CN105331732A - 一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法 - Google Patents

一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鱼类分子标记及种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法。该方法步骤包括：(1)河川沙塘鳢待测家系的建立及培育；(2)河川沙塘鳢待测家系亲本及子代个体DNA的提取；(3)河川沙塘鳢多态性微卫星引物的筛选及合成；(4)河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增；(5)河川沙塘鳢的家系鉴别及亲缘关系鉴定。本发明可以准确而快速地对不同家系进行鉴别，对河川沙塘鳢进行亲子鉴定，有助于优化其人工繁殖，防止近亲衰退，不仅为河川沙塘鳢养殖群体的系谱建立及制定科学的种群遗传管理策略提供技术支持，也为以后河川沙塘鳢的大规模家系鉴别和亲子鉴定提供可靠的方法。

Description

一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法
技术领域
本发明涉及鱼类分子标记及种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法。
背景技术
河川沙塘鳢(Odontobutispotamophila)属鲈形目(Perciformes)，沙塘鳢科(Odontobutidae)，沙塘鳢属(Odontobutis)，俗称：浦鱼、土布鱼、虎头鲨、虎头呆子。在我国广泛分布于长江中下游、钱塘江、闽江等水系，属于中国特有种。该鱼为淡水底栖小型肉食性鱼类，肉质细嫩，系餐桌名肴，深受江浙沪等地人们的喜爱。目前全国已经零星开展了河川沙塘鳢的混养和套养，但在生产该鱼苗种过程中，生产单位不注重该鱼种质资源管理，导致养殖成鱼发生生长速度变慢、病害增加等种质退化现象。良种问题已成为制约河川沙塘鳢养殖业稳定发展的主要“瓶颈”之一。
家系选育是加强河川沙塘鳢良种选育的一种有效方式，在家系建立过程中需要根据家系信息准确选留亲本，避免近交衰退现象的产生。但在河川沙塘鳢实际的生产培育过程中，为了减少管理强度、节约空间、减少成本，多采用不同家系混养的方式，这就不可避免的产生了近亲交配，降低了子代的遗传多样性，使河川沙塘鳢的生产性能降低。并且，随着河川沙塘鳢数量的减少，人们通过增殖放流的方式增加群体数量，通过人工培育的苗种进行放流不可避免地降低了放流群体的遗传多样性，因此，对河川沙塘鳢不同家系的亲缘关系进行鉴别是河川沙塘鳢良种选育及其种群数量增加的关键技术。
在水产养殖中应用微卫星标记来鉴别家系、确定亲缘关系已经得到认同和关注，微卫星DNA具有丰富的多态性和简单的遗传方式，在遗传多样性的维持、濒危物种的保护、良种选育和基因作图等领域得到了广泛的应用。目前利用微卫星标记技术进行家系鉴别及亲子鉴定已在对虾(Fenneropenaeuschinensis)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)等水生生物中得到应用，而国内外关于河川沙塘鳢的家系鉴别和亲缘关系鉴定尚未见报道。因此，本发明通过对河川沙塘鳢的不同家系进行鉴别及对亲缘关系进行分析，有助于优化其人工繁殖，防止近亲衰退，不仅为河川沙塘鳢养殖群体的系谱建立及制定科学的种群遗传管理策略提供技术支持，也为今后河川沙塘鳢的大规模家系鉴别和亲子鉴定提供可靠的方法。
发明内容
本发明的目的在于通过微卫星分子标记技术，提供一种利用微卫星的多态性对不同家系的河川沙塘鳢进行家系鉴别的方法，为以后的河川沙塘鳢的良种提供必要的技术支持。
一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法。所述方法按下列步骤进行：
1、河川沙塘鳢待测家系的建立及培育
选取健康的河川沙塘鳢亲鱼作为亲本进行家系繁育，剪取待测亲本和子代的尾鳍放于99％的无水乙醇中保存备用。
2、河川沙塘鳢待测家系亲本及子代个体DNA的提取
使用上海捷瑞生物工程有限公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，根据说明书，提取待测家系亲本和子代DNA。DNA以1％的琼脂糖凝胶电泳检测(电压120V，电流165A，时间22min)，挑选出条带亮且无明显降解的DNA，并置于-20℃保存。
3、河川沙塘鳢多态性微卫星引物的筛选及合成
筛选出12个微卫星位点，分别为：E-OP64、E-OP87、E-OP140、E-OP142、E-OP146、E-OP201、E-OP204、E-OP130、E-OP72、OP34a、OP13a和OP155a，它们所对应的12对引物序列分别是：SEQIDNO.1-2，SEQIDNO.3-4，SEQIDNO.5-6，SEQIDNO.7-8，SEQIDNO.9-10，SEQIDNO.11-12，SEQIDNO.13-14，SEQIDNO.15-16，SEQIDNO.17-18，SEQIDNO.19-20，SEQIDNO.21-22，SEQIDNO.23-24；
4、河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增
以待测河川沙塘鳢的亲本及子代DNA为模板对步骤3中筛选出来的E-OP64、E-OP87、E-OP140、E-OP142、E-OP146、E-OP201、E-OP204、E-OP130、E-OP72、OP34a、OP13a、OP155a共12个微卫星位点进行荧光PCR扩增。其中微卫星引物信息如表1所示。
表1.12个用于河川沙塘鳢家系鉴定的微卫星引物信息
其中PCR所用的荧光通用引物核苷酸序列为：M13(-21)：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQIDNO.25)。
5、河川沙塘鳢的家系鉴别及亲缘关系鉴定
将步骤4中的PCR扩增产物经基因分析仪进行基因型分析，根据亲本和子代在各位点的基因型，运用EXCEL、POPGENE1.32和NTSYS软件进行聚类分析，鉴别各家系的亲缘关系，并利用CERVUS3.0软件对所选微卫星进行遗传多样性分析，对家系亲本和子代进行亲缘关系分析。
上述步骤4河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增，荧光PCR体系为12μL，包含ddH2O6.79μL，Mix3.85μL，浓度为10μmoL/L的荧光标记通用引物0.16μL，带有M13序列的浓度为10μmoL/L的P+引物0.04μL，浓度为10μmoL/L的P-引物0.16μL，DNA模板1.0μL。其中Mix是上海捷瑞生物工程有限公司不含染料的PCRMix。
步骤4河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增中，产物使用HEX、FAM、TAMRA三色荧光标记，两种产物大小相差较大的可使用同种HEX荧光在基因分析仪的同一分析孔中进行毛细管电泳。
本发明具有以下积极效果：
1、本发明首次将微卫星标记技术运用于河川沙塘鳢的家系鉴别及亲缘关系鉴定，为今后河川沙塘鳢的遗传育种及种质鉴定提供必要的技术支持。
2、本发明采用基因分型技术，读出河川沙塘鳢个体的基因型数据，减少误差，确保实验的正确率。
3、本发明不需要使用荧光等物理标记，避免物理标记对鱼生长的影响和对鱼体的损伤，造成实验的误差。
附图说明
图1是本发明中河川沙塘鳢家系D及未知来源的个体聚类分析图(parentD1、parentD2分别为家系D的父本和母本，D1-D10为家系D的子代，未知1、未知2为河川沙塘鳢2个未知来源个体)；
图2是本发明中7个家系分养子代群体和亲本聚类分析图(parentsA-parentsG为A、B、C、D、E、F、G7个家系父母本，popA-popG为A、B、C、D、E、F、G7个家系对应子代群体)；
图3是本发明中7个家系混养子代和亲本聚类分析图(parentsA-parentsG为A、B、C、D、E、F、G7个家系父母本，1-100为100尾混养子代个体)。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步阐述，但本发明的作用不仅限于此。涉及到的具体参数为发明技术方案所需，不应理解为对本发明保护范围的限制。
1、河川沙塘鳢家系的繁育
选取来自浙江建德、安徽当涂、江苏射阳和太湖四个不同地理群体的河川沙塘鳢亲鱼作为繁殖亲本，按一雌一雄的交配方式进行两两组合建立全同胞家系，每个组合设3个平行，共建立48个全同胞家系，记录每个家系的亲本交配方式及子代情况。随机选取其中7个家系作为待测家系，剪取亲本尾鳍样品放于99％的无水乙醇中保存备用，并将这7个家系的子代分开饲养，待其达到一定大小时从每个家系中取30尾子代个体，剪取其尾鳍放于99％的无水乙醇中保存备用，并将其余的7个家系子代混养后随机挑选100尾，剪取尾鳍放于99％的无水乙醇中保存备用。
2、河川沙塘鳢亲本和子代基因组DNA提取
河川沙塘鳢DNA的提取采用上海捷瑞生物工程有限公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，参照说明书提取，对提取的DNA样品以1％的琼脂糖凝胶电泳检测(电压120V，电流165A，时间22min)，EB染色并放在紫外凝胶成像系统下拍照，挑选出条带亮且无明显降解的DNA，并置于-20℃保存。
3、河川沙塘鳢多态性微卫星标记的筛选和引物合成
河川沙塘鳢家系鉴定所用的微卫星引物由本实验室自行开发，方法如下：首先利用北京百泰克生物公司RNA提取试剂盒提取河川沙塘鳢的RNA，并交给上海晶能生物公司进行IllminaHiseq2000转录组高通量测序，采用Tophat软件进行序列的组装和拼接，然后用SSRHunt软件预测序列中可能存在的微卫星位点，利用Primer5.0软件设计引物，并由上海捷瑞生物公司合成其引物。挑选出多态性含量高且能稳定扩增的微卫星引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。共筛选出12对理想的微卫星引物，其信息如表2所示。
表212个用于河川沙塘鳢家系鉴定的微卫星引物信息
4、微卫星引物在家系亲本及子代中的扩增
本发明采用一种经济的荧光标记PCR方法，PCR反应体系内包含3个引物：筛选出来的SSR特异性正向引物，其5’端加有长为18bp的通用引物M13(-21)，其序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；SSR特异性反向引物；HEX、FAM、TRAMER三种荧光标记的M13通用引物。荧光标记PCR体系为12μL，如表3所示。
表3荧光标记PCR体系
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，接下来是30个循环，包括94℃变性30s，退火45s，72℃延伸45s；然后是8个循环，包括：94℃变性30s，53℃退火45s以及72℃延伸45s，最终在72℃延伸10min。
PCR反应结束后，产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测有单一条带后，用ABI3500xl基因分析仪进行毛细管电泳，检测荧光信号并利用软件GENEMARKER1.97分析各微卫星位点的片段长度，建立一个小型的亲本及子代基因型数据库。
实施例1
将选取待测的7个家系编号为A、B、C、D、E、F、G，随机选取家系D的亲本及10个子代个体，并选用2个未知来源的河川沙塘鳢个体，记为未知1和未知2，按以上方法得出待测个体的基因型bp数，并进行适当的人工校正，建立一个家系基因型信息表，表4为12对引物在家系D个体间的基因型数据表。
表412对引物的基因型数据表
注：数字代表基因片段大小
将基因型数据表转化成POPGENE1.32软件所需的POPGENE格式，用POPGENE1.32软件对待测个体进行遗传距离分析，得出其遗传一致度，用EXCEL对遗传一致度表格进行转置并转化成NTSYS软件所需的TXT格式，用NTSYS软件根据遗传一致度对个体进行聚类分析，得出聚类图，如为同一家系的亲本和子代，将聚类为同一支。图1为河川沙塘鳢家系D及未知来源的个体聚类分析图，由图可以看出，家系D的亲本和子代聚在一起，而两个未知来源的个体各自单独聚在一支，这说明两个未知来源个体不属于家系D，与家系D的亲缘关系较远，这和已知情况完全一致。因此，所选微卫星标记可以将非同一家系的个体区分开来。
实施例2
随机选取7个家系的父母本和分养家系的子代，按以上方法得出亲本和各家系子代的基因bp数，并进行适当的人工校正，建立一个家系基因型信息表，表5为12对引物在部分个体间的基因型数据表。
表512对引物的基因型数据表
注：数字代表基因片段大小
按实施例1所示方法对7个家系的亲本和子代进行聚类分析，得出聚类图。图2为7个家系的聚类情况，由聚类图可以看出，各家系的亲本和子代群体都正确的聚在一起，这和已知的情况完全一致。因此，所选微卫星标记可以将各家系区分开来，并且将各家系子代群体正确的分配到各家系中，聚类情况准确率为100％。
实施例3
按实施例1所示方法，得到7个家系亲本及100尾混养子代的基因型数据，建立基因型数据库，用POPGENE1.32、EXCEL和NTSYS软件对7个家系的亲本和混养子代进行聚类分析，图3为聚类情况。由图可以看出，100个混养子代均能分配到某一亲本所在的家系中，因此可以确定100个混养子代个体都可以找到其对应的父母。
实施例4
用CERVUS3.0软件对7个家系的亲本和子代进行亲子鉴定分析，计算各微卫星位点的等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率等。表6为河川沙塘鳢12个微卫星位点遗传多样性信息及排除率情况。
表6河川沙塘鳢12个微卫星位点遗传多样性信息及排除率
Locus k H(O) H(E) PIC Excl(1) Excl(2) HW F(Null)
E-OP64 7 1.000 0.614 0.537 0.201 0.340 ** -0.2703
E-OP87 6 1.000 0.778 0.741 0.386 0.566 ** -0.1370
E-OP140 6 1.000 0.766 0.731 0.377 0.559 ** -0.1552
E-OP142 8 1.000 0.778 0.745 0.396 0.577 ** -0.1447
E-OP146 8 1.000 0.775 0.739 0.390 0.569 ** -0.1432
E-OP201 8 1.000 0.770 0.732 0.383 0.561 ** -0.1456
E-OP204 8 1.000 0.811 0.779 0.440 0.617 ** -0.1109
E-OP130 6 1.000 0.700 0.646 0.286 0.454 ** -0.1982
E-OP72 9 1.000 0.719 0.690 0.334 0.522 ** -0.2288
OP34a 5 1.000 0.715 0.666 0.301 0.475 ** -0.1894
OP13a 5 1.000 0.648 0.583 0.229 0.384 ** -0.2488
OP155a 5 1.000 0.729 0.678 0.309 0.483 ** -0.1699
Mean 6.75 1.000 0.734 0.689 - - - -
累计排除率 - - - - 0.993109 0.999831 - -
注：K为等位基因，H(O)为观测杂合度，H(E)为期望杂合度，PIC为多态信息含量，Excl(1)为双亲未知时的排除率，Excl(2)为已知单亲时的排除率，HW为哈迪温伯格平衡检测，**表示偏离显著，F(Null)表示无效等位基因频率。
综上所述，本发明所选用的12对微卫星引物能够有效的实现对河川沙塘鳢的家系鉴别和亲子鉴定，该方法在已知信息的情况下，聚类情况和实际情况相比，准确率为100％。对亲本和家系的亲子关系分析结果显示，累计排除率均达到99％。因此，本发明能够满足河川沙塘鳢的种质鉴定、增值放流的系谱追踪和家系管理的要求。

Claims (3)

1.一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法，其特征在于包括以下5个步骤：
(1)河川沙塘鳢待测家系的建立及培育：选取健康的河川沙塘鳢亲鱼作为亲本进行家系繁育，剪取待测亲本和子代的尾鳍放于99％的无水乙醇中保存备用；
(2)河川沙塘鳢待测家系亲本及子代个体DNA的提取；
(3)河川沙塘鳢多态性微卫星引物的筛选及合成：筛选出12个微卫星位点，分别为：E-OP64、E-OP87、E-OP140、E-OP142、E-OP146、E-OP201、E-OP204、E-OP130、E-OP72、OP34a、OP13a和OP155a，它们所对应的12对引物序列分别是：SEQIDNO.1-2，SEQIDNO.3-4，SEQIDNO.5-6，SEQIDNO.7-8，SEQIDNO.9-10，SEQIDNO.11-12，SEQIDNO.13-14，SEQIDNO.15-16，SEQIDNO.17-18，SEQIDNO.19-20，SEQIDNO.21-22，SEQIDNO.23-24；
(4)河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增：以步骤(2)提取的河川沙塘鳢的亲本及子代DNA为模板，对步骤(3)中筛选出来的12个微卫星位点进行荧光PCR扩增；
(5)河川沙塘鳢的家系鉴别及亲缘关系鉴定：将步骤(4)中的PCR扩增产物经基因分析仪进行基因型分析，根据亲本和子代在各位点的基因型，运用EXCEL、POPGENE1.32和NTSYS软件进行聚类分析，鉴别各家系的亲缘关系，并利用CERVUS3.0软件对所选微卫星进行遗传多样性分析，对家系亲本和子代进行亲缘关系分析。
2.如权利要求1所述的鉴别河川沙塘鳢家系的方法，其特征在于，步骤(4)河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增，荧光PCR体系为12μL，包含ddH2O6.79μL，Mix3.85μL，浓度为10μmoL/L的荧光标记通用引物0.16μL，带有M13序列的浓度为10μmoL/L的P+引物0.04μL，浓度为10μmoL/L的P-引物0.16μL，DNA模板1.0μL。其中Mix是上海捷瑞生物工程有限公司不含染料的PCRMix。
3.如权利要求1所述鉴别河川沙塘鳢家系的方法，其特征在于，步骤(4)河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增中，产物使用HEX、FAM、TAMRA三色荧光标记，两种产物大小相差较大的使用同种HEX荧光在基因分析仪的同一分析孔中进行毛细管电泳。
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