CN107760798B - 葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明属于葡萄分子育种领域，具体提供了一种葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记。在母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’构建的遗传连锁图谱的第18连锁群上，检测到葡萄果实无核主效QTL位点，该位点贡献率为77.9%，本发明在葡萄果实无核主效QTL位点所在区间筛选出与其连锁的SSR分子标记VvSD10，可用于葡萄果实无核性状的早期检测。
Description
技术领域
本发明属于葡萄分子育种领域，具体提供了一种葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记。
背景技术
葡萄（Vitis vinifera L.）属于葡萄科葡萄属浆果，它是我国第二大栽培果树，可以广泛地应用于酿酒、鲜食、制汁、制干。其中，无核葡萄占据首要地位。无核葡萄果汁丰富，含糖量高，食用方便，品质优良，深受广大消费者喜爱。在发达国家，有超过50%消费的鲜食和制干葡萄是无核葡萄。在我国，新疆是葡萄主产区，且大部分是无核葡萄品种。因此，无核葡萄育种成为葡萄育种的主要目标之一。
在无核葡萄品种选育上，主要途径是常规杂交育种，通常使用有核品种作母本，无核品种作父本的组合。但是，常规的杂交育种周期长，后代选育率低，大大阻碍了无核葡萄育种的进程。近几年，分子标记的不断发展，给无核葡萄选育提供了便利。利用分子标记对杂种后代进行早期的无核性状鉴定，极大地加速了无核葡萄的育种进程。
目前利用分子标记辅助育种进行葡萄无核性状的研究已有报道，其中SSR标记VMC7F2被广泛研究。J. A. Cabezas等人在‘赤霞珠’ב秋无核’的118株杂交子代中定位到了与葡萄无核性状相关联的QTL位点SDI，与该位点紧密连锁的分子标记VMC7F2在198bp等位点上能对后代的无核性状进行有效的分离，其对表型的解释率为50%。但是，在研究的‘红地球’与‘森田尼无核’群体中，用VMC7F2标记的引物对扩增两亲本的基因组DNA，结果显示，两亲本的扩增产物间几乎无差别。
发明内容
本发明的目的是筛选葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记，提供葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记的引物对，利用该引物对检测葡萄果实无核性状。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记VvSD10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述葡萄果实无核主效QTL位点是以母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’构建的遗传连锁图谱为基础，结合父母本及其F1代群体果实的有无核表型定位得出的，该位点位于第18连锁群上，贡献率为77.9%。
本发明还提供一种葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记VvSD10的引物对，其正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，即：5'-agagctcatttggattaagagcgagtaattatattgt-3'；其反向引物序列如SEQ ID NO.3所示，即5'- ggaaaaatccatcgctaacaaagtattaattctcttca-3'。
本发明还提供了一种检测葡萄果实无核性状的方法，包括以下步骤：用上述引物对扩增待检测葡萄样本和有核、无核对照样本的全基因组DNA，利用HRM技术分析扩增产物，若扩增产物的熔解曲线与无核对照样本颜色一致，则代表待检测葡萄样本果实无核。
上述方法中，HRM技术的PCR反应体系为15 µL：1.6µL浓度为3µmol/L 的MgCl2，7.5µL的 2×HRM Master Mix， 浓度为10µM的正反向引物各1µL，10ng模板DNA，加无菌蒸馏水至15µL。
上述方法中，HRM技术的PCR 反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，62℃复性15s，72℃延伸10s，共48个循环，升温和降温过程中温度变化率分别为4.4℃/s和2.2℃/s。
上述方法中，HRM 技术的分析过程为：95℃变性1 min，40℃杂交1 min，65～95℃读取熔解曲线，温度变化率为1℃/s。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明确定了葡萄果实无核性状的主效QTL位点，该位点贡献率为77.9%，基于该位点筛选到了连锁的SSR分子标记。
2.本发明筛选的葡萄无核主效QTL位点的SSR分子标记VvSD10，可用于母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’F1代群体无核性状的检测，检测正确率达56.44%。
附图说明
图1为分子标记VMC7F2的引物对在母本‘红地球’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图2为分子标记VMC7F2的引物对在父本‘森田尼无核’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图3为分子标记VvSD10的引物对在母本‘红地球’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图4为分子标记VvSD10的引物对在父本‘森田尼无核’中的扩增产物的毛细管电泳图；横轴代表片段大小（bp），纵轴代表峰的高度（cm）；
图5为分子标记VvSD10的引物对在母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’F1代群体中的扩增产物的高分辨率熔解曲线图；横轴代表熔解曲线温度，纵轴代表相对荧光强度；A区为母本‘红地球’及与其熔解曲线颜色一致的子代样本，B区为父本‘森田尼无核’及与其熔解曲线颜色一致的子代样本。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记的获得
（1）将母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’进行杂交，获得131株F1代群体；
（2）对两个亲本及131株F1代群体进行RAD-seq测序（限制性酶切位点关联DNA测序）；首先提取两个亲本和131株F1代群体每个个体的基因组DNA，质量检测后进行酶切，电泳回收所需长度的DNA片段，加上接头进行cluster制备，上机测序；然后运用SOAP比对软件将测序序列比对到参考基因组序列上（NCBI-GCF-000003745.3-12X）；根据SOAP比对结果，运用SAMtools软件生成CaSFS软件所需的pileup和glf文件，利用CaSFS软件鉴定群体中每个位点的情况，过滤获得亲本之间的有效SNP集；由于SNP数量多，采用窗口滑动的方法，选择以每15个SNP为一个窗口，每次滑动一个SNP，确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点，得到每个个体的基因型并生成bin图；对生成的bin图采用拟测交的方式，利用Joinmap软件进行连锁分析，构建‘红地球’与‘森田尼无核’遗传连锁图谱；
（3）在果实成熟期，统计母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’的131个F1代群体果实的有无核情况；
（4）将F1代群体的有无核情况与步骤（2）中构建的遗传连锁图谱进行遗传连锁和QTL分析，在遗传连锁图谱的第18连锁群上检测到果实无核性状的QTL位点，该位点的定位区间在26835846～26960426，位于葡萄基因组18号染色体上，在定位区间内表型与基因型有很好的共分离；该QTL位点LOD值为26.3，贡献率为77.9%，是主效QTL；
（5）根据步骤（4）中所得到的QTL位点的定位区间，用perl语言找到了符合SSR 序列特征的35个SSR分子标记，利用Primer premier5.0软件设计35个SSR分子标记的引物对，通过HRM（高分辨率熔解曲线分析）技术筛选到了在亲本之间存在差异的一对引物对，将其在父本中的扩增产物命名为VvSD10，并将其作为鉴定葡萄果实无核性状的标记。
HRM技术包括PCR扩增和HRM分析过程，HRM技术的PCR反应体系为15 µL：1.6µL浓度为3µmol/L Mgcl2，7.5µL的 2×HRM Master Mix，浓度为10µM的正反向引物各1µL，10ng模板DNA，加无菌蒸馏水至15µL；PCR 反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，62℃复性15s，72℃延伸10s，共48个循环；升温和降温过程中温度变化率分别为4.4℃/s和2.2℃/s；HRM 分析过程为：95℃变性1 min，40℃杂交1 min，65～95℃读取熔解曲线，温度变化率为1℃/s。
实施例2葡萄果实无核性状的早期检测
苗期提取‘母本‘红地球’、父本‘森田尼无核’及两亲本杂交F1代群体的全基因组DNA作为模板，以分子标记VvSD10的引物对作为扩增引物，利用HRM（高分辨率熔解曲线分析）技术进行检测分析；以母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’的熔解曲线作对照，若子代的熔解曲线与母本的熔解曲线颜色一致，则预测子代样本果实有核，若子代的熔解曲线与父本的颜色一致，则预测子代样本果实无核；结果显示，在131个F1代群体中，有101个子代个体的熔解曲线颜色与父本一致，存在分子标记VvSD10。
果实成熟期，对F1代群体的果实表型进行检测，结果显示，上述101个检测到分子标记VvSD10的个体中，有57个果实无核，有44个果实有核，分子标记VvSD10检测果实无核性状正确率为56.44%。
上述分子标记VvSD10的正向引物序列为5'-agagctcatttggattaagagcgagtaattatattgt-3'，反向引物序列为 5'-ggaaaaatccatcgctaacaaagtattaattctcttca-3'。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记
<130> 无
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaaaaatcc atcgctaaca aagtattaat tctcttcaac aaatggtttg ttccgtgtgt 60
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<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagctcatt tggattaaga gcgagtaatt atattgt 37
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaaaaatcc atcgctaaca aagtattaat tctcttca 38
Claims (3)
1.一种葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记VvSD10，其特征在于：所述分子标记VvSD10的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种葡萄果实无核主效QTL位点的SSR分子标记VvSD10的引物对，其特征在于：所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种检测葡萄果实无核性状的方法，其特征在于：包括以下步骤：用权利要求2所述引物对扩增待检测葡萄样本和有核、无核对照样本的全基因组DNA，利用HRM技术分析扩增产物，若扩增产物的熔解曲线与无核对照样本颜色一致，则代表待检测葡萄样本果实无核；所述待检测葡萄样本为母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’的子代群体，有核对照样本为‘红地球’，无核对照样本为‘森田尼无核’。
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