CN104894289A - 用于检测鸡生长性状的试剂盒及鸡的分子育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鸡生长性状的试剂盒及鸡的分子育种方法，属于分子遗传学领域。本发明采用MassARRAY系统基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术结合单引物延伸反应，对固始鸡和安卡鸡F2代资源群进行miRNA-1687(rs15179830G/T)单个SNP位点基因分型，并与F2代资源群生长性状进行关联分析，结果表明鸡miRNA-1687基因SNP单核苷酸多态性与不同发育阶段的鸡体重关联显著，且TT型个体体重显著优于GT型和GG型，将TT基因型作为鸡体重的辅助选择和分子遗传育种标记，可快速建立遗传资源优良的鸡群。

Description

用于检测鸡生长性状的试剂盒及鸡的分子育种方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测鸡生长性状的试剂盒，同时还涉及一种基于鸡miRNA-1687基因单核苷酸多态性的分子育种方法，属于分子遗传学领域。
背景技术
随着社会经济的迅速发展和人们生活水平的提高，市场对肉质的需求整体上从以前的数量要求转向了对质量风味的追求。生长性状、体尺性状、肉质性状和屠体性状是当今家禽工业最关注的经济性状。大多数的经济性状属于数量性状，主要是由为数众多的微效基因决定的，这些基因同时具有加性效应、显性效应和上位效应，复杂性状的遗传基础是由影响该表型的遗传因素和环境因素以及它们之间的相互作用共同决定的。国内优质地方鸡普遍存在生长速度缓慢的问题，从而影响了经济效益。因此，多年来研究人员试图通过大量的试验寻找与鸡的相关经济性状相关的候选基因，为家禽分子选种育种方面提供辅助标记选择。
应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质的重要途径。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与鸡经济性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法，然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。
单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可以在DNA、RNA和蛋白质水平影响基因的功能，是人类可遗传变异最常见的一种，占已知多态性的90％以上。对基因产物有影响的SNP的功能进行分析，其意义十分重大。SNP多样性与经济性状的关联分析一直是畜禽遗传学研究的热点。随着miRNA的发现及其研究的深入，研究者发现miRNA不仅参与了动物复杂性状表型形成的分子调控过程，而且其SNP变化还可能导致miRNA功能异常，进而引起生物表型性状的变异。miRNA相关多态的形成机制包括插入、缺失、易位、扩增以及碱基替换。miRNA的多态性是影响miRNA调节功能的重要因素。单个miRNA表达异常时，可能影响数百种靶基因的表达，当其中某些关键蛋白表达量降低时，会导致机体生理功能异常和疾病发生。研究发现，发生在miRNA初级产物、前体及成熟体上的多态性会潜在的影响数以百计基因的表达和通路，从而广泛影响miRNA的功能。
SNP多态性的检测方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等。但SSCP操作繁琐、耗时长，影响因素多，且实验过程中存在假阴性问题，所以并非理想的SNP检测手段；直接测序技术成本较高。许多研究运用了PCR-RFLP方法或PCR与聚丙烯酰胺电泳检测相结合的方法。
MassARRAY系统进行SNP分型的基本原理是以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术结合单引物延伸反应，通过对核酸片段分子量直接鉴定而实现的。引物序列经合成、稀释后首先进行多重PCR扩增，以增加单碱基延伸反应的模板，然后再进行单碱基延伸反应，单碱基延伸反应中所用为ddNTP，因此延伸一个碱基后反应自动终止。最后将延伸产物利用全自动点样机加到芯片上，通过MassARRAY进行质谱分型。MASSARRAY平台检测SNP具有以下优势：准确可靠，直接对分子量进行检测，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低，无需再次验证，也无需设计统计学重复。通量较高，可以适用于对几个到几百个SNP位点的检测。检测时间短，利用质谱检测在40min内就可以完成对380个样本的检测，并且实时显示检测结果。
公告号CN103710427B的发明专利公开了一种基于鸡miRNA-1704基因单核苷酸多态性的分子育种方法，包括以下步骤：(1)以包含miRNA-1704基因的鸡全基因组DNA为模板，设计一对引物；(2)以引物对P为引物，PCR扩增鸡miRNA-1704基因；(2)用限制性内切酶EcoRⅠ消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡miRNA-1704基因序列中第148位的单核苷酸多态性：当鸡miRNA-1704基因的第148位点为G时，酶切后电泳图谱为两条带，条带大小为184bp和148bp，命名为GG基因型；当鸡miRNA-1704基因的第148位点为C时，酶切后电泳图谱为一条带，条带大小为332bp，命名为CC基因型；当鸡miRNA-1704基因的第148位点为杂合的个体时，酶切后电泳图谱为三条带，条带大小为332bp，184bp和148bp，命名为GC基因型；通过将基因型与鸡的生长性状进行关联性分析，确定基因与性状的对应关系，用于鸡的分子育种；鸡miRNA-1704基因第148位的单核苷酸多态性中CC基因型作为鸡体重性状的标记辅助选择育种中提高鸡体重的分子遗传标记。然而，在该方法中miRNA-1704SNP与鸡初生重、2周龄体重、4周龄体重之间的差异不显著，从6周龄时开始差异显著，考虑到目前集约化养殖鸡的生长周期为50天左右，该方法不利于尽早进行选留。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测鸡生长性状的试剂盒。
同时，本发明还提供一种基于鸡miRNA-1687基因单核苷酸多态性的分子育种方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
用于检测鸡生长性状的试剂盒，包括：
上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)，
下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
单碱基延伸引物：5’-AGTGACTGCAGCATAAAAA-3’(如SEQ ID NO.3所示)。
上述试剂盒还可以包括：10×buffer、Mg2+、dNTP、Hotstar、iPLEX终止反应Mix、单碱基延伸酶、SAP buffer、SAP酶、ddd H2O及DNA Marker等。试剂盒中上述组分的添加量可适当选取，如大于10次的用量。
一种基于鸡miRNA-1687基因单核苷酸多态性的分子育种方法，包括以下步骤：
1)提取鸡总DNA，加入引物进行PCR扩增；
2)加入单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，得反应产物；
3)反应产物经飞行质谱检测后，选留GG基因型的公母鸡个体，建立目标鸡群。
步骤1)中引物如下：
上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3’，
下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3’；
步骤2)中单碱基延伸引物为：5’-AGTGACTGCAGCATAAAAA-3’。
步骤1)中PCR扩增的反应体系为：总计5.0μl；10×buffer 0.5μl，25mM Mg2+0.4μl，25mM dNTP 0.1μl，5U/μl Hotstar 0.2μl，10pmol/μl F Primer/R Primer各0.5μl，100ng/μl总DNA1.0μl，ddd H2O 1.8μl。
步骤1)中PCR扩增的反应程序为：预变性95℃2min；95℃30s；56℃30s；72℃60s，45个循环；72℃5min；25℃保温。
步骤1)中PCR扩增后一般需加入碱性磷酸酶(SAP)去除剩余的dNTP，SAP酶消化为本领域常规技术。在本发明中，SAP酶消化体系为：总计2.0μl；SAP buffer 0.17μl，1.7U/μl SAP酶0.3μl，ddd H2O 1.53μl；SAP酶消化程序为：37℃40min；85℃5min；25℃保温。
步骤2)中单碱基延伸反应的反应体系为：总计2.0μl；10×buffer 0.2μl，反应浓度为1×iPLEX终止反应Mix 0.2μl，7μM单碱基延伸引物0.94μl，反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μl，ddd H2O 0.619μl。
步骤2)中单碱基延伸反应的反应程序为：预变性94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s×5个内部循环，72℃3min；25℃保温。
步骤3)中反应产物先用树脂脱盐，再点样于芯片，芯片用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱检测。
本发明的有益效果：
本发明采用MassARRAY系统基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术结合单引物延伸反应，对固始鸡和安卡鸡F2代资源群进行miRNA-1687(rs15179830G/T)SNP位点基因分型，并与F2代资源群生长性状关联分析，结果表明鸡miRNA-1687基因SNP单核苷酸多态性与不同发育阶段的体重关联显著(与鸡的初生重、4周龄体重、6周龄体重、8周龄体重和10周龄体重存在显著相关(P<0.05))，且TT型个体体重显著优于GT型和GG型，T等位基因有利于鸡体重增加，G等位基因不利于鸡体重增加，将TT基因型作为鸡体重的辅助选择和分子遗传育种标记，可尽早进行鸡只选留，快速建立遗传资源优良的鸡群，在较大程度上节约成本。
附图说明
图1为鸡miRNA-1687基因的SNP测序图；
图2为SNP位点不同基因型的特征质谱图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中用于检测鸡生长性状的试剂盒，包括：
10pmol/μl上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3’，
10pmol/μl下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3’；
7μM单碱基延伸引物：5’-AGTGACTGCAGCATAAAAA-3’。
实施例2
本实施例中用于检测鸡生长性状的试剂盒，除包含如下引物外，还包括：10×buffer、25mM Mg2+、25mM dNTP、5U/μl Hotstar、反应浓度为1×iPLEX终止反应Mix、反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶、SAP buffer、1.7U/μl SAP酶、ddd H2O及DNA Marker；
10pmol/μl上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3’，
10pmol/μl下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3’；
7μM单碱基延伸引物：5’-CATCAACACCAACCCA-3’。
试验例
一、鸡miRNA-1687基因单核苷酸多态性的检测，包括以下步骤：
1、动物材料：固始鸡、安卡鸡
固始鸡属于我国黄鸡类型的一种优良地方品种，它以固始县为中心，在非凡的生态环境和饲养条件下，经过长期闭锁繁衍而自然形成。固始鸡是蛋肉兼用型鸡种，具有优良的性状：一是耐粗饲，抗病力强，适宜野外放牧散养；二是肉质细嫩，肉味鲜美，汤汁醇厚，营养丰富，具有较强的滋补功效；三是母鸡产蛋较多，蛋大，蛋清较稠，蛋黄色深，蛋壳厚，耐贮运。
安卡肉鸡是当今世界优良的肉用鸡种之一，也是目前国内生长速度最快的红黄羽肉鸡，具有适应性强，耐应激，长速快，饲料报酬高等特点。
2、动物的培育：
所用固始鸡-安卡鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建，试验共建立7个家系，其中正交系4个为安卡鸡♂×固始鸡♀，反交系3个为固始鸡♂×安卡鸡♀。F0代是从蛋肉兼用型固始鸡和肉用型安卡鸡纯系中分别选取种鸡，按公母鸡1:6比例配组而成，要求所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正，以保证F1代个体在各个位点的杂合。从每个家系的F1后代中选留一只公鸡，按公母1:9比例与其他家系母鸡交配产生F2代，要求与配公母鸡之间没有亲缘关系，F1代的种用母鸡也尽量散布在各个家系中，选种时尽量选择外貌表现丰富，呈现杂合的个体，保证F2代性状产生较大分离。
3、饲养方法
鸡群饲养于河南某大学试验鸡场，后期试验在河南某大学家禽遗传改良实验室完成。各家系混群，笼养，自由采食，充足饮水。
饲喂至12周龄，采血取样。0～12周龄，每隔一周每只鸡均进行体尺性状和生长性状的测量并记录数据。
4、基因组DNA的提取及构建混池
以固始鸡-安卡鸡资源群体F2代鸡为材料，每只鸡颈静脉抽血5mL，EDTA抗凝(10mmol/L Tris-Cl，0.2mmol/L EDTA，PH 8.0)，置-80℃保存。采用酚氯仿抽提法从F2代资源群个体保存血样中提取基因组DNA，首先用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后使用NanoDrop2000微量分光广度计测定DNA样品的纯度与浓度，不合格的DNA样品重新抽提。随机选取100个个体的DNA样品构建DNA混池，进行筛选。
5、SNP的筛选引物
在NCBI下载pre-miR-1687序列，设计如下SNP测序引物：
上游引物：5’-GCTGATGGTGTCGCGGTGAGC-3’(如SEQ ID NO.4所示)，
下游引物：5’-CTGCATAAAGATGGGAGAAG-3’(如SEQ ID NO.5所示)。
6、固始鸡-安卡鸡群体中存在的SNP验证
DNA混池，利用上述引物进行降落PCR扩增，以DNA池为模版，用上述引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为：总计25.0μl；2×Taq PCR Master Mix(MBI)12.0μl、正向引物(10pmol/l)1.0μl、反向引物(10pmol/l)1.0μl、DNA模板(100ng/μl)0.5μl、ddH2O 10.5μl。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60.2℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
PCR产物直接测序(上海生工)，测序结果使用DNA STAR、BioXM(2.0)和primer 5.0进行SNP分析，根据测序峰是否有套叠峰判断是否为SNP(即存在的突变位点)，测序结果见图1及下表1。
表1 DNA池验证真实存在的鸡miRNA-1687SNP
二、miRNA SNP与经济性状的关联分析
1、试验动物
同试验一。
2、引物的设计与合成
针对鸡miRNA-1687前体区上的突变位点(即rs15179830G/T)设计与合成引物如下：
上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3’，
下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3’；
单碱基延伸引物：5’-AGTGACTGCAGCATAAAAA-3’；
退火温度：48℃。
3、基因型分析
采用Sequenom MassARRay时间飞行质谱技术，对F2代资源群不同个体进行基因分型，应用MassARRay TypeR软件分析质谱图。该过程由北京海斯特临床研究所有限公司完成。
纯化后的基因组DNA样品定量稀释为100ng/μl，每孔加1μl样品于384孔板上，按照下面的反应体系和程序扩增，反应结束加入虾碱性磷酸酶去除剩余的dNTP，然后通过单碱基延伸反应，反应产物用树脂脱盐后，经自动点样仪点样于芯片，点样后的芯片用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱检测。
a.PCR反应体系及反应程序设置
PCR反应体系如下表2所示：
表2 PCR总反应体系
PCR扩增反应程序如下：
预变性95℃2min；95℃30s；56℃30s；72℃60s，45个循环；72℃5min；25℃保温。
b.SAP酶消化反应
SAP酶消化反应体系如下表3所示：
表3 SAP酶消化反应
在PCR仪中进行SAP酶消化，消化反应程序：37℃40min；85℃5min；25℃保温。
c.单碱基延伸反应
单碱基延伸反应体系如下表4所示：
表4 单碱基延伸反应体系
在PCR仪中进行单碱基延伸反应，反应程序：预变性94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s×5个内部循环，72℃3min；25℃保温。
d.树脂脱盐
反应产物用树脂脱盐20min，脱盐操作为：加入16μl水到延伸反应产物的对应孔内，将清洁的松香树脂6mg加入到反应产物中，封膜，低速垂直旋转20min，使树脂与反应产物充分接触，再3200r/min离心5min，使树脂沉入孔底部。利用全自动点样机将脱盐后的样品从384孔板转移到sequenom公司的芯片上，完成点样操作。
e.反应产物的飞行质谱检测
利用飞行质谱仪器直接分析数据，进行miRNA-1687基因(rs15179830G/T)SNP位点基因分型，得到GG、GT、TT三种基因型，不同基因型的特征质谱图见图2。
4、鸡miRNA-1687基因SNP位点的多态性频率统计分析
等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率，取值在0～1之间，即：
等位基因频率＝某基因个数/群体中同一位点基因总数。
基因型频率是指群体中某一基因型个体数占群体总数的比率，即：
基因型频率＝某一基因型个体总数/该测定群体总数。
对F2资源群体中miRNA-1687的位点G>T的基因型频率统计分析结果见下表5。表5结果显示，在F2资源群体中281只为GG基因型，362只为GT基因型，31只为TT基因型。GG、GT和TT基因型频率分别为0.417、0.537和0.046。G和T等位基因的频率分别为0.685和0.315。
表5 miRNA-1687基因在F2代资源群中基因型频率和基因频率
5、鸡miRNA-1687基因SNP位点的多态性与鸡生长性状的关联分析
关联分析模型：利用SPSS(20.0)软件分析基因SNP位点与体重性状的相关性。确保每个性状数据呈正态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应和benferroni多重比较法比较各基因型间的差异，结果见下表6。模型I为该位点多态与生长性状的关联分析模型，即：
Model I：yijkm＝μ+Gi+Sj+Hk+eijkm；
其中：yijkm为个体表型值；μ为总体均值；Gi为基因型固定效应；Sj为种性别效应；Hk为批次效应；eijkm为随机误差。
表6 鸡miRNA-1687基因SNP位点与鸡体重之间的方差分析
注：具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。
由表6可知，鸡miRNA-1687基因SNP位点G>T与不同初生重、4周龄体重、6周龄体重、8周龄体重和10周龄体重显著关联(P<0.05)，并且均表现为GG与GT、GG与TT差异显著；TT型的体重>GT型的体重>GG型的体重。
结果表明，T等位基因有利于鸡体重的增加，G等位基因不利于鸡的体重增加。因此，选取鸡miRNA-1687基因的单核苷酸多态性中的TT基因型作为鸡体重性状的标记辅助选择育种中提高鸡体重的分子遗传标记。
实施例3
本实施例中基于鸡miRNA-1687基因单核苷酸多态性的分子育种方法，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取及PCR扩增
采用酚氯仿异戊醇法提取鸡外周血DNA，溶于适量TE(pH8.0)中，-20℃保存备用，利用引物F Primer/R PRimer进行PCR扩增，得扩增产物；
上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3’，
下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3’；
PCR扩增的反应体系为：总计5.0μl；10×buffer 0.5μl，25mM Mg2+0.4μl，25mM dNTP0.1μl，5U/μl Hotstar 0.2μl，10pmol/μl F Primer/R Primer各0.5μl，100ng/μl总DNA1.0μl，ddd H2O 1.8μl；
PCR扩增的反应程序为：预变性95℃2min；95℃30s；56℃30s；72℃60s，45个循环；72℃5min；25℃保温；
2)SAP酶消化
在扩增产物中加入SAP酶，消化去除剩余的dNTP；
SAP酶消化体系为：总计2.0μl；SAP buffer 0.17μl，1.7U/μl SAP酶0.3μl，ddd H2O1.53μl；
SAP酶消化程序为：37℃40min；85℃5min；25℃保温；
3)单碱基延伸反应
在SAP酶消化后的产物中加入单碱基延伸引物，得反应产物；
单碱基延伸引物为：5’-AGTGACTGCAGCATAAAAA-3’；
单碱基延伸反应的反应体系为：总计2.0μl；10×buffer 0.2μl，反应浓度为1×iPLEX终止反应Mix 0.2μl，7μM单碱基延伸引物0.94μl，反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μl，ddd H2O 0.619μl；
单碱基延伸反应的反应程序为：预变性94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s×5个内部循环，72℃3min；25℃保温；
4)飞行质谱检测
反应产物用树脂脱盐20min后，再用全自动点样机将其转移到芯片上，利用飞行质谱仪器直接分析数据，进行miRNA-1687基因(rs15179830G/T)SNP位点基因分型，得到GG、GT、TT三种基因型；
5)选定基因型鸡的育种
选留TT基因型的公母鸡个体，建立目标鸡群。
本发明中基因型检测方法具有准确可靠、操作简便、通量灵敏、检测时间短、降低成本等特点，可用于鸡的分子辅助选择育种，对提高鸡的生长性状具有重要的作用。

Claims (7)

1.用于检测鸡生长性状的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括：
上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3’，
下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3’；
单碱基延伸引物：5’-AGTGACTGCAGCATAAAAA-3’。
2.一种基于鸡miRNA-1687基因单核苷酸多态性的分子育种方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取鸡总DNA，加入引物进行PCR扩增；
2)加入单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，得反应产物；
3)反应产物经飞行质谱检测后，选留GG基因型的公母鸡个体，建立目标鸡群；
步骤1)中引物如下：
上游引物F PRimer：5’-ACGTTGGATGTGAACAGCAACACAGCTAGG-3’，
下游引物R PRimer：5’-ACGTTGGATGAGCAACTTCTTTGCTGGCTG-3’；
步骤2)中单碱基延伸引物为：5’-AGTGACTGCAGCATAAAAA-3’。
3.根据权利要求2所述的分子育种方法，其特征在于：步骤1)中PCR扩增的反应体系为：总计5.0μl；10×buffer 0.5μl，25mM Mg2+0.4μl，25mM dNTP 0.1μl，5U/μl Hotstar0.2μl，10pmol/μl F Primer/R Primer各0.5μl，100ng/μl总DNA 1.0μl，ddd H2O 1.8μl。
4.根据权利要求3所述的分子育种方法，其特征在于：步骤1)中PCR扩增的反应程序为：预变性95℃2min；95℃30s；56℃30s；72℃60s，45个循环；72℃5min；25℃保温。
5.根据权利要求2所述的分子育种方法，其特征在于：步骤1)中PCR扩增后进行SAP酶消化反应，SAP酶消化体系为：总计2μl；SAP buffer 0.17μl，1.7U/μl SAP酶0.3μl，ddd H2O 1.53μl；SAP酶消化程序为：37℃40min；85℃5min；25℃保温。
6.根据权利要求2所述的分子育种方法，其特征在于：步骤2)中单碱基延伸反应的反应体系为：总计2.0μl；10×buffer 0.2μl，反应浓度为1×iPLEX终止反应Mix 0.2μl，7μM单碱基延伸引物0.94μl，反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μl，ddd H2O 0.619μl。
7.根据权利要求6所述的分子育种方法，其特征在于：步骤2)中单碱基延伸反应的反应程序为：预变性94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s×5个内部循环，72℃3min；25℃保温。
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