KR101534271B1

KR101534271B1 - 옥돔과 품종 판별용 프라이머, 이를 이용한 옥돔 원산지 판별방법 및 옥돔과 품종 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR101534271B1
Application number: KR1020120138966A
Authority: KR
Inventors: 황창남; 황은미; 오윤철; 윤상린; 서장우
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-12-03
Filing date: 2012-12-03
Publication date: 2015-07-09
Also published as: KR20140071059A

Abstract

본 발명은 옥돔(Branchiostegus)과에 속하는 종의 품종을 판별할 수 있는 프라이머, 이를 이용한 옥돔과 품종 판별방법 및 옥돔과 품종 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드에 대한 것으로, 서열번호 3, 5 또는 7 및 서열번호 4, 6 또는 8의 염기서열을 쌍으로 가지는 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 경우 옥돔(Branchiostegus japonicus)과 옥두어(Branchiostegus albus)를 판별할 수 있고, 서열번호 12 또는 13의 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 마커를 이용하면 등흑점옥두어(Branchiostegus argentatus)과 황옥돔(Branchiostegus auratus)을 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 효과가 있다.

Description

옥돔과 품종 판별용 프라이머, 이를 이용한 옥돔 원산지 판별방법 및 옥돔과 품종 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드{Primer for identifying kind of Branchiostegus, Method for identifying kind of Branchiostegus using the same, and Polynucleotide for identifying kind of Branchiostegus}

본 발명은 옥돔(Branchiostegus)과 품종 판별용 프라이머, 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 옥돔과 품종 판별방법에 대한 것으로, 특히 옥돔과에 속하는 종의 품종을 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 것이다.

옥돔 품종은 농어목 옥돔과에 속하며, 대륙붕 수심 100∼150m의 바닥이 진흙, 모래진흙에 서식하며 주로 우리나라 제주도, 동중국해, 남중국해, 필리핀, 베트남을 포함하는 북서태평양 전역에 분포한다.

옥돔과에 속하는 품종은 옥돔(Branchiostegus japonicus), 옥두어(Branchiostegus albus), 등흑점옥두어(Branchiostegus argentatus), 황옥돔(Branchiostegus auratus) 4종으로 분류되며, 국내에서도 가장 대표적 고급어종인 옥돔은 제주 특유의 전통 특산물로 아주 오랜 옛날부터 생선 중에서도 가장 귀한 어종으로 알려져 왔다.

제주산 옥돔은 근래 제주바다의 수온변화로 1995년 기준 생산량 1847t, 어획고 210억원에서, 2000년 1521t, 171억원, 2005년 971t, 128억원, 2011년에는 803t, 162억원으로 지속적인 감소추세에 있다(농림수산식품부, 수산정보포털 참조). 점차 옥돔의 어획량이 줄어들고 가격이 치솟으면서, 이와 유사한 중국산 옥두어를 옥돔으로 둔갑시켜 파는 상황이 증가하고 있다. 옥두어는 옥돔의 유사종으로 흔히 중국산 옥돔 또는 백옥돔으로 불리는데 옥돔과 동일종으로 취급되면서 옥돔의 절반 가격 이하로 수입되고 있고, 유통과정에서 옥돔으로 둔갑할 우려가 있다.

일반적으로 옥돔품종 간의 분류는 형태에 근거하여 육안으로 식별하는 방법을 사용하였다. 이로 인해 처리가 느리고 정확성이 떨어지며 특히, 가공 처리될 경우 형태에 근거한 식별이 불가능한 경우가 자주 발생하였다. 따라서, 원산지 판별 수산물 검사의 정확성을 높이고 처리 속도를 향상시키며, 가공품의 종 식별에도 가능한 객관적 표준척도의 확립이 시급하다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 옥돔의 품종을 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 옥돔 품종 판별방법을 제공하는 것이 목적이다.

또한, 본 발명은 옥돔의 품종을 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 옥돔 품종 판별방법을 제공하는 것이 목적이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 옥돔과 품종 판별용 프라이머 세트는, 서열번호 3의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 것이다.

그리고, 본 발명의 다른 일 구체예는, 서열번호 5의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 6의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 옥돔과 품종 판별용 프라이머 세트이다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 구체예는, 서열번호 7의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 옥돔과 품종 판별용 프라이머 세트이다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 옥돔과에 속하는 종에서 핵산분자를 분리하는 단계; 상기 분리한 핵산분자를 상기한 프라이머 세트로 증폭시킨 증폭 산물을 얻는 단계; 및 상기 얻은 증폭 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 옥돔과 품종 판별 방법이다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는, 서열번호 12의 2번째 뉴클레오타이드, 6번째 뉴클레오타이드, 470번째 뉴클레오타이드, 473번째 뉴클레오타이드, 474번째 뉴클레오타이드, 493번째 뉴클레오타이드, 505번째 뉴클레오타이드 또는 582번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8~100개의 연속된 뉴클레오티드로 구성되며 옥돔과 품종 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적(complementary) 폴리뉴클레오티드이다.

일 구체예로써, 본 발명은 서열번호 13의 3번째 뉴클레오타이드, 75번째 뉴클레오타이드, 473번째 뉴클레오타이드, 477번째 뉴클레오타이드, 479번째 뉴클레오타이드, 480번째 뉴클레오타이드, 482번째 뉴클레오타이드, 485번째 뉴클레오타이드, 486번째 뉴클레오타이드, 489번째 뉴클레오타이드, 501번째 뉴클레오타이드, 502번째 뉴클레오타이드, 503번째 뉴클레오타이드, 504번째 뉴클레오타이드, 513번째 뉴클레오타이드, 557번째 뉴클레오타이드, 576번째 뉴클레오타이드, 598번째 뉴클레오타이드, 614번째 뉴클레오타이드, 628번째 뉴클레오타이드, 636번째 뉴클레오타이드, 642번째 뉴클레오타이드, 648번째 뉴클레오타이드 또는 650번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8~100개의 연속된 뉴클레오티드로 구성되며 옥돔과 품종 판별에 유용한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적(complementary) 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

이러한 본 발명은 서열번호 3, 5 또는 7 및 서열번호 4, 6 또는 8의 염기서열을 쌍으로 가지는 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 하여, 옥돔(Branchiostegus japonicus)과 옥두어(Branchiostegus albus)를 판별할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 12 또는 13의 단일뉴클레오타이드다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 마커를 이용하여, 등흑점옥두어(Branchiostegus argentatus)과 황옥돔(Branchiostegus auratus)을 정확하고 간단하게 판별할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머(Bra CO2-2 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머(Bra ND1-3 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머(Bra ND2-3 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고,
도 4는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머(Bra CO2-1 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물을, 제한효소 RsaⅠ으로 처리한 사이토크롬 씨 옥시다아제 서브유니트 2(cytochrome c oxidase subunit 2) 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고,
도 5는 도 4의 등혹점옥두어 증폭 산물에 대한 사이토크롬 씨 옥시다아제 서브유니트 2 산물의 염기서열(서열번호 12)과, 황옥돔 증폭 산물에 대한 사이토크롬 씨 옥시다아제 서브유니트 2 산물의 염기서열(서열번호 13) 및 이에 따른 컨센서스(consensus)를 나타내는 염기서열도이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어 "핵산분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 명세서에서 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 따른 옥돔 품종 판별용 프라이머는, 서열번호 3의 염기서열이나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 쌍으로 포함한다. 본 발명자들은 상기 서열번호 3의 제1 폴리뉴클레오티드와 상기 서열번호 4의 제2 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 사용하여, 옥돔과에 속하는 종의 핵산 분자를 증폭시키면, 그 증폭된 산물은 상기 옥돔의 품종에 따라 다르다는 것을 확인한 후 본 발명을 완성하였다. 즉, 옥돔(Branchiostegus japonicas)을 판별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 서열번호 5의 염기서열이나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 6의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 쌍으로 포함하는 옥돔 원산지 판별용 프라이머일 수 있다. 본 발명자들은 서열번호 5의 제1 폴리뉴클레오티드와 상기 서열번호 6의 제2 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 사용하여, 옥돔과에 속하는 종의 핵산 분자를 증폭시키면, 그 증폭된 산물은 상기 옥돔의 품종에 따라 다르다는 것을 확인한 후 본 발명을 완성하였다. 즉, 옥돔(Branchiostegus japonicas)을 판별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 일 구체예는, 서열번호 7의 염기서열이나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 8의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 쌍으로 포함하는 옥돔 원산지 판별용 프라이머일 수 있다. 본 발명자들은 서열번호 7의 제1 폴리뉴클레오티드와 상기 서열번호 8의 제2 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 사용하여, 옥돔과에 속하는 종의 핵산 분자를 증폭시키면, 그 증폭된 산물은 상기 옥돔의 품종에 따라 다르다는 것을 확인한 후 본 발명을 완성하였다. 즉, 옥두어(Branchiostegus albus)를 판별할 수 있음을 확인하였다.

이러한 본 발명은 서열번호 3, 5 또는 7 및 서열번호 4, 6 또는 8의 염기서열을 쌍으로 가지는 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 하여, 옥돔(Branchiostegus japonicus)과 옥두어(Branchiostegus albus)를 정확하고 간단하게 판별할 수 있다.

상기한 본 발명에 있어서, 상기 제1폴리뉴클레오티드는 정방향 또는 역방향 프라이머이고, 상기 제2폴리뉴클레오티드는 역방향 또는 정방향 프라이머로 사용하는 것이 바람직하다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 옥돔과에 속하는 종에서 핵산분자를 분리하는 단계(S10); 상기 분리한 핵산분자를 상기한 프라이머로 증폭시킨 증폭 산물을 얻는 단계(S20); 및 상기 얻은 증폭 산물을 분석하는 단계(S30);를 포함하는 옥돔과 품종 판별 방법이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 옥돔의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다. 본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다. 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법으로 총 RNA를 분리하여 실시할 수 있다.

그런 다음에서는, 상기 분리한 핵산분자를 본 발명에 따른 프라이머로 증폭시켜서 증폭 산물을 얻는다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭(참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 방법으로 증폭한다. PCR에 의한 증폭 반응의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 프라이머로 증폭시키면, 옥돔의 품종에 따라 다른 크기, 중량 또는 이온량을 가지는 증폭 산물이 산출되는데, 이는 옥돔의 품종에 따른 염기서열의 차이로 인해, 본 발명의 프라이머에 대한 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하였기 때문인 것으로 예상된다.

본 발명에 있어서, 상기 얻은 증폭 산물을 분석하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 증폭 산물의 크기, 중량 또는 이온량을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 일례로, 상기 얻은 증폭 산물을 분석하는 것은 상기 얻은 증폭 산물의 전기영동 밴드를 확인하는 것일 수 있다. 바람직하게는 이미 알고 있는 옥돔 품종별 전기영동 밴드와 비교하는 것이 적합하다. 옥돔 품종별로 증폭 산물의 크기, 중량 또는 이온량이 다르기 때문에, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, 그 차이를 통하여 옥돔의 품종 판별이 가능하다. 또한, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 품종을 달리하는 옥돔 집단에서 품종에 따라 서로 구분되는 다수의 염기서열, 즉 새로운 단일뉴클레오타이드다형성(SNP) 마커를 발견하였다. 이러한 마커는 옥돔 품종에 따라 서로 다른 염기를 가지는바, 상기 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 프라이머 또는 프로브로 사용하면, 옥돔의 품종을 간단하고 용이하게 판별하는 것이 가능하다.

상기와 같은 SNP 마커를 찾기 위하여, 본 발명자들은 서열번호 1의 제1 폴리뉴클레오티드와 서열번호 2의 제2 폴리뉴클레오티드를 프라이머 쌍으로 사용하여 옥돔과에 속하는 품종의 핵산 분자를 증폭시킴으로써, 사이토크롬 씨 옥시다아제 서브유니트 2(cytochrome c oxidase subunit 2) 유전자 부위를 포함하는 동일한 크기(550bp)의 산물을 얻었고, 상기 얻은 산물의 어종 별 특이 염기서열 내 제한효소 site를 분석한 결과, 제한효소 RsaⅠ를 처리하여 얻은 산물에서 등흑점옥두어(Branchiostegus argentatus)와 황옥돔(Branchiostegus auratus) 간에 서로 차이가 나는 SNP 마커를 발견하였다.

구체적으로, 상기 서열번호 12의 2번째 뉴클레오타이드는 G, 6번째 뉴클레오타이드는 C, 470번째 뉴클레오타이드는 C, 473번째 뉴클레오타이드는 C, 474번째 뉴클레오타이드는 C, 493번째 뉴클레오타이드는 T, 505번째 뉴클레오타이드는 T 또는 582번째 뉴클레오타이드는 T인 경우, 이것은 등흑점옥두어(Branchiostegus argentatus) 판별에 유용한 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드이다.

또한, 상기 서열번호 13의 3번째 뉴클레오타이드는 C, 75번째 뉴클레오타이드는 G, 473번째 뉴클레오타이드는 G, 477번째 뉴클레오타이드는 T, 479번째 뉴클레오타이드는 G, 480번째 뉴클레오타이드는 C, 482번째 뉴클레오타이드는 G, 485번째 뉴클레오타이드는 C, 486번째 뉴클레오타이드는 T, 489번째 뉴클레오타이드는 T, 501번째 뉴클레오타이드는 C, 502번째 뉴클레오타이드는 A, 503번째 뉴클레오타이드는 T, 504번째 뉴클레오타이드는 G, 513번째 뉴클레오타이드는 T, 557번째 뉴클레오타이드는 G, 576번째 뉴클레오타이드는 G, 598번째 뉴클레오타이드는 G, 614번째 뉴클레오타이드는 G, 628번째 뉴클레오타이드는 G, 636번째 뉴클레오타이드는 G, 642번째 뉴클레오타이드는 G, 648번째 뉴클레오타이드는 C 또는 650번째 뉴클레오타이드는 C인 경우, 이것은 황옥돔(Branchiostegus auratus) 판별에 유용한 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드이다.

이러한 본 발명의 SNP 마커는 옥돔에 적용되며, 바람직하게는 등흑점옥두어(Branchiostegus argentatus)과 황옥돔(Branchiostegus auratus)에 적용된다.

이와 함께, 본 발명의 다른 실시형태는, 옥돔에서 핵산분자를 분리하는 단계; 및 상기 분리한 핵산분자에 대하여, 상기 서열번호 12 및/또는 서열번호 13의 상기 지정된 위치에 해당하는 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 단계;를 포함하는 옥돔 원산지 판별 방법이다.

상기 옥돔에서 핵산분자를 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 상기한 바와 같다.

상기 뉴클레오타이드의 염기타입을 확인하는 것 역시, 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 옥돔 품종에 따라 상기 지정된 위치에 해당하는 뉴클레오타이드의 염기서열이 다르므로, 품종을를 알고자 하는 옥돔의 상기 염기서열을 확인하면 옥돔의 품종 구분이 가능하고, 이것을 미리 기 저장된 품종별 옥돔 염기서열과 비교함으로써 정확한 품종 판별이 가능하다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

먼저, 본 실시예에서는 옥돔 품종인 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어의 mitochondrion complete genome 정보를 바탕으로 제작한 primer을 이용하여 RFLP-PCR을 수행한 결과, 옥돔을 판별할 수 있는 2개의 specific primer와 옥두어를 판별할 수 있는 1개의 specific primer를 선발하였다.

또한, Bra CO2-1 primer을 이용하여 4종의 품종에서 동일하게 생성된 550bp PCR product의 sequence을 분석하여, 증폭된 cytochrome c oxidase subunit 2 유전자의 어종 별 염기서열 내 차이를 보이는 제한효소 RsaⅠ도 선발하였다.

실시예 1: Genomic DNA 추출 및 RFLP - PCR

옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 4종을 어종 별로 각각 3개체씩 준비하고, 시료의 근육 부분 약 40㎎을 취해 DNeasy Tissue kit (QIAGEN)를 사용하여 Buffer ATL 270㎕, Proteinase K 30㎕와 3㎕ RNaseA가 들어있는 tube에 넣고 55℃에 over night 처리하여 단백질을 제거하고 균질화 하였다. 이후, Buffer AL 300㎕와 99% ethanol 300㎕을 첨가하고 즉시 혼합하여 원심 분리된 tube내의 용액 700㎕을 collection tube위의 spin column에 넣어 다시 13000rpm, 1분간 원심 분리하였다. Flow-through collection tube는 버리고, spin column을 새 collection tube에 옮겨 Buffer AW1 500㎕와 Buffer AW2 500㎕을 이용해 두 번의 washing 과정을 거친 후에는 원심분리를 이용하여 dry하였다. Buffer AE 50㎕ column에 넣고, 실온에서 1분가 방치한 뒤 centrifuge 13000rpm, 2분간 원심 분리하여 각 시료의 gnomic DNA를 분리하였다. 분리된 genomic DNA의 정량과 순도는 Nano-8000를 이용하여 A260/280를 측정하고 분석하였다.

RFLP-PCR mixture 조성은 어종 별 각 시료 7㎕와 10pmol primer(하기 표 1 참조), 2.5 mM dNTP, 20 mM 10X Ex Taq buffer, 5U/㎕ Ex Taq(TaKaRa)으로 구성되며, PCR 수행 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 45초 과정을 35회 반복한 후, 72℃에서 15분간 연장 반응 과정을 통하여 증폭하였다. 증폭산물을 자동전기영동장치를 통하여 정확한 크기의 산물 여부를 확인하였다.

구분	Forward Primer	Reverse Primer
Bra CO2-1 gene	TCGCCATAGTATCCA(서열번호1)	TACGGCTTCGACTACGA(서열번호2)
Bra CO2-2 gene	AAGATGCAGCTTCCCTA(서열번호3)	GTTTAGGCGGCCAGGTA(서열번호4)
Bra ND1-3 gene	GAATGTAGTAGGCCCCTA(서열번호5)	AGGAAAAGGATGGCGGAA(서열번호6)
Bra ND2-3 gene	GACAGGACAATGAGAGA(서열번호7)	GGCCTCCTAATGAGAGGA(서열번호8)

※증폭부위: cytochrome c oxidase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 1

실시예 2: PCR product purification

PCR product purification을 위해 QIAquick PCR purification kit(QIAGEN)을 사용한다. PCR product 50㎕에 pH indicator I과 Buffer PB를 1:250 비율로 혼합한 용액 250㎕을 넣어 섞은 후, 이 혼합물을 collection tube에 놓여진 spin column에 넣었다. Centrifuge 13000rpm, 1분간 원심 분리하고 collection tube의 flow-through를 버렸다. Tube에 다시 spin column을 올려놓고 Buffer PE 750㎕을 column에 넣었다. centrifuge 13000rpm, 1분간 원심 분리하여 collection tube의 flow-through을 버리고, 다시 centrifuge 13000rpm, 1분간 원심 분리하여 collection tube의 남아있는 잔여 ethanol을 완전히 제거한 후, spin column을 새로운 1.5㎖ micro-centrifuge tube에 옮기고 Buffer EB 30㎕을 column 중앙에 넣었다. 실온에서 1분간 놓아둔 후에, centrifuge 13000rpm, 1분간 원심 분리하여 정제된 DNA 회수하였다.

실시예 3: 옥돔 specific primer 선발

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머(Bra CO2-2 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머(Bra ND1-3 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 4종을 어종 별로 각각 3개씩 추출한 genomic DNA와 Bra CO2-1, Bra CO2-2, Bra ND1-3, Bra ND2-3 primer을 이용하여 PCR을 수행한 결과, Bra CO2-2 primer와 Bra ND1-3 primer에서 옥돔 개체에서만 특이적으로 각각 약 520bp와 620bp 크기의 PCR product을 생성하였다(도 1 및 도 2).

각각의 PCR product는 PCR purification을 한 후, sequencing 과정을 거쳐 NCBI Blast한 결과, Bra CO2-2와 ND1-3 primer로 증폭된 옥돔 유전자의 염기서열은 모두 옥돔(Branchiostegus japonicas) mitochondrion complete genome과 100% 일치하는 것으로 나타났다(표 2 및 표 3).

구분

Bra CO2-2 primer로 증폭된 옥돔 gene sequence

서열번호9

GGGGGTCTTCCGCGGTCATCCTTATCTTAATCGCCCTCCCCTCCCTTCGCATCCTCTACCTTATAGACGAAATTAACGACCCTCACCTAACAGTAAAAGCAATTGGCCATCAATGGTACTGAAGCTATGAATATACTGATTACCAAGACCTTGGATTTGACTCCTACATAATCCCAACACAAGACCTAACCCCTGGTCAATTCCGCCTCTTGGACACAGACCATCGAATGGTGGTCCCCGTCGAATCCCCCATCCGCGTACTAGTTACTGCTGAAGACGTATTACACTCCTGAGCAGTCCCAGCCCTCGGCGTAAAAATAGACGCCGTACCTGGCCGCCTAAACCAAACAGCCTTTATTGCCTCCCGCCCAGGAGTTTTCTACGGGCAGTGCTCTGAAATCTGCGGTGCAAATCACAGTTTTATACCAATCGTAGTCGAAGCCTACCTTTACCAAAATAGACGCCGTACCTGGGGGCCTCCCCTCCGTGGGGCGGGTGTTGAGGAGGGATTATCCGGGGACCGAAAAAGA

구분

Bra ND1-3 primer로 증폭된 옥돔 gene sequence

서열번호10

GGCATCGCCGATGGAGTAAATTATTTATTAAAGAGCCCGTAAAACCATCCACCTCTTCTCCCATCCTATTCCTCCTGGCCCCCATACTCGCGCTTACTCTTGCCCTCACCCTATGAGCCCCCATACCTCTTCCATACCCAGTCATTGACTTAAACCTAGGAATTCTTTTTGTCCTAGCCCTCTCCAGCCTGGCAGTTTACTCAATCCTAGGGTCAGGATGAGCATCCAACTCAAAATACGCCCTTATCGGAGCACTACGAGCCGTAGCCCAGACCATCTCATATGAAGTCAGCCTAGGACTAATCCTTCTAAACACCATTATCTTCACAGGAGGCTTCACACTACAAATCTTTAACGTCGCGCAAGAAAGCGTCTGATTAATTCTGCCCGCCTGACCTCTCGCCGCAATATGGTATATTTCAACACTAGCAGAAACCAACCGTGCCCCATTTGACCTCACAGAAGGAGAGTCAGAACTAGTTTCCGGCTTCAACGTAGAATATGCAGGAGGGCCATTCGCCCTCTTTTTCTTAGCTGAATACGCCAACATCTTACTCATAAATACACTTTCCGTC

실시예 4: 옥두어 specific primer 선발

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머(Bra ND2-3 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 4종을 어종 별로 각각 3개씩 추출한 genomic DNA와 Bra CO2-1, Bra CO2-2, Bra ND1-3, Bra ND2-3 primer을 이용하여 PCR을 수행한 결과, Bra ND2-3 primer에서는 옥두어에서만 특이적으로 약 550bp 크기의 PCR product을 생성하였다(도 3 참조).

생성된 PCR product는 PCR purification을 한 후, sequencing 과정을 거쳐 NCBI Blast한 결과, Bra ND2-3 유전자의 염기서열은 옥두어(Branchiostegus albus) mitochondrion complete genome과 100% 일치하는 것으로 나타났다(표 4). 결과적으로, Bra ND2- primer는 옥두어 종을 판별할 수 있는 specific primer로 분자마커로서도 유용함을 시사한다.

구분

Bra ND2-3로 증폭된 옥두어 gene sequence

서열번호11

GGAGTACTGACCCTATTCTACAATTTATACCCTCCCTCACACTCCTAGCCCTACTCACGTACTTCATTATGACATCCTCCACATTCCTTGCATTCAAGTTAACCAACTCTGCTACTATCAACGCAATCGCC
TCCTCCTCCACAAAAACACCGGCCCTCACAGCACTTATGCCCCTTGTCCTCCTCTCATTAGGAG
GCCTCCCCCCACTAACCGGATTTATACCTAAATGACTCATCCTTCACGAACTAACCAAACAAGA
CCTCGTCCCTATTGCCACCTTTGCTGCCCTTACTGCTCTCCTCAGTCTTTACTTCTATCTTCGCCT
TTCCTACGCAATAACCCTCACTATGTCCCCAAACAACTTAACAGGCGCCTCTTTCTGACGGCTG
CAGACCCCCCAACCCACACTACCCTTGGCTGTAACCACCATATCCACCATCATGTTACTGCCTCT
AACCCCAACCGCAGTTGTTTGGAAACCCCCCTCA

실시예 5: RFLP - PCR 및 옥돔, 옥두어 판별을 위한 제한효소 Rsa Ⅰ 선발

옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 4종을 어종 별로 각각 3개씩 추출한 genomic DNA와 Bra CO2-1, Bra CO2-2, Bra ND1-3, Bra ND2-3 primer을 이용하여 PCR을 수행한 결과, Bra CO2-1 primer에서는 4종의 옥돔품종에서 동일하게 약 550bp 크기의 PCR product가 생성되었다.

그런 다음, 동일하게 증폭된 Bra CO2-1 primer의 cytochrome c oxidase subunit 2 유전자의 어종 별 특이 염기서열 내 제한효소 site를 비교, 분석하였다. 분석한 자료를 바탕으로 4종의 옥돔품종을 판별을 위해 Acidiphilium facilis에서 기원된 RsaⅠ(TaKaRa-Code No. 1116A) 제한효소를 사용하였다. 제한효소 처리는 각각의 PCR product 10㎕와 10U RsaⅠ, 10X buffer로 구성되며, 37℃에서 6시간을 처리한 후, 전기영동을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 4는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머(Bra CO2-1 primer)를 이용하여 증폭시킨 옥돔, 옥두어, 등흑점옥두어, 황옥돔 증폭 산물을, 제한효소 RsaⅠ으로 처리한 사이토크롬 씨 옥시다아제 서브유니트 2(cytochrome c oxidase subunit 2) 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이고, 옥돔과 옥두어에서 다른 band의 양상을 보이는 RsaⅠ을 선발하였다(도 4). 이로써 RsaⅠ 제한효소를 이용해 옥돔과 옥두어의 품종 판별이 가능하게 되었다.

실시예 6: 염기서열 비교를 이용한 등흑점옥두어 , 황옥돔의 품종 판별

Bra CO2-1 primer에 의해 증폭된 PCR product는 PCR purification을 한 후, sequencing 과정을 거쳐 NCBI Blast을 이용하여 각각의 sequence을 조사한 결과, 옥돔 개체는 옥돔(Branchiostegus japonicas) mitochondrion complete genome과 100% 일치하였고, 옥두어 개체는 옥두어(Branchiostegus albus) mitochondrion complete genome과 100% 일치하였다. 등흑점옥두어와 황옥돔 개체는 옥돔 mitochondrion complete genome과 96% 일치하는 것으로 나타났다. 또한, Bra CO2-1 primer에 의해 증폭된 4종의 PCR product sequence을 서로 비교한 결과, 옥돔은 등흑점옥두어, 황옥돔과 96% 일치하였고, 옥두어와는 95% 일치하였다. 옥두어는 등흑점옥두어, 황옥돔과 94% 일치하였고, 등흑점과 황옥돔은 96% 일치하는 것으로 나타났다.

즉, RsaⅠ 제한효소를 이용해 옥돔과 옥두어의 품종 판별은 가능하지만, 제한효소 처리로 판별이 어려운 등흑점옥두어와 황옥돔의 품종의 판별을 위해 두 품종 간의 염기서열 분석을 실시하였다(표 5 및 표 6).

구분

Bra CO2-1 primer로 증폭된 등흑점옥두어 유전자 염기서열

서열번호12

AGATCCTTCACGACCACGCCCTAATAATTGTGCTTTTAATTAGCACATTAGTTCTTTACATTATTATCGCCATAGTATCCACTAAGCTAGTCAACCTATACATTCTAGACTCCCAAGAAATCGAAGTAATTTGAACCGTTCTCCCCGCAGTTATCCTTATCTTAATCGCTCTCCCCTCCCTTCGCATCCTCTATCTTATAGACGAAATTAACGACCCTCACCTAACAGTAAAAGCAATTGGCCATCAATGATACTGAAGCTATGAGTATACTGATTACCAAGATCTTGGATTTGACTCCTACATAATCCCAACACAGGACCTAACCCCTGGCCAATTCCGCCTCTTGGACACAGACCATCGAATAGTGGTCCCAGTCGAATCCCCCGTTCGCGTACTAGTCACTGCTGAAGACGTATTACACTCCTGAGCAGTCCCAGCCCTCGGCGTAAAAATAGACGCCGTACTCCCCCCCCCAAAACAAAAGGGTTTATGTCCATGTGTGTGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCAGCAGGGTGCCATGTACTCCCAGTGGCCATCTGTACGTGGTGTTCTCTCCCTCGGGTGTGTACGGGTAACACGCAACCCAACATGATTACCTGGCCCCCATAAAA

구분

Bra CO2-1 primer로 증폭된 황옥돔 유전자 염기서열

서열번호13

AACAATCATTCACGACCACGCCCTAATAATTGTGCTTTTAATTAGCACATTAGTTCTTTACATTATTATCGCCGTAGTATCCACTAAGCTAGTCAACCTATACATTCTAGACTCCCAAGAAATCGAAGTAATTTGAACCGTTCTCCCCGCAGTTATCCTTATCTTAATCGCTCTCCCCTCCCTTCGCATCCTCTATCTTATAGACGAAATTAACGACCCTCACCTAACAGTAAAAGCAATTGGCCATCAATGATACTGAAGCTATGAGTATACTGATTACCAAGATCTTGGATTTGACTCCTACATAATCCCAACACAGGACCTAACCCCTGGCCAATTCCGCCTCTTGGACACAGACCATCGAATAGTGGTCCCAGTCGAATCCCCCGTTCGCGTACTAGTCACTGCTGAAGACGTATTACACTCCTGAGCAGTCCCAGCCCTCGGCGTAAAAATAGACGCCGTACTCCAGCAATCGCAGACCTAATGGTTTAGGTCCCATGTGTGTGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCAGCAGGGTGCCGTGTACTCCCAGTGGCCATGTGTACGTGGTGCTCTCTCCCTGGGGTGTGTACGGGTAGCACGCAACCCAACGTGATTACGTGGCCGCCATACACA

그리고, 상기 표 5 및 표 6에 따른 염기서열을 분석한 결과, 등흑점옥두어와 황옥돔 품종 간에 470~512bp 위치를 비롯한 다수의 위치에서 염기서열 차이를 나타내었다(도 5).

도 5는 도 4의 등혹점옥두어(Braarge) 증폭 산물에 대한 사이토크롬 씨 옥시다아제 서브유니트 2 산물의 염기서열(서열번호 12)과, 황옥돔(Braaura) 증폭 산물에 대한 사이토크롬 씨 옥시다아제 서브유니트 2 산물의 염기서열(서열번호 13) 및 이에 따른 컨센서스(consensus)를 나타내는 염기서열도이다.

이에 따르면, 서열번호 12 및 서열번호 13의 특정 위치에서의 SNP를 이용하면, 등흑점옥두어와 황옥돔의 품종 구별이 가능하다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency <120> Primer for identifying kind of Branchiostegus, Method for identifying kind of Branchiostegus using the same, and Polynucleotide for identifying kind of Branchiostegus <130> P12-001 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Branchiostegus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(15) <223> Forward Primer <400> 1 tcgccatagt atcca 15 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Branchiostegus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(17) <223> Reverse Primer <400> 2 tacggcttcg actacga 17 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Branchiostegus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(17) <223> Forward Primer <400> 3 aagatgcagc ttcccta 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Branchiostegus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(17) <223> Reverse Primer <400> 4 gtttaggcgg ccaggta 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Branchiostegus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <223> Forward Primer <400> 5 gaatgtagta ggccccta 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Branchiostegus <400> 6 aggaaaagga tggcggaa 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Branchiostegus <400> 7 gacaggacaa tgagaga 17 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Branchiostegus <400> 8 ggcctcctaa tgagagga 18 <210> 9 <211> 530 <212> DNA <213> Branchiostegus japonicus <220> <221> gene <222> (1)..(530) <223> gene sequence is amplified by Bra CO2-2 primer <400> 9 gggggtcttc cgcggtcatc cttatcttaa tcgccctccc ctcccttcgc atcctctacc 60 ttatagacga aattaacgac cctcacctaa cagtaaaagc aattggccat caatggtact 120 gaagctatga atatactgat taccaagacc ttggatttga ctcctacata atcccaacac 180 aagacctaac ccctggtcaa ttccgcctct tggacacaga ccatcgaatg gtggtccccg 240 tcgaatcccc catccgcgta ctagttactg ctgaagacgt attacactcc tgagcagtcc 300 cagccctcgg cgtaaaaata gacgccgtac ctggccgcct aaaccaaaca gcctttattg 360 cctcccgccc aggagttttc tacgggcagt gctctgaaat ctgcggtgca aatcacagtt 420 ttataccaat cgtagtcgaa gcctaccttt accaaaatag acgccgtacc tgggggcctc 480 ccctccgtgg ggcgggtgtt gaggagggat tatccgggga ccgaaaaaga 530 <210> 10 <211> 575 <212> DNA <213> Branchiostegus japonicus <220> <221> gene <222> (1)..(575) <223> gene sequence is amplified by Bra ND1-3 primer <400> 10 ggcatcgccg atggagtaaa ttatttatta aagagcccgt aaaaccatcc acctcttctc 60 ccatcctatt cctcctggcc cccatactcg cgcttactct tgccctcacc ctatgagccc 120 ccatacctct tccataccca gtcattgact taaacctagg aattcttttt gtcctagccc 180 tctccagcct ggcagtttac tcaatcctag ggtcaggatg agcatccaac tcaaaatacg 240 cccttatcgg agcactacga gccgtagccc agaccatctc atatgaagtc agcctaggac 300 taatccttct aaacaccatt atcttcacag gaggcttcac actacaaatc tttaacgtcg 360 cgcaagaaag cgtctgatta attctgcccg cctgacctct cgccgcaata tggtatattt 420 caacactagc agaaaccaac cgtgccccat ttgacctcac agaaggagag tcagaactag 480 tttccggctt caacgtagaa tatgcaggag ggccattcgc cctctttttc ttagctgaat 540 acgccaacat cttactcata aatacacttt ccgtc 575 <210> 11 <211> 488 <212> DNA <213> Branchiostegus albus <220> <221> gene <222> (1)..(488) <223> gene sequence is amplified by Bra ND2-3 primer <400> 11 ggagtactga ccctattcta caatttatac cctccctcac actcctagcc ctactcacgt 60 acttcattat gacatcctcc acattccttg cattcaagtt aaccaactct gctactatca 120 acgcaatcgc ctcctcctcc acaaaaacac cggccctcac agcacttatg ccccttgtcc 180 tcctctcatt aggaggcctc cccccactaa ccggatttat acctaaatga ctcatccttc 240 acgaactaac caaacaagac ctcgtcccta ttgccacctt tgctgccctt actgctctcc 300 tcagtcttta cttctatctt cgcctttcct acgcaataac cctcactatg tccccaaaca 360 acttaacagg cgcctctttc tgacggctgc agacccccca acccacacta cccttggctg 420 taaccaccat atccaccatc atgttactgc ctctaacccc aaccgcagtt gtttggaaac 480 ccccctca 488 <210> 12 <211> 643 <212> DNA <213> Branchiostegus argentatus <220> <221> gene <222> (1)..(643) <223> gene sequence of branchiostegus argentatus is amplified by CO2-1 primer <400> 12 agatccttca cgaccacgcc ctaataattg tgcttttaat tagcacatta gttctttaca 60 ttattatcgc catagtatcc actaagctag tcaacctata cattctagac tcccaagaaa 120 tcgaagtaat ttgaaccgtt ctccccgcag ttatccttat cttaatcgct ctcccctccc 180 ttcgcatcct ctatcttata gacgaaatta acgaccctca cctaacagta aaagcaattg 240 gccatcaatg atactgaagc tatgagtata ctgattacca agatcttgga tttgactcct 300 acataatccc aacacaggac ctaacccctg gccaattccg cctcttggac acagaccatc 360 gaatagtggt cccagtcgaa tcccccgttc gcgtactagt cactgctgaa gacgtattac 420 actcctgagc agtcccagcc ctcggcgtaa aaatagacgc cgtactcccc cccccaaaac 480 aaaagggttt atgtccatgt gtgtgggtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgcag 540 cagggtgcca tgtactccca gtggccatct gtacgtggtg ttctctccct cgggtgtgta 600 cgggtaacac gcaacccaac atgattacct ggcccccata aaa 643 <210> 13 <211> 650 <212> DNA <213> Branchiostegus auratus <220> <221> gene <222> (1)..(650) <223> gene sequence of branchiostegus auratus is amplified by CO2-1 primer <400> 13 aacaatcatt cacgaccacg ccctaataat tgtgctttta attagcacat tagttcttta 60 cattattatc gccgtagtat ccactaagct agtcaaccta tacattctag actcccaaga 120 aatcgaagta atttgaaccg ttctccccgc agttatcctt atcttaatcg ctctcccctc 180 ccttcgcatc ctctatctta tagacgaaat taacgaccct cacctaacag taaaagcaat 240 tggccatcaa tgatactgaa gctatgagta tactgattac caagatcttg gatttgactc 300 ctacataatc ccaacacagg acctaacccc tggccaattc cgcctcttgg acacagacca 360 tcgaatagtg gtcccagtcg aatcccccgt tcgcgtacta gtcactgctg aagacgtatt 420 acactcctga gcagtcccag ccctcggcgt aaaaatagac gccgtactcc agcaatcgca 480 gacctaatgg tttaggtccc atgtgtgtgg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 540 gtgcagcagg gtgccgtgta ctcccagtgg ccatgtgtac gtggtgctct ctccctgggg 600 tgtgtacggg tagcacgcaa cccaacgtga ttacgtggcc gccatacaca 650

Claims

서열번호 3의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 4의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 옥돔과 품종 판별용 프라이머 세트.
서열번호 5의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 6의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 옥돔과 품종 판별용 프라이머 세트.
서열번호 7의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 8의 염기서열이나 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 옥돔과 품종 판별용 프라이머 세트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1폴리뉴클레오티드는 정방향 프라이머이고,
상기 제2폴리뉴클레오티드는 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는 옥돔과 품종 판별용 프라이머 세트.
옥돔과에 속하는 종에서 핵산분자를 분리하는 단계;
상기 분리한 핵산분자를 상기 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트로 증폭시킨 증폭 산물을 얻는 단계; 및
상기 얻은 증폭 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 옥돔과 품종 판별 방법.
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