KR101382409B1 - 포도의 품종 판별용 스카 마커 및 이의 용도 - Google Patents

포도의 품종 판별용 스카 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포도의 품종 판별용 SCAR 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 분자 마커를 이용하는 경우, 포도의 품종을 명확하게 구별할 수 있으므로 품종 육성권자에 대한 보호를 강화할 수 있고, 포도 육묘 및 재배시 제기되는 품종 혼입 문제를 해결하는데 기여할 수 있으며, 포도 품종의 분자 유전학적 연구 및 주요 형태적 특성 분석에도 이용될 수 있다.

Description

포도의 품종 판별용 스카 마커 및 이의 용도{SCAR MARKERS FOR DISCRIMINATION OF GRAPE CULTIVARS AND USE THEREOF}
본 발명은 포도의 품종 판별용 SCAR 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재 품종 구별은 전통적인 멘델의 법칙을 적용한 표현형 위주의 형태학적 형질 및 효소나 단백질 변이와 같은 생화학적 특성에 의해 이루어지고 있다. 그러나, 이와 같은 방식은 변이의 빈도가 낮고 전 작물에 대한 적용에 한계가 있으며, 생산자의 재배 조건에 따라 다른 결과를 초래할 수 있어서 정확한 품종 판별이 곤란하기 때문에 분자 수준에서의 품종 구별 방법이 활발하게 연구되고 있다. 예를 들면, 네덜란드에서는 장미 및 토마토에 대해 각 품종별 DNA 프로파일을 데이터베이스화하였고, 일본은 벼 등의 작물에 대한 품종 식별용 분자 마커를 개발하여 품종 보호에 활용하고 있다.
분자 마커들은 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite)나 유전자 염기서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 스카 (SCAR; Sequence Characterised Amplified Region) 마커 (이하 SCAR 마커라고 함)가 이용되고 있다. SCAR 마커는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)나 AFLP(Amplification Fragment Length Polymorphism) 마커 밴드의 염기서열을 분석하여 제작한 것으로 ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 의해 증폭 환경에 비교적 둔감하고 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종구별용 분자 마커로 인식되고 있다.
KR2011-0074204 10 KR2010-0053214 10
일반적으로 과수 국내육성 품종들은 국내 내수용과 해외 수출용 모두 묘목상태로 공급되고 있어 형태적으로 품종 판별이 불가능하다. 또한 새로운 육성 품종들은 유전적으로 기존 품종들과 매우 밀접하게 연관되어 있어, 형태적 형질만으로 품종 구별이 쉽지 않다.
이에, 본 발명자들은 포도의 품종 구별을 위해 효율적으로 이용될 수 있는 분자 마커를 개발 연구를 수행하여, 정확하고 재현성 있게 이용할 수 있는 SCAR 마커를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 포도의 품종 판별용 SCAR 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 포도 품종 판별용 SCAR 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 포도 품종 판별용 SCAR 프라이머 세트를 포함하는 포도 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 포도의 품종 판별용 SCAR 프라이머 세트를 이용한 포도 품종 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 분자 마커를 이용하는 경우, 포도의 품종을 명확하게 구별할 수 있으므로 품종 육성권자에 대한 보호를 강화할 수 있고, 포도 육묘 및 재배시 제기되는 품종 혼입 문제를 해결하는데 기여할 수 있으며, 포도 품종의 분자 유전학적 연구 및 주요 형태적 특성 분석에도 이용될 수 있다.
도 1은 포도 국내육성 품종인 '청수', '홍단', '탐나라', '홍이슬', '탐금추', '홍아람', '나르샤'에서 나타나는 348bp의 SCAR 마커와, 기존품종인 ‘알덴(Alden), 캠벨얼리(Campbell Early), 힘로드시드레스(Himrod Seedless) 및 타노레드(Tano Red) SCAR 마커를 나타내는 도이다.
도 2는 포도 품종판별용 SCAR 마커 개발 과정을 나타내는 절차도이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포도의 품종 판별용 SCAR (Sequence Chracterized Amplified Region) 마커를 제공한다.
바람직하게는, 상기 포도의 품종 판별용 SCAR 마커는 포도의 국내육성 품종 12 종 및 기존 품종 14 종을 대상으로 한 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석으로부터 얻을 수 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 포도의 품종 판별용 SCAR 마커는 G509-243 (서열번호 35), GG05_281 (서열번호 36), GU19_283 (서열번호 37), G116_319 (서열번호 38), G507_334 (서열번호 39), G427_348 (서열번호 40), GU13_380 (서열번호 41), G427_382 (서열번호 42), G119_411 (서열번호 43), GV01_424 (서열번호 44), GW04_463 (서열번호 45), G169_515 (서열번호 46), G116_539 (서열번호 47), GV04_618 (서열번호 48), GV01_678 (서열번호 49), GG05_689 (서열번호 50) 및 GA07_775 (서열번호 51)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 포도의 품종 판별용 SCAR 마커를 이용하면 하기 [표 1] 및 [표 2]에 정리된 바와 같이, 국내 포도 품종 12개 및 기존 품종 14개를 판별할 수 있다.
Figure 112011105372082-pat00001
Figure 112011105372082-pat00002
특히, 이 중, G507_334 (서열번호 39), G427_348 (서열번호 40), G427_382 (서열번호 42), G119_411 (서열번호 43), G169_515 (서열번호 46), GV01_678 (서열번호 49), GG05_689 (서열번호 50)을 이용하면, 하기 [표 3]에 기재된 바와 같이, 12 종의 포도 국내육성 품종 (청수, 홍단, 탐나라, 홍이슬, 흑구슬, 흑보석, 수옥, 두누리, 탐금추, 홍이람, 나르샤, 홍소담)의 판별이 가능하다.
Figure 112011105372082-pat00003
본 발명에서 빈번히 사용된 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌 (genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는, 또한, 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트으로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다.
상기 포도 품종은 청수, 홍단, 탐나라, 홍이슬, 흑구슬, 흑보석, 수옥, 두누리, 탐금추, 홍아람, 나르샤, 홍소담, 알덴 (Alden), 캠벨얼리(Campbell Early), 델라웨어(Delaware), 더체스(Ductchess), 골든머스캇(Golden Muscat), 힘로드 시드레스 (Himrod Seedless), 쉴러(Schuyler), 홍이두(Beniizu), 거봉 (Kyoho), 피오네(Pione), 슈퍼함부르그(Super Hamburg), 타노레드(Tano Red), 머스캇함부르그 (Muscat Hamburg) 및 시벨 9110 (Seibel 9110)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 포도 품종 판별용 SCAR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 SCAR 프라이머 세트는, 하기 [표 4]에 정리되어 있는 바와 같이, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 포도의 품종을 판별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트일 수 있다.
SCAR마커 서열번호 프라이머 염기서열(5'→3') Tm(℃) 증폭산물의 크기(bp)
G509_243 1
2		 F: ACAGAGACTGCCAACATATGAGTT
R: ACAGAGACTGGTACTACAAGTGAA		 60 243
GG05_281 3
4		 F: CTGAGACGGACGAAATGAGATTAT
R: CTGAGACGGAGTTATCCCGAATCA		 63 281
GU19_283 5
6		 F: GTCAGTGCGGATTTATTGCCCCTT
R: GTCAGTGCGGCAATATGTTGGTTT		 63 283
G116_319 7
8		 F: CGGCCATACATGTACAGAAATAAG
R: ATGACGCACAGTGAGGTAGATATT		 63 319
G507_334 9
10		 F: AGACGTACTCTCTCATGCATCTTT
R: AGACGTACTCAACAAATTTAACAT		 63 334
G427_348 11
12		 F: GTAATCGACGTCACACATAAC
R: GTAATCGACGGTGGACTAC		 63 348
GU13_380 13
14		 F: GGCTGGTTCCACCGGCTCCTTCAG
R: GGCTGGTTCCTGACTAAAATTTGT		 63 380
G427_382 15
16		 F: GTAATCGACGCACGGTGAC
R: GTAATCGACGTCGTATCATTTA		 60 380
G119_411 17
18		 F: ATGATTGAAATAAGCCCAAAAGAG
R: ATTGGGCGATCGTCTGTACAATGA		 63 411
GV01_424 19
20		 F: TGACGCATGGCACAGAACAATTTA
R: GCATGGCGAGTAGATACAACATA		 63 424
GW04_463 21
22		 F: CAGAAGCGGACAGCTTGTACCAGG
R: CAGAAGCGGAATATGAGGCCATCC		 63 463
G169_515 23
24		 F: ACGACGTAGGCAAGATGTCAAACC
R: ACGACGTAGGTAGTAAACAACTCT		 63 515
G116_539 25
26		 F: TACGATGACGATCATGTCC
R: TACGATGACGACAACCCG		 63 520
GV04_618 27
28		 F: ACGACGTAGGTAGTAAACAACTCT
R: CCCCTCACGATCGAGAATATTTA		 63 618
GV01_678 29
30		 F: TGACGCATGGGTAACCAGTTCAAC
R: TGACGCATGGCAAATAAATCAACC		 58 678
GG05_689 31
32		 F: CTGAGACGGAGATGGGGAGCTCAA
R: CTGAGACGGATCAATCACCCAACC		 63 689
GA07_775 33
34		 F: GAAACGGGTGATTAGGTTTAGGTG
R: GAAACGGGTGCATGCTATTTATAT		 63 775
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 더 바람직하게는 3개의 프라이머 세트, 좀더 바람직하게는 4개의 프라이머 세트, 가장 바람직하게는 7개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 7개의 프라이머 세트를 이용하면, 12 종의 포도 국내육성 품종 (청수, 홍단, 탐나라, 홍이슬, 흑구슬, 흑보석, 수옥, 두누리, 탐금추, 홍이람, 나르샤, 홍소담)의 판별이 가능하다 (표 3 참조).
본 발명에 있어서, "프라이머"는 중합반응을 개시하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다.
프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 Guanine 및 cytosine의 함량 (GC contents), GC배열, annealing 온도 및 이온 강도등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질 (intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 SCAR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 포도 품종 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 포도 품종을 대상으로 RAPD 분석을 실시하고, 품종 특이적인 RAPD 마커를 선발하여, 선발된 RAPD 표지의 염기서열 분석 결과를 토대로 디자인된, 선발 RAPD 프라이머 10개의 염기를 포함하는 20~28 base pair의 SCAR 프라이머 세트가 제작될 수 있다.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 (Tris-HCL, PCR enhancers, (NH4)2SO4 및 20mM MgCl2)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 포도에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 SCAR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 포도 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 포도품종의 DNA 추출
본 발명에 이용된 포도 품종은 국내육성 품종인 청수, 홍단, 탐나라, 홍이슬, 흑구슬, 흑보석, 수옥, 두누리, 탐금추, 홍아람, 나르샤 및 홍소담과 기존 품종인 알덴(Alden), 캠벨얼리(Campbell Early), 델라웨어(Delaware), 더체스 (Ductchess), 골든머스캇(Golden Muscat), 힘로드시드레스(Himrod Seedless), 쉴러 (Schuyler), 홍이두(Beniizu), 거봉(Kyoho), 피오네(Pione), 슈퍼함부르그(Super Hamburg), 타노레드(Tano Red), 머스캇함부르그(Muscat Hamburg) 및 시벨9110 (Seibel 9110)로 총 26품종 이었다.
포도 어린 잎으로부터의 게놈 DNA의 추출을 위해서 DNeasy plant mini kit (Qiagen)를 사용하였다. 추출된 DNA는 0.8%의 아가로즈 겔상에 전기영동하여 확인하였고, DNA 양은 NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific)로 정량한 후 10ngμL-1 의 농도로 희석하여 분석에 사용하였다.
실시예 2. RAPD 분석을 이용한 품종간 다형성 탐색
RAPD 표지 선발에는 Operon 및 University of British Columbia (UBC)에서 제조된 10 개의 염기로 구성된 임의의 프라이머를 사용하였다. PCR 반응은 40ng의 게놈 DNA에 1×PCR 완충액, 5 pmol의 random 프라이머, 200μM의 dNTP, 3mM의 MgCl2와 0.4 유닛 (unit)의 Taq DNA 중합효소 (Genetbio)를 첨가하여, 반응액을 12.5μL로 맞추었다.
PCR 반응은 thermocycler (Bio-rad icycler PCR system)를 사용하여 하기와 같은 프로그램으로 수행하였다. 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 45초간 변성, 37℃에서 45초간 어닐링 (annealing), 및 72℃에서 2분간 연장 (extension) 과정을 10 회 반복 수행한 후, 94℃에서 45초간 변성, 42℃에서 45초간 어닐링, 및 72℃에서 2분간 연장 과정을 30 회 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 연장반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로즈 겔에서 150V로 3시간 동안 전기영동하여 밴드 유무를 확인하였다.
실시예 3. 선발된 품종 특이 RAPD 표지의 클로닝과 염기서열 분석
선발된 품종 특이적 RAPD 표지의 염기서열 분석을 위해 표지 선발에 사용되었던 프라이머로 PCR을 실시한 후, 전기영동하여 특이 표지 DNA 밴드를 잘라내고 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 TOPO-TA cloning system (Invitrogen)을 이용하여 pCR2.1-TOPO (Invitrogen, USA) 벡터에 넣어 E. coli TOP10 (Invitrogen, USA)에 형질전환시킨 후 DNA가 삽입된 균주를 선발하였다. 상기 선발된 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리하였고, 삽입된 DNA 전 염기서열을 automated sequencer (CoreBioSystem)를 이용하여 분석하였다.
실시예 4. 품종 특이적 SCAR 표지 개발
선발된 RAPD 표지의 염기서열 분석 결과를 토대로 하여 선발된 프라이머의 10 개의 염기를 포함하는 24~28 base pair의 SCAR 프라이머를 제작하였다.
이후, 합성된 SCAR 프라이머를 각 품종에 적용하여 실용성을 검토하였다.
PCR은 총 15μL 반응액에 40ng의 게놈 DNA, 200μM의 dNTP, 5pmol의 SCAR 프라이머, 1×PCR 완충액 및 0.5 유닛의 Hot-start Taq DNA 중합효소 (Genetbio)를 첨가하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후; 95℃에서 30초간 변성, 63℃에서 30초간 어닐링 (annealing), 72℃에서 1분간 연장 (extension) 과정을 30 회 반응시킨 후; 72℃에서 5분간 처리한 후 반응을 종료하였다.
PCR 분석 결과 16 종의 SCAR 프라이머 쌍에서 RAPD 표지와 동일한 결과를 얻을 수 있어 품종 판별에 이용할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. G507_334 (서열번호 39), G427_348 (서열번호 40), G427_382 (서열번호 42), G119_411 (서열번호 43), G169_515 (서열번호 46), GV01_678 (서열번호 49), 및 GG05_689 (서열번호 50)를 포함하는, 포도의 품종 판별용 SCAR (Sequence Chracterized Amplified Region) 마커.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 SCAR 마커는 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 분석으로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 SCAR 마커.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 포도 품종은 청수, 홍단, 탐나라, 홍이슬, 흑구슬, 흑보석, 수옥, 두누리, 탐금추, 홍아람, 나르샤, 홍소담, 알덴 (Alden), 캠벨얼리(Campbell Early), 델라웨어(Delaware), 더체스(Ductchess), 골든머스캇(Golden Muscat), 힘로드시드레스(Himrod Seedless), 쉴러(Schuyler), 홍이두(Beniizu), 거봉(Kyoho), 피오네(Pione), 슈퍼함부르그(Super Hamburg), 타노레드(Tano Red), 머스캇함부르그(Muscat Hamburg) 및 시벨9110(Seibel 9110)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 SCAR 마커.
  4. 청구항 1에 있어서, G509-243 (서열번호 35), GG05_281 (서열번호 36), GU19_283 (서열번호 37), G116_319 (서열번호 38), GU13_380 (서열번호 41), GV01_424 (서열번호 44), GW04_463 (서열번호 45), G116_539 (서열번호 47), GV04_618 (서열번호 48), 및 GA07_775 (서열번호 51)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는, SCAR 마커.
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  8. 삭제
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