JP6413122B2 - キノコの同定方法、及び、同定キット - Google Patents
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イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素により、当該塩基配列に対応する領域を含むDNAを切断する切断工程と、
前記切断工程により切断されたDNAの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコを同定する同定工程と、
を含み、
前記制限酵素は、MslI、DdeI、HincII、及びHaeIIIである。
前記同定工程では、前記MslIが切断したDNAの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジを同定してもよい。
前記切断工程では、前記増幅工程により増幅されたPCR産物を切断してもよい。
イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域を、塩基配列が配列番号5に示されるフォワードプライマー、塩基配列が配列番号6に示されるリバースプライマー、及び塩基配列が配列番号7に示されるリバースプライマーを用いてPCR増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により増幅されたPCR産物に対して、塩基配列が配列番号8に示されるプローブ、塩基配列が配列番号9に示されるプローブ、塩基配列が配列番号10に示されるプローブ、及び塩基配列が配列番号11に示されるプローブの少なくともいずれかを用いて前記イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコを同定する同定工程と、
を含む。
イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素MslI、DdeI、HincII、及びHaeIIIを備える。
こととしてもよい。
こととしてもよい。
イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域をPCR増幅するための、塩基配列が配列番号5に示されるフォワードプライマー、塩基配列が配列番号6に示されるリバースプライマー、及び塩基配列が配列番号7に示されるリバースプライマーと、
塩基配列が配列番号8に示されるプローブ、塩基配列が配列番号9に示されるプローブ、塩基配列が配列番号10に示されるプローブ、及び塩基配列が配列番号11に示されるプローブの少なくともいずれかと、
を備える。
本実施の形態に係るキノコの同定方法では、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種からDNA(塩基)を抽出する。DNAを抽出するキノコは、日本の野山に自生しているキノコに限定されず、世界各地に自生しているキノコも含まれる。また、同定するキノコは、生のキノコに限定されず、冷凍キノコ、乾燥キノコ、及び、裁断されたキノコ、加熱調理されたキノコなど任意である。キノコからDNAを抽出する方法は、通常公知の方法が使用できる。具体的には、同定するキノコを洗浄後に、PCR−RFLP法に供するため、フェノール法或いは市販の核酸抽出用のキット(QIAGEN社製、タカラバイオ社製など)により、このキノコ由来の試料からDNAを抽出する。
本実施の形態におけるキノコの同定方法は、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ及びこれらの近縁種に、特異的なプローブを用いる。
本実施の形態に係る同定キットは、PCR−RFLP法を用いて、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を同定するキット、及び、キノコを同定後に、同定したキノコの食毒を判定するキットである。同定キットは、キノコの核リボソームRNAをコードする遺伝子rDNAのITS1−5.8S−ITS2領域の塩基配列の変異を認識する制限酵素MslI、DdeI、HincII、及び/又は、HaeIIIを備える。同定キットの形態として、例えば、上述したプライマー、及び、プライマーを用いて遺伝子多型の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。また、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩又はマンガン塩等)、酵素や鋳型を安定化する保護剤、必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキット化することもできる。
本実施の形態に係る同定キットは、リアルタイム−PCR法を用いて、クサウラベニタケ、イッポンシメジ、ウラベニホテイシメジ、及び、これらの近縁種を同定するキット、及び、キノコを同定後に、同定したキノコの食毒を判定するキットである。同定キットは、クサウラベニタケ及びこの近縁種のrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域の全長又は一部をPCR増幅するためのプライマーと、当該プライマーで増幅されたPCR産物に特異的なプローブと、を備える。同定キットは、緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩又はマンガン塩等)、酵素や鋳型を安定化する保護剤、必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類を備えていてもよい。
キノコの形態に基づいて、ウラベニホテイシメジ、クサウラベニタケ、イッポンシメジの何れかに該当すると判別できた自生していたキノコを、日本国内から38サンプル採取した。この採取した38サンプルのキノコの核リボソームRNAをコードする遺伝子rDNAのITS1−5.8S−ITS2領域の塩基配列を、ダイレクトシークエンスすることにより、塩基配列に基づく系統樹解析を行った。そして、この系統樹解析から38サンプルのキノコを分類した。
次に、日本国内で採取した38サンプルのキノコの核リボソームRNAをコードする遺伝子rDNAのITS1−5.8S−ITS2領域の塩基配列を、PCR−RFLP法を用いて解析することにより、キノコの同定を行った。
キノコの加熱調理後又は消化後には、キノコのDNAは、短い断片に分解されてしまう。実用面を考慮して短い断片からも毒性のキノコを判定するために、ITS1−5.8S−ITS2領域に含まれる特定の短い領域を解析対象として、キノコの食毒判定を検討した。
サンプル中に複数の食用のキノコが混在する場合であっても、上記実施例3の方法を用いて毒性のキノコの有無を判定できることを確認した。
リアルタイム−PCR法を用いてクサウラベニタケ、イッポンシメジ及びウラベニホテイシメジを同定できるか検討した。PCRチューブに、25μl反応系において、2x FastStart Universal Probe Master 12.5μl、50μM Forward-primer 0.25μl、50μM Reverse-primer 0.25μl、10μM クサウラベニタケ特異的プローブ 0.5μl、10μM イッポンシメジ特異的プローブ 0.5μl、10μM ウラベニホテイシメジ特異的プローブ 0.5μl、10ng/μl サンプル(テンプレート) 0.5μl、Distilled water 9.5μlを添加して、調製した。リアルタイム−PCR装置は、Roch LightCycler(登録商標)96を用いた。PCRの条件は、95℃で10分間を1サイクル、次に95℃で15秒間、60℃で1分間を1サイクルとして40サイクルとした。
Claims (13)
- イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素により、当該塩基配列に対応する領域を含むDNAを切断する切断工程と、
前記切断工程により切断されたDNAの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコを同定する同定工程と、
を含み、
前記制限酵素は、MslI、DdeI、HincII、及びHaeIIIである、
キノコの同定方法。 - 前記同定工程では、前記キノコがウラベニホテイシメジ、クサウラベニタケ又はイッポンシメジであることを同定する、
ことを特徴とする請求項1に記載のキノコの同定方法。 - 前記同定工程では、前記MslIが切断したDNAの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジを同定する、
ことを特徴とする請求項1又は2に記載のキノコの同定方法。 - 前記同定工程では、前記DdeIが切断したDNAの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ、クサウラベニタケ及びイッポンシメジを同定する、
ことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか1項に記載のキノコの同定方法。 - 前記同定工程では、前記DdeI、前記HincII及び前記HaeIIIが切断したDNAの塩基配列の長さの違いに基づいて、ウラベニホテイシメジ、クサウラベニタケ及びイッポンシメジを同定する、
ことを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載のキノコの同定方法。 - 前記同定工程では、前記切断工程により切断されたDNAを電気泳動する、
ことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載のキノコの同定方法。 - イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域の全長又は一部をPCR増幅する増幅工程をさらに含み、
前記切断工程では、前記増幅工程により増幅されたPCR産物を切断する、
ことを特徴とする請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキノコの同定方法。 - 前記増幅工程では、塩基配列が配列番号3に示されるプライマー及び塩基配列が配列番号4に示されるプライマーを用いてPCR増幅する、
ことを特徴とする請求項7に記載のキノコの同定方法。 - イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域を、塩基配列が配列番号5に示されるフォワードプライマー、塩基配列が配列番号6に示されるリバースプライマー、及び塩基配列が配列番号7に示されるリバースプライマーを用いてPCR増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により増幅されたPCR産物に対して、塩基配列が配列番号8に示されるプローブ、塩基配列が配列番号9に示されるプローブ、塩基配列が配列番号10に示されるプローブ、及び塩基配列が配列番号11に示されるプローブの少なくともいずれかを用いて前記イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコを同定する同定工程と、
を含むキノコの同定方法。 - イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域における塩基配列の変異を認識する制限酵素MslI、DdeI、HincII、及びHaeIIIを備えるイッポンシメジ(Entoloma)属のキノコ同定用の同定キット。
- イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域の全長又は一部をPCR増幅するためのプライマーをさらに備える、
ことを特徴とする請求項10に記載の同定キット。 - 前記プライマーは、塩基配列が配列番号3に示されるプライマー及び塩基配列が配列番号4に示されるプライマーである、
ことを特徴とする請求項11に記載の同定キット。 - イッポンシメジ(Entoloma)属のキノコのrDNAのITS1−5.8S−ITS2領域をPCR増幅するための、塩基配列が配列番号5に示されるフォワードプライマー、塩基配列が配列番号6に示されるリバースプライマー、及び塩基配列が配列番号7に示されるリバースプライマーと、
塩基配列が配列番号8に示されるプローブ、塩基配列が配列番号9に示されるプローブ、塩基配列が配列番号10に示されるプローブ、及び塩基配列が配列番号11に示されるプローブの少なくともいずれかと、
を備えるイッポンシメジ(Entoloma)属のキノコ同定用の同定キット。
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