CN110079609B - 一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记及其应用，该分子标记位于基因组版本galGal5:chr4:33552203，多态性为A/C。本发明还提供了用于检测该分子标记的特异性引物对和方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2‑3所示。利用本发明设计的引物和方法，可以快速鉴定与鸡白痢抗性相关的分子标记，从而可以选育高抗病力的品系。该技术操作简单，准确性高、效果显著，极大地促进了高产鸡自身抗病力的提高，同时也有助于减少抗生素等药物在家禽生产中的使用，在家禽育种领域具有良好的应用前景。

Description

一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记，以及利用该分子标记鉴定鸡白痢抗性鸡的方法。
背景技术
鸡白痢由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum,SP)感染引起，主要侵害2-3周龄以内的幼雏，病死率很高。成年鸡感染后，不出现明显的临床症状但长期带菌，且可水平和垂直传播，对家禽业造成极大的危害。目前在西方发达国家该病已被净化，而我国鸡白痢仍时常发生。除了淘汰感染鸡，仍然没有有效的控制措施。而且目前使用的血清平板凝集试验，经常出现假阳性率高、检测结果不稳定的情况，造成育种群不必要的损失。随着抗生素在畜牧生产中的限制使用，需要新的方法来进行疾病控制。抗病育种是一种可持续的解决办法，其着重于提高鸡本身的抗病力，通过良种扩繁生产，可以迅速提升商品鸡群的抗病力。
单核苷酸多态性标记(SNP)主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、插入和缺失等。SNP的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA芯片、飞行时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜、家禽品种。
全基因组关联分析(GWAS)是目前复杂疾病性状基因定位的重要手段。经过十多年的发展，全基因组关联分析技术在疾病基因的定位上发挥了很大的作用。利用GWAS鉴定与抗病力显著关联的SNP,可以直接应用于分子标记辅助选择，解决抗病育种在实际生产中难以实施的问题。在鸡育种或是种质资源改良过程中，根据SNP进行筛选，这样就可以改变育种过程中难以对抗病力进行选择提高的情况。利用本发明所提供的SNP分子标记，能够准确地将鸡白痢抗性鸡鉴定出来，具有速度快、成本低、准确度高的特点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记及其应用。
本发明的另一个目的是提供用于检测上述标记的引物对及含有该引物对的试剂盒。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记，所述分子标记位于基因组版本galGal5:chr4:33552203，多态性为A/C。
本发明利用高密度SNP芯片对不同鸡种进行基因分型，通过全基因组关联分析，找到与鸡白痢抗性显著相关的SNP位点，并对该SNP位点设计引物进行PCR扩增和测序验证，通过分子生物学技术手段，找到一种分子标记，可以迅速准确将鸡白痢抗性鸡鉴定出来。
具体地，本发明鉴定鸡白痢抗性相关SNP位点的方法，按照以下步骤进行：
1)攻菌试验：选择无鸡白痢病原和抗体的雏鸡818只(包括377洛岛红鸡、364只矮小鸡和77只北京油鸡)，在4日龄经食道注入鸡白痢沙门氏菌4.8×107CFU，饲喂于负压隔离器中。观察记录死亡情况至40日龄。期间进行表型鉴定，统计死亡情况并采集组织样本。
2)芯片杂交：利用Tris酚-氯仿抽提技术提取出鸡基因组DNA，经过DNA质检后，利用Affymetrix鸡600K高密度SNP芯片进行基因分型。
3)SNP数据质控：利用Axiom Analysis Suite 3.1和PLINK v1.90软件对基因型数据进行质量控制，删除一些低质量和低可信度的SNP，选择表型和基因型鉴定准确的个体进行下一步的关联分析。
4)显著SNP的鉴定：利用GEMMA软件中的线性混合模型进行全基因组关联分析，找到与存活性状显著关联的SNP位点，筛选最显著的SNP位点作为选择鸡白痢抗性鸡的分子标记。
本发明还提供了用于检测本发明所述SNP分子标记的特异性引物对，包括：
正向引物：5’-GGAAGGACCAATCAGATGAA-3’；(SEQ ID NO.2)
反向引物：5’-GAACTGTAACCTCTTCTTGTAG-3’(SEQ ID NO.3)。
本发明提供了所述分子标记在鸡育种中的应用。优选地，本发明提供了所述分子标记在抗鸡白痢鸡育种中的应用。
本发明提供的分子标记在鉴定鸡白痢抗性鸡中的应用属于本发明的保护范围。
本发明提供一种鉴定鸡白痢抗性鸡的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡基因组DNA，以其为模板，利用本发明的上述特异性引物对进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；
(2)对扩增产物测序，检测本发明所述分子标记的基因型。
扩增产物中对应基因组版本galGal5:chr4:33552203处的碱基，若为A，待测鸡为鸡白痢抗性鸡，若为C，则待测鸡为鸡白痢易感鸡。
本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行，优选的，可以利用Sanger测序或飞行质谱分型等方法来检测待测上述分子标记的基因型。
在本发明的实施例中，PCR扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示，其第161位对应本申请的SNP位点。
上述鉴定鸡白痢抗性鸡的方法中，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×Taq PCR Mix12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul；扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
本发明提供了含有上述特异性引物对的鉴定鸡白痢抗性鸡的试剂盒。
优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明提供了上述试剂盒在鉴定鸡白痢抗性鸡、或在鸡遗传育种改良中的应用。
本发明所述的特异性引物对还可以与其他用于抗性鸡检测的特异性引物对相结合用于鸡的分类和育种。
本发明具有如下优点：(1)本发明所鉴定的SNP位点具有较高的遗传效应，可以解释11.73％的抗鸡白痢病表型变异。(2)本发明的SNP分子标记可进行准确地鉴定，显著提高育种群的鸡白痢抗性，从而可以选育高抗病力的品系。(3)本发明检测方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。(4)该SNP位点既可以运用于高产鸡的抗病育种，也可为用于地方鸡种质资源改良和疾病控制，从根本上提高鸡对沙门氏菌的抗性，同时也有助于减少抗生素等药物在家禽生产中的使用，在家禽育种领域具有良好的应用前景。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1鸡白痢抗性相关SNP分子标记的鉴定和应用
选择3个遗传背景各不相同的3个品种(洛岛红鸡、矮小鸡和北京油鸡)，利用平板凝集试验检测成年鸡是否鸡白痢阳性，取检测结果阴性的鸡通过人工授精进行配种，构建具有完整系谱记录的试验群体。种蛋孵化后，得到无鸡白痢病原和抗体的雏鸡(包括377只洛岛红鸡、364只矮小鸡和77只北京油鸡)进行后续的试验。
1、抗病表型鉴定：在4日龄经食道注入鸡白痢沙门氏菌4.8×107CFU，所有雏鸡饲喂于负压隔离器中，给予一致的温度、光照等环境条件，自由饮水采食。每天观察记录和剖检雏鸡的发病死亡情况至40日龄。将白色下痢、肝脾肿大而死的雏鸡归类为鸡白痢易感鸡，存活40日龄以上则视为抗性鸡。统计死亡情况并采集每个个体的血液或肌肉组织用于基因组DNA的提取。
2、基因型鉴定：利用Tris酚-氯仿抽提技术提取出鸡基因组DNA，通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度和完整性。对于检测合格的DNA,利用Affymetrix鸡600K高密度SNP芯片进行基因分型。对于芯片数据，使用PLINK软件进行严格的质量控制，删除最小等位基因频率小于0.05和偏离哈代温伯格平衡(P<1×10-5)的SNP位点。使用BEAGLE软件进行对缺失基因型进行填充。
3、全基因组关联分析:在得到表型和基因型之后，本发明使用GEMMA软件进行case-control设计的全基因组关联分析，采用如下线性混合模型：y＝Wα+xβ+u+ε。其中y代表表型(‘0’或‘1’)；W是协变量矩阵；α为相应的系数；x是基因型向量；β代表相应SNP的效应；u是随机多基因效应向量；ε表示随机误差。模型中使用了协变量和遗传关系矩阵来控制群体分层和假阳性结果。
在完成关联分析的运算之后，GEMMA软件会输出每一个SNP标记的统计检验P值。由于GWAS分析进行了多次假设检验，需要对P值进行多重检验校正，提高显著SNP的阈值。经过计算，全基因组显著性阈值为6.88E-7。在排除与其他SNP的连锁不平衡后，本发明选择P值最小的SNP(rs314483802，P＝4.38E-10),即为与鸡白痢抗性相关性最显著的SNP，作为最终可应用于选择育种的分子标记。
经过上述筛选，确定了位于基因组版本galGal5:chr4:33552203，多态性为A/C的SNP标记与鸡白痢的抗性相关，可以解释11.73％的抗鸡白痢病表型变异，即对该标记进行选择，可以减少鸡白痢爆发后雏鸡的死亡率，使鸡群的抗病力提升11.73％。
4、引物设计：根据上一步选择的SNP标记在鸡基因组中的位置和对应的序列，设计并合成引物，引物序列分别为：
F:GGAAGGACCAATCAGATGAA；(SEQ ID NO.2)
R:GAACTGTAACCTCTTCTTGTAG(SEQ ID NO.3)。
5、PCR扩增和检测：PCR扩增总体积25ul。上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul/L；2×Taq PCR Mix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul。
扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用，PCR产物测序。
扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示，其第161位对应本申请的SNP标记。
根据测序结果，可得到SNP分子标记对应的基因型，即可作为选择鸡白痢抗性鸡的依据。
上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于鉴定鸡白痢抗性鸡的分子标记及其应用
<130> KHP191112073.5
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaaggacca atcagatgaa agggaaacag actttcaacc ttaaattcaa tgttttgatc 60
attatatttc cctttgataa taatttggat tcaattttat tgcataatct aattaaggtt 120
caaacacgta gagtacaatt gcatcattgt aaggaaaaaa acaggcaatt ttaattgtaa 180
aaggaagcac tgtgactggt gtgtcaagta gatagatgta agttatcttc ccattgcaaa 240
ttcaacaaca cacagctgga aacaactgca gtactgctgg gtaaatggga gggaaggggc 300
agacgtcttc ccccccctca catcacatgg tagataccag ctgtgctaca agaagaggtt 360
acagttc 367
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaaggacca atcagatgaa 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaactgtaac ctcttcttgt ag 22

Claims (3)

1.一种SNP分子标记在制备鉴定鸡白痢抗性鸡试剂盒中的应用，所述SNP分子标记多态性位点对应于基因组版本galGal5: chr4: 33552203，多态性为A/C。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测鸡基因组DNA，以其为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；
（2）对扩增产物测序，检测分子标记的基因型，所述分子标记位于基因组版本galGal5:chr4: 33552203，多态性为A/C；
扩增产物中对应基因组版本galGal5: chr4: 33552203处的碱基，若为A，待测鸡为鸡白痢抗性鸡，若为C，则待测鸡为鸡白痢易感鸡。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中PCR 扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×Taq PCRMix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100 ng/ul；扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
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