプレックスと同様にPCR産物のサイズが重ならないプライマーから成るだけでなく、PCR産物のサイズが重なるプライマーから成ることは、これまでにない奇抜なDNA増幅及び解析法である。すなわち、本発明の方法は、本来は、RAPD−STS化法のように増幅させるDNAサイズの差が大きく、PCR産物の有無で判別するプライマーをマルチプレックスにしていたものをSSRマーカーに用いて、高精度な分析が可能となるように構成されている。本発明に従うDNA増幅及び解析法のこのような特徴は、プライマーの混合方式及びアガロースゲルの分離能力が低いことを逆手に取ることで実現されたものである。
上述したように、本発明のDNA増幅及び解析法の特徴は、単純にPCR産物のサイズが重ならないプライマーをマルチプレックスにしただけではなく、PCR産物のサイズが重なるプライマーもマルチプレックスにして使用することにある。
図1は、本発明に従いマルチプレックスPCRに用いられるSSRプライマー(正確にはプライマー対であるが、以下、単にプライマーということもある。)の選別の仕方を示すものである。
まず、品種間で多型の得られたSSRプライマーを用いて、プライマーごとに、対象とする品種(識別すべき特定の品種)と他品種(混入のある品種)のDNAをPCRで増幅し、そのPCR産物のサイズを、2.0〜4.0%のアガロース濃度の電気泳動により測定しておく。
図1は、本発明に従いマルチプレックスPCRに用いられるSSRプライマー(正確にはプライマー対であるが、以下、単にプライマーということもある。)の選別の仕方を示すものである。
まず、品種間で多型の得られたSSRプライマーを用いて、プライマーごとに、対象とする品種(識別すべき特定の品種)と他品種(混入のある品種)のDNAをPCRで増幅し、そのPCR産物のサイズを、2.0〜4.0%のアガロース濃度の電気泳動により測定しておく。
PCR産物のサイズが重ならないSSRプライマーを選出する場合、図1の上段(イ)に記載されたプライマーAとプライマーBのように、対象品種のDNAバンドの位置及び他品種のDNAバンドの位置がいずれも異なっているプライマーを選出する。PCR産物のDNAサイズが一般的には互いに100bp程度離れているようになるSSRプライマーを選出することにより、2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲルを用いる電気泳動においてもPCR産物のDNAバンドが互いに重ならず、解析が可能となる。
他方、PCR産物のサイズが重なるSSRプライマーを選出する場合、図1の下段(ロ)に記載されたプライマーCとプライマーDのように、対象品種のDNAバンドの位置は重なるが、他品種のバンドが重ならないようなプライマーを選出する。この場合は、対象品種については、そのPCR産物のDNAサイズの差が5bp以内であり、2.0〜4.0%の濃度のアガロースゲルでは明確に分離できないが、他品種についてはPCR産物のDNAサイズが如上のように明確に分離できるようなSSRプライマーの組合せとなる。
かくして、本発明に従えば、図1に沿って説明したプライマーAとプライマーBのような複数のSSRプライマーを用いるマルチプレックスPCRにより検体中のDNAを増幅した後、そのPCR産物を2.0〜4.0%のアガロース濃度の電気泳動に供することにより、図1の(イ)および(ロ)の右端に示すような電気泳動パターンが得られるので、検体中の特定の品種を識別しおよび/または他の品種の混入を検知することができる。
図1に沿う以上の説明においては、2組(2セット)のプライマーを用いているが、更に多くの組のプライマーを用いても同様に分析が可能であり、また、図1の(イ)に示すようにPCR産物のサイズの重ならないプライマーを用いる手法と、図1の(ロ)に示すようにPCR産物のサイズの重なるプライマー対を用いる手法とを組み合わせて実施することもできる。
本発明の方法は、検体の種類に応じて、既に知られているSSRプライマーから上記のように複数のセットのプライマーを選出したり、あるいは、新たにSSRプライマーを設計して上記のような条件を満たすような複数のセットのプライマーを選出することにより実施することができる。
本発明におけるPCR産物の分離・解析は2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われる。アガロースゲルの濃度が高すぎると、PCR産物の分離能が大きすぎてSSRプライマーを用いてPCRを行う本発明の目的を達し得ない。勿論、アガロースゲルの濃度が低すぎると、そもそもPCR産物を分離することができなくなる。
SSRプライマーを用いる本発明のマルチプレックス法に使用する試薬ついては、特に限定されるものではなく、Taqポリメラーゼに付属する試薬が使用可能である。特に好ましい緩衝液としては、1Mトリス塩酸バッファー、塩化マグネシウムおよび1M DTTから構成され、酵素の安定性を高める目的としてTritonX−100やBSAを0.01%添加したLowバッファーである。
本発明のマルチプレックス法に使用する試薬量については、1チューブごとに1プライマーを用いる従来から知られたPCR反応と同様の試薬量で行うことが可能である。しかしながら、使用するプライマーによっては、Taqポリメラーゼ不足と考えられるDNA増幅量の低下が確認されている。ある特定のSSRプライマーをマルチプレックスにする場合、基本使用量の1.5〜2.5倍量のTaqポリメラーゼを添加することで良好なDNA増幅を行うことが可能である。また、Taqポリメラーゼの種類を変更することで代用ができる。
本発明に従えば、如上の本発明のDNA増幅を行うPCR反応サイクルと温度、時間は、1チューブごとに1プライマーのPCR反応と同様のサイクルで行うことが可能である。ただし、サーマルサイクラーの機種によっては、同条件のPCR増幅に差が生じることから、アニーリングの温度、サイクル数、反応時間は、下記の範囲内で調節することにより、効率的な増幅が見込まれる。
本発明のマルチプレックス法を用いるDNAの増幅は、SSRプライマーを混合することから1チューブごとに1プライマーのPCR反応では見られなかった増幅阻害が見られることがある。通常、Taqポリメラーゼの量を増やすことで対応が可能であるが、それでも改善が見られない場合には、プライマーの濃度を調節することや、試薬の総量を変更することで改善される。プライマーの濃度は、DNA増幅量の多いプライマー濃度を通常の20〜80%に減らすとよい。また、試薬の総量を20μlから50μlに変更するとよい。
本発明は、農産物(植物体、籾、玄米、精米、炊飯米、加工品)、畜産物(肉、加工品)、水産物(魚肉、加工品)、毛髪(毛根付き毛髪、毛幹)、さらには、体液(血液、精液など)、微生物(細菌など)等の各種検体(生物試料)のSSR法による分析に適用することができるが、これらに限定されるものではない。本発明のDNA増幅及び解析法に従えば、農産物、畜産物、水産物、毛髪、体液、微生物のいずれの検体においてもDNA増幅及び解析が可能である。
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、検体の種類、SSRプライマー、試薬などにおいて本発明は以下の実施例に示すものに限定されるものではない。
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、検体の種類、SSRプライマー、試薬などにおいて本発明は以下の実施例に示すものに限定されるものではない。
(試薬の調製)
DNA増幅は、下記のi〜viに示す試薬を調合して実施する。
I DW(蒸留水) 9.8μl
Ii 10×PCRバッファー(付属) 2.0μl
Iii dNTP(2.5mMeach 付属) 1.0μl
Iv Taqポリメラーゼ(2.5unit/μl) 0.2μl
V プライマー(各4pmol/μl) 2.0μl
Vi テンプレート(5〜20ng) 5.0μl
DNA増幅は、下記のi〜viに示す試薬を調合して実施する。
I DW(蒸留水) 9.8μl
Ii 10×PCRバッファー(付属) 2.0μl
Iii dNTP(2.5mMeach 付属) 1.0μl
Iv Taqポリメラーゼ(2.5unit/μl) 0.2μl
V プライマー(各4pmol/μl) 2.0μl
Vi テンプレート(5〜20ng) 5.0μl
(大豆のDNA分析)
大豆50gをミルサーにより粉砕し、粉砕物から1.5mlチューブにスパーテルにて検体として0.1g採取した。この検体に、DNA抽出バッファーを1000μl加えて攪拌後、60℃において10分加温した。その後、実施例1で調製したクロロホルム−イソアミルアルコールを500μl添加後、1分間転倒攪拌した。
次いで、遠心操作(16000g、10分)に供し、上澄み液を別の1.5mlチューブに300μl採取して2−プロパノールを200μl加えて攪拌した。5分静置後に遠心操作(16000g、20分)にかけ、上澄みを廃棄して沈殿物を乾燥した。これに70%エタノールを200μl添加後、すぐに廃棄した。エタノールを気化させた後、1×TE(Tris-EDTA)10μlを加えて冷蔵庫にて保管した。PCRに使用する際には、100倍に希釈して用いた。PCR反応は、実施例1に記述のとおり、2.5unit/μlのTaq
DNAポリメラーゼ(北海道システム・サイエンス製)、付属の10×バッファー、MgCl2、dNTP、鋳型DNA、プライマーを含む総量20μlの反応液を用いて行った。PCR反応は、バイオラッド社のiCycle(商標)サーマルサイクラーにより94℃で30秒(熱変性)、47℃で40秒(アニーリング反応)、72℃で60秒(伸長反応)を1サイクルとするサイクルを35回行い、最後に伸長反応を完全に終わらせるために72℃で5分間保温した。
PCR産物は、0.5×TBEバッファーにて2.5%アガロースゲルで、日本エイドー製大型サブマリン電気泳動装置を用いて230V−1時間15分の条件で電気泳動を行った。増幅産物を臭化エチジウムにより染色後、紫外線照射によりDNAバンドパターンを検出した。
大豆50gをミルサーにより粉砕し、粉砕物から1.5mlチューブにスパーテルにて検体として0.1g採取した。この検体に、DNA抽出バッファーを1000μl加えて攪拌後、60℃において10分加温した。その後、実施例1で調製したクロロホルム−イソアミルアルコールを500μl添加後、1分間転倒攪拌した。
次いで、遠心操作(16000g、10分)に供し、上澄み液を別の1.5mlチューブに300μl採取して2−プロパノールを200μl加えて攪拌した。5分静置後に遠心操作(16000g、20分)にかけ、上澄みを廃棄して沈殿物を乾燥した。これに70%エタノールを200μl添加後、すぐに廃棄した。エタノールを気化させた後、1×TE(Tris-EDTA)10μlを加えて冷蔵庫にて保管した。PCRに使用する際には、100倍に希釈して用いた。PCR反応は、実施例1に記述のとおり、2.5unit/μlのTaq
DNAポリメラーゼ(北海道システム・サイエンス製)、付属の10×バッファー、MgCl2、dNTP、鋳型DNA、プライマーを含む総量20μlの反応液を用いて行った。PCR反応は、バイオラッド社のiCycle(商標)サーマルサイクラーにより94℃で30秒(熱変性)、47℃で40秒(アニーリング反応)、72℃で60秒(伸長反応)を1サイクルとするサイクルを35回行い、最後に伸長反応を完全に終わらせるために72℃で5分間保温した。
PCR産物は、0.5×TBEバッファーにて2.5%アガロースゲルで、日本エイドー製大型サブマリン電気泳動装置を用いて230V−1時間15分の条件で電気泳動を行った。増幅産物を臭化エチジウムにより染色後、紫外線照射によりDNAバンドパターンを検出した。
表1および表2は、対象品種として品種名「サチユタカ」の大豆、他品種として品種名「トヨコマチ」の大豆のDNA分析を行った場合を例に、使用したSSRプライマーの塩基配列を示す。表1は、図1の(イ)に沿って既述したように、対象品種及び他品種のPCR産物の電気泳動バンドが重ならないSSRプライマー(プライマー対)を用いる場合を例示するものであり、その電気泳動図が図2である。表2は、図1の(ロ)に沿って既述したように、対象品種のPCR産物の電気泳動バンドは重なるが、他品種のPCR産物の電気泳動パターンは重ならないようなSSRプライマー(プライマー対)を用いる場合を例示するものであり、その電気泳動図が図3である。
対象とする特定品種(この例では、大豆サチユタカ)を識別することができ(図2のレーン5参照)、さらに、他の品種(この例では、大豆トヨコマチ)の混入を検知することができる(図2のレーン6および図3のレーン5参照)。
対象とする特定品種(この例では、大豆サチユタカ)を識別することができ(図2のレーン5参照)、さらに、他の品種(この例では、大豆トヨコマチ)の混入を検知することができる(図2のレーン6および図3のレーン5参照)。
Claims (3)
- 検体中の特定の品種を識別しおよび/または他の品種の混入を検知する方法であって、検体中のDNAをPCR反応で増幅する工程、および増幅後のPCR産物を分離し解析する工程を含む方法において、前記PCR増幅工程が複数のSSRプライマー対を用いるマルチプレックスによって行われることを特徴とする方法。
- 前記PCR産物の分離・解析工程が2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種及び混入の可能性のある品種のPCR産物の電気泳動バンドが重ならないような複数のSSRプライマー対を用いることを特徴とする請求項1の方法。
- 前記PCR産物の分離・解析工程が2.0〜4.0%のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種のPCR産物の電気泳動バンドは重なるが、混入の可能性のある品種のPCR産物の電気泳動バンドは重ならないような複数のSSRプライマー対を用いることを特徴とする請求項1の方法。
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CN104351096A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-02-18 | 苏州大学 | 一种大鳞副泥鳅良种选育方法 |
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2005
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