KR101122109B1 - 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 프라이머 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 실시예들은 유전자 atpB, ycf1에 특이적인 프라이머 세트 및 제한효소에 관한 것으로, 오이 내냉성 연관 유전자형을 분석할 수 있는 조성물과 분석 방법을 제공해준다. 보다 구체적으로 본 발명의 실시예들은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 atpB에 특이적인 프라이머 세트와 제한효소 Sau96I로 이루어진 조성물, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트와 제한효소 Rsa1로 이루어진 조성물 및 이를 이용한 오이 내냉성 연관 유전자형 분석방법에 곤한 것이다.

Description

오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 프라이머 {Primers for detecting genotypes related to chilling tolerance in cucumber plants}
본 발명의 실시예들은 유전자 atpB, ycf1에 특이적인 프라이머 세트 및 제한효소에 관한 것으로, 오이 내냉성 연관 유전자형을 분석할 수 있는 조성물과 분석 방법을 제공해준다.
오이는 인도 서북부의 히말라야 산맥 남부가 원산지이며, 약 3,000년 전부터 재배되어 오고 있는 작물로서, 이집트에서는 기원전 1,750년경에 재배되었고, 남유럽에는 기원 전후에 전파되었으며, 유럽에서는 16세기경에 재배되었으나 중국에서는 6세기경부터 널리 재배된 것으로 보고된다. 우리나라에서는 약 1,500년 전에 도입된 것으로 알려지고 있는데, 오이는 많은 종류의 품종이 있지만 주로 화남형, 화북형, 피클형 오이가 재배된다.
오이의 주요성분은 약 95%가 수분이며, 단백질, 지질, 당질의 함량이 낮아 칼로리는 매우 낮고, 그 밖에 칼륨, 비타민 A와 비타민 C를 함유하고 있다. 특히 오이가 함유하는 비타민 C는 산화효소에 의해 쉽게 파괴될 수 있다.
또한, 오이에 함유된 칼륨은 과잉의 염분을 체외로 배출시키는 작용을 하며, 이뇨작용을 촉진시켜 신장병 환자나 고혈압 환자에게 좋다. 또한, 오이는 목이 마르고 아플 때, 특히 더위를 먹었을 때 섭취하면 좋다고 보고된다.
뿐만 아니라 최근 일본에서는 오이가 사람의 신체 내에서 각종 해독작용을 하는 것으로 보고됨에 따라 앞다투어 오이를 이용한 기능성 식품개발에 박차를 가하고 있다. 국내에서도 이러한 움직임이 보이고 있다.
그러나 오이는 내냉성이 약해 10~12℃이하에서는 생육이 크게 억제된다. 특히 0~12℃정도에서 재배되면 병해에도 약하기 때문에 세균성, 곰팡이성 전염에 의해 피해를 입을 수 있다. 오이의 유전자는 핵 유전자와 엽록체, 그리고 미토콘드리아 유전자가 있다. 오이 식물의 핵 유전자는 모계와 부계에 의하여 유전이 되고, 미토콘드리아 DNA는 부계유전, 엽록체 DNA는 모계 유전되는 것으로 알려져 있다 (Corriveau and Coleman, 1988; Havey, 1997).
한편, SNPs 는 단일염기 다형성 (Single Nucleotide Polymorphism)으로, 유전체를 구성하고 있는 염기가 개체마다 부분적으로 서로 다르게 나타나는 현상을 의미한다. 인간 SNPs는 약 30억 염기쌍으로 구성된 인간 유전체의 0.1% 즉, 1000 염기당 1개 가량인 약 300만개가 존재하는 것으로 추정하고 있다. SNPs는 가장 흔한 형태의 DNA 염기서열 변이로서, 특히 인간의 경우 코딩 (coding) 되는 부위 (유전자로부터 단백질을 만드는 부위)의 염기서열에 발생하는 변이는 여러 질환과 밀접한 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다.
일반적으로 SNPs를 발견하기 위해서는 염기서열 분석이 수행된다. 하지만 발견된 SNPs를 분자마커로 이용하기 위해서 다시 염기서열 분석하여 확인한다면 이는 많은 비용과 시간을 요구하게 된다. 따라서 염기서열 분석을 하지 않고 SNPs를 분석하는 여러 가지 방법이 제안되었다.
오이의 경우에도 품종간의 염기서열의 차이를 비교하기 위해서는 염기서열 분석을 실시하면 되지만 이것은 시간이 오래 걸릴 뿐 아니라 적지 않은 비용이 든다는 단점이 있다.
따라서 PCR로 검사할 수 있는 오이 내냉성 연관 마커를 개발함으로써 보다 손쉬운 방법으로 내냉성 연관 유전자형을 구분할 필요가 있다.
본 발명의 실시예들은 오이의 내냉성 연관 유전자형을 분석하기 위해 atpB에 특이적인 프라이머 세트 및 ycf1에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 오이의 내냉성 연관 유전자형을 분석하기 위해 상기의 프라이머 세트와 특이적인 제한효소를 제공한다.
또한 본 발명의 실시예들은 오이 내냉성 연관 유전자형을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예들은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 atpB에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
또한 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서 "특이적"이라는 용어는 다른 유전자에 결합하지 않고 상기 유전자의 특정부위에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
본 발명의 프라이머 (primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 atpB에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 마커를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 냉해 감수성으로 알려진 오이품종 GY14와 냉해 저항성으로 알려진 Chipper 품종의 염기서열을 이용하여 오이 식물에서 사용 가능한 내냉성 연관 마커를 개발하였다. 오이의 엽록체 특정 부위를 PCR 증폭한 후 내냉성 유전자형만 제한효소로 잘릴 수 있도록 PCR 프라이머를 제작하였다 (실시예 1).
보다 구체적으로는, 국내에서 시판하는 오이 품종과 국외에서 시판하는 오이품종으로 총 17종의 오이 (표 1)을 사용하였으며, 이 17종의 오이의 잎을 따서 DNA 를 추출하였다. 냉해 감수성으로 알려진 오이품종 GY 14와 냉해 저항성으로 알려진 Chipper 품종의 atpB 유전자와 ycf1 유전자의 염기서열을 비교함에 따라 나타나는 SNP를 찾고, 순방향 (forward) 프라이머 끝에 제한효소가 인식될 수 있는 특정 염기서열로 제작하였다. 내냉성 연관 유전자형 DNA 만 PCR 후 제한효소에 잘릴 수 있도록 제작하였다.
본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트와 제한효소는 하기 표와 같다.
[atpB SNP 분석용 프라이머 세트 및 제한효소]
서열번호 1- atpB-SNP-정방향 (forward) 프라이머: ACCACTTCCATTCCGGTC
서열번호 2- atpB-SNP-역방향 (reverse) 프라이머: TGGGACGTATCGCTCAAATA
제한효소: Sau96I
[ycf1-SNP 분석용 프라이머 세트 및 제한효소]
서열번호 3- ycf1-SNP-정방향 (forward) 프라이머: GACGGAGGTAGCAGGTA
서열번호 4- ycf1-SNP-역방향 (reverse) 프라이머: GATCGAAGGGAAGCTTGGT
제한효소: RsaI
즉, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 atpB에 특이적인 프라이머 세트와 제한효소 Sau96I로 이루어진 것을 특징으로 하는 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 조성물을 제공한다.
상기 오이 내냉성 연관 유전자형은 서열번호 5로 표시되는 atpB 유전자에서 41번째 염기형을 뜻한다.
상기의 조성물을 이용하여 오이 내냉성 연관 유전자형을 분석한 결과, 서열번호 5로 표시되는 atpB 유전자에서 41번째 염기가 G이면 냉해 감수성이고, C 이면 냉해 저항성 품종의 오이로 판별한다. 또한 상기의 프라이머 세트와 제한효소로 조합된 조성물을 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동을 통해 DNA 밴드를 확인함으로써 오이의 유전자형을 판별할 수 있다.
또한 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트와 제한효소 Rsa1로 이루어진 것을 특징으로 하는 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 조성물을 제공한다.
상기 오이 내냉성 연관 유전자형은 서열번호 6으로 표시되는 ycf1유전자에서 19번째 염기형을 뜻한다.
상기의 조성물을 이용하여 오이 내냉성 연관 유전자형을 분석한 결과, 서열번호 6으로 표시되는 ycf1 유전자에서 19번째 염기가 T이면 냉해 감수성이고, C 이면 냉해 저항성 품종의 오이로 판별한다. 또한 상기의 프라이머 세트와 제한효소로 조합된 조성물을 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동을 통해 DNA 밴드를 확인함으로써 오이의 유전자형을 판별할 수 있다.
서열번호 5와 서열번호 6은 도 1에 표현된 GY14의 염기서열이다.
또한 본 발명은 오이 내냉성 연관 유전자형 분석방법을 제공한다.
보다 자세한 분석방법은 하기와 같다.
(1) 분석할 오이로부터 DNA 를 추출하는 단계;
(2) 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 atpB에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 타켓 유전자 부위를 증폭하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 PCR산물에 제한효소를 처리하는 단계; 및
(4) (3)에서 얻은 산물의 크기를 분석하는 단계;
를 포함하여 이루어진다.
상기 (1) 단계의 DNA 추출단계는, 국내에서 시판하는 오이품종과 국외에서 시판하는 오이품종으로 총 17종의 오이의 잎을 따서 DNA 를 분리하여 준비할 수 있다. DNA 분리방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 CTAB 방법을 이용하여 DNA 가 추출되었다.
본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 상기의 "PCR" 은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이 적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
상기 (2) 단계의 PCR 수행은 프라이머 세트를 0.5 내지 1.5㎍/㎕ 를 넣고, 최초 변성을 94 내지 96℃, 3분 정도 실시한 후, 변성은 94 내지 96℃에서 30초 정도, 어닐링 (annealing) 49 내지 51℃에서 1분 정도, 신장 67 내지 69℃에서 3분 정도로 하고, 마지막 신장을 71 내지 73℃에서 7분 정도 수행하는 것을 특징으로 한다.
상기 (3) 단계의 제한효소는 (2) 단계의 프라이머 세트가 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 atpB에 특이적인 프라이머 세트인 경우에는 제한효소 Sau96I를 사용하고, 프라이머 세트가 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트인 경우에는 제한효소 Rsa1를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 오이 내냉성 연관 유전자형 분석방법에 있어서, 상기 PCR 산물의 크기 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있으며, 2 이상의 개체간의 PCR 증폭 산물의 크기를 비교할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 제한효소를 처리한 후 2% 아가로스겔을 이용한 전기영동을 통해 크기 차이를 보이는 DNA 밴드를 확인하였다 (실시예 5).
atpB-SNP 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA를 전기영동 실시한 결과, 17종의 오이 중에서 Little John, NC76, Chipper의 SNP 부분의 염기가 동일하고 나머지 14종과 다르다는 결과를 얻을 수 있었다. ycf1-SNP 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA를 이용하여 전기영동 실시한 결과도 17종의 오이 중에서 Little John, NC76, Chipper의 SNP 부분의 염기가 동일하다는 결과를 얻었다 (도 2).
본 발명을 통하여 오이의 PCR로 검증이 가능한 내냉성 연관 마커를 얻었으며 이 마커를 이용하여 오이 품종 NC76가 기존에 내냉성으로 알려진 Little John이나 Chipper와 동일한 SNP부분의 염기를 갖고 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 의하면, 오이 작물의 내냉성 연관 유전자형을 분석할 수 있는 프라이머 세트 마커와 제한효소를 함께 제공해줌으로써, 염기서열 분석을 실시하지 않아도 손쉬운 방법으로 내냉성 연관 유전자형을 구분할 수 있어, 냉해 저항성을 가진 품종을 쉽게 구분하여 보다 싱싱한 오이를 계속 생산해 낼 수 있는바, 오이 작물 사업에 큰 기여를 할 것이다.
도 1은 오이 품종 GY14와 Chipper (CP) 의 AtpB-SNP, Ycf-1SNP 의 염기서열을 비교해 논 것이다. 회색으로 표시된 부분이 본 발명에서 제작된 프라이머 염기서열 위치이다.
도 2는 atpB에 특이적인 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 atpB에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 17종의 오이품종에서 추출된 DNA의 PCR 산물에 대한 제한효소 처리 후 아가로스 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다. 표시된 숫자는 표 1에 나타난 각 품종의 번호와 일치한다. 즉, 1: GY14, 2: Chipper, 3: Heung-nong baegdadagi, 4: Saeron banbaeg, 5: Asiachungjang, 6: Saeronchungjang, 7: Eunsung baegdadagi, 8: Glorysamchug, 9: Baegrogdadagi, 10: NC76, 11: Little John, 12: Suiseifushinari 2-go, 13: Joeunbaegdadagi, 14: Hangangmatbaegdadagi, 15: Sinjungpum, 16: White, 17: Dong-gwan. S: DNA size marker (1Kb ladder).
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> DNA 의 추출
국내에서 시판하는 오이품종과 국외에서 시판하는 오이품종으로 총 17종의 오이를 사용하여 실험하였다 (표 1). 이 17종의 오이의 잎을 따서 CTAB 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다.
분쇄기로 15분 분쇄시켜준 후 수조에서 65℃로 10분 예열하였다. 5M 암모늄아세테이트 250㎕를 넣어준 후 원심분리를 10분간 실시하였다. 상층액만 따서 차가운 에탄올을 900㎕ 넣어준 후 -70℃에 10분간 두었다. 원심분리 10분 후에 알코올로 건조 시킨 뒤 증류수를 넣어주었다. 이렇게 추출한 DNA를 분광 측정기를 이용하여 농도를 측정하고 최종농도를 5ng/㎕로 희석시켰다.
오이 품종
No. 이름 근원 (source) 원산지
1 GY14 USDA USA
2 Chipper USDA USA
3 Heungnongbaegdadagi Heungnong seed Korea
4 Saeronbanbaeg Danong, Inc. Korea
5 Asiachungjang Asia seeds Korea
6 Saeronchungjang Danong, Inc. Korea
7 Eunsungbaegdadagi Heungnong seed Korea
8 Glorysamchug Asia seeds Korea
9 Baegrogdadagi Sinjenta seeds, Inc. Korea
10 NC76 USDA USA
11 Little John USDA USA
12 Suiseifushinari 2-go Kurume Vegetable Breeding Japan
13 Joeunbaegdadagi Heungnong seed Korea
14 Hangangmatbaegdadagi Sinjenta seeds, Inc. Korea
15 Sinjungpum Dongbu hightech Korea
16 White Dongbu hightech Korea
17 Donggwan Tianjin Germany Switzerland, Inc China
< 실시예 2> 프라이머 제작
냉해 감수성으로 알려진 오이품종 GY14와 냉해 저항성으로 알려진 Chipper 품종의 염기서열을 이용하여 (도 1) 오이 식물에서 사용 가능한 내냉성 연관 마커를 개발하였다. 방법은 오이의 엽록체 특정 부위를 PCR 증폭한 후 내냉성 유전자형만 제한효소로 잘릴 수 있도록 PCR 프라이머를 제작하였다.
냉해 저항성과 감수성 표현형에 연관되었다고 알려진 오이 엽록체 유전자 atpB와 ycf1 유전자의 염기서열을 비교함에 따라 나타나는 SNP를 atpB-SNP 와 ycf1-SNP로 명명하고 포워드 프라이머 끝에 제한효소가 인식될 수 있는 특정 염기서열로 제작함으로써 내냉성 연관 유전자형 DNA 만 PCR 후 제한효소에 잘릴 수 있도록 제작하였다.
본 발명의 오이 작물 내냉성 연관 유전자형 분석을 위해 개발된 프라이머 세트와 제한효소의 조합은 하기와 같았다.
[atpB SNP 분석용 프라이머 세트 및 제한효소]
서열번호 1- atpB-SNP-정방향 (forward) 프라이머: ACCACTTCCATTCCGGTC
서열번호 2- atpB-SNP-역방향 (reverse) 프라이머: TGGGACGTATCGCTCAAATA
제한효소: Sau96I
*[ycf1-SNP 분석용 프라이머 세트 및 제한효소]
서열번호 3- ycf1-SNP-정방향 (forward) 프라이머: GACGGAGGTAGCAGGTA
서열번호 4- ycf1-SNP-역방향 (reverse) 프라이머: GATCGAAGGGAAGCTTGGT
제한효소: RsaI
< 실시예 3> PCR 증폭
상기의 방법으로 프라이머를 제작한 후 이 프라이머를 이용하여 PCR증폭을 시켰다. 프라이머는 1:20의 비율로 증류수로 희석하여 사용하였다. PCR은 총량 15㎕ (증류수 6.02㎕, dNTP 0.4㎕, Etaq 중합효소 0.08㎕, 10x etaq 완충용액 1.5㎕, 포워드 프라이머 1㎍/㎕, 리버스 프라이머 1nM/㎕, DNA 5㎕)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 수행은 프라이머 세트를 1㎍/㎕ 를 넣고, 최초 변성을 95℃, 3분간 실시한 후, 변성은 95℃에서 30초, 어닐링 50℃에서 1분, 신장 68℃에서 3분으로 하고, 마지막 신장을 72℃에서 7분간 수행하였으며, 50번 반복 수행하였다.
< 실시예 4> 제한효소 처리
PCR로 증폭된 DNA를 제한효소를 이용하여 자르는 작업을 수행하였다. atpB-SNP 프라이머와 ycf1-SNP 프라이머로 동일한 품종을 각각 PCR로 증폭시킨 후에 제한효소 제조사의 프로토콜에 따라 제한효소 처리를 실시하였다.
atpB-SNP 프라이머를 사용한 경우에는 Sau96I (New England Biolabs. Inc, Hertfurdshire, Massachusetts, USA) 이용하였고, ycf1-SNP 프라이머를 사용한 경우에는 Rsa1 (New England Biolabs. Inc, Hertfurdshire, Massachusetts, USA)를 이용하여 각각 제한효소 처리를 실시하였다.
< 실시예 5> 전기영동 분석
제한효소를 처리한 후 2% 아가로스겔을 이용한 전기영동을 통해 크기 차이를 보이는 DNA 밴드를 확인하였다.
도 2 에서 보면 atpB-SNP 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA를 전기영동 실시한 결과, 17종의 오이 중에서 Little John, NC76, Chipper의 SNP 부분의 염기가 동일하고 나머지 14종과 다르다는 결과를 얻을 수 있었다. ycf1-SNP 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA를 이용하여 전기영동 실시한 결과도 17종의 오이 중에서 Little John, NC76, Chipper의 SNP 부분의 염기가 동일하다는 결과를 얻었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 ycf1에 특이적인 프라이머 세트.
  2. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 마커 조성물.
  3. 제 1항의 프라이머 세트와 제한효소 Rsa1로 이루어진 것을 특징으로 하는 오이 내냉성 연관 유전자형 분석용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 오이 내냉성 연관 유전자형은 서열번호 6으로 표시되는 ycf1 유전자에서 19번째 염기형인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. (1) 분석할 오이로부터 DNA 를 추출하는 단계;
    (2) 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 타켓 유전자 부위를 증폭하는 단계;
    (3) 상기 (2) 단계의 PCR산물에 제한효소를 처리하는 단계; 및
    (4) (3)에서 얻은 산물의 크기를 분석하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 오이 내냉성 연관 유전자형 분석방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 (2) 단계의 PCR 수행은 프라이머 세트를 0.5 내지 1.5㎍/㎕ 를 넣고, 최초 변성을 94 내지 96℃, 3분간 실시한 후, 변성은 94 내지 96℃에서 30초, 어닐링 49 내지 51℃에서 1분, 신장 67 내지 69℃에서 3분으로 하고, 마지막 신장을 71 내지 73℃에서 7분간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 (3) 단계의 제한효소는 Rsa1를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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