CN104293904A - 一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法，属于分子遗传学技术领域。该检测方法以鸡全基因组DNA为模板，设计引物扩增miRNA-1606前体在内的目的片段，纯化测序后获知鸡miRNA-1606基因第35位存在C或A的碱基多态性；再设计特定引物扩增含多态性位点的基因片段，并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合单引物延伸反应，对大量样本进行单个SNP位点的检测。该检测方法具有准确可靠、通量灵敏、检测时间短、性价比高等特点，可用于鸡的辅助选择和分子育种，对提高鸡的生长性状具有重要的作用。

Description

一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明具体涉及一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒及检测方法，属于分子遗传学技术领域。
背景技术
在畜禽的遗传育种中，应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加畜禽生产性能先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与畜禽经济性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法，然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。鸡作为一种重要的经济禽类，同时也是科研上的一种重要的模式生物，生长性状是评价鸡生产性能的主要指标，是重要的经济性状之一。国内优质地方鸡普遍存在生长速度缓慢的问题，从而影响了经济效益。鸡生长性状是由微效多基因控制的数量性状，由一系列主效基因或数量性状位点决定，多年来，鸡育种工作者通过大量试验研究，力求寻找与鸡生长性状相关的候选基因。
单核苷酸多态（Single nucleotide polymorphism，SNP）多样性与经济性状的关联分析一直是畜禽遗传学研究的热点。SNP是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。miRNA不仅参与了动物复杂性状表型形成的分子调控过程，而且其SNP变化还可能导致miRNA的功能异常，从而引起生物表型性状的变异。miRNA多态性的形成包括插入、缺失、易位、扩增以及碱基替换。研究发现，发生在miRNA初级产物、前体及成熟体上的多态性会潜在的影响miRNA的功能，导致动物的表型性状发生变化。SNP的多态性与经济性状的相关性分析可为家禽分子选种育种方面提供辅助标记选择。
SNPs的检测方法主要包括直接测序、PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术（GenechiPs）和MassARRAY分子量阵列技术。但直接测序技术成本较高，SSCP操作繁琐、耗时长，且实验过程中存在假阴性问题。普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限。基因芯片造价高昂，所需设备贵重，不利于普及应用。MassARRAY分子量阵列技术直接对分子量进行检测，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低，无需再次验证，也无需设计统计学重复，可以适用于对几个到几百个SNP位点的检测，且利用质谱检测在40min内就可以完成对380个样本的检测，并且实时显示检测结果。每天可以完成几千份样本的检测。引物不带荧光标记，国内即可完成普通引物合成。SNPs具有密度高、分布不均、遗传稳定性强、易于自动化分析等特点。随着科技的进步和仪器设备的更新，SNPs的检测方法呈现出自动化、高通量化的趋势。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒。
同时，本发明还提供一种鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，主要包括引物对P2（PCR扩增引物）和引物P3（单碱基延伸引物），
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’（见SEQ ID NO:1），
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’（见SEQ ID NO:2）；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’（见SEQ ID NO:3）。
一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，还可以包括dNTP mix、Hotstar Taq、iPLEX单碱基延伸酶、缓冲液（如10×PCR buffer）、MgCl2、超纯水及iPLEX终止反应Mix等组分，上述组分的浓度和量均可调，便于多次操作使用。
具体的，鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，包括500nM引物对P2480μL、500nM单碱基延伸引物P3480μL、25mM dNTP mix48μL、5U/μL Hotstar Taq48μL、iPLEX单碱基延伸酶19.68μL、10×PCR buffer300μL、25mM MgCl2156μL、超纯水888μL、iPLEX终止反应Mix96μL。更具体的，还包括：1U/μL SAP酶240μL、10×SAP buffer81.6μL。
一种鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，包括以下步骤：
（1）PCR扩增：以鸡全基因组DNA（包含miRNA-1606前体序列/pre-mir-1606）为模板，利用引物对P2进行PCR扩增；
（2）SAP纯化：PCR扩增后，利用碱性磷酸酶消化反应剩余的dNTPs；
（3）单碱基延伸：消化处理后，利用引物P3进行单碱基延伸反应；
（4）样本分析：取步骤（3）处理的样本，利用MALDI-TOF技术进行质谱分析；
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。
所述步骤（1）中PCR扩增的反应体系为：超纯水1.85μL、10×PCR buffer0.625μL、25mM MgCl20.325μL、25mM dNTP mix0.1μL、5U/μL Hotstar Taq0.1μL、500nM Primermix(F Primer/R Primer)1μL、10ng/μL鸡全基因组DNA1μL，总体积5μL。
所述步骤（1）中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃30s，72℃退火60s，72℃延伸5min，45个循环；4℃保存。
所述步骤（2）中消化反应为：在PCR扩增产物中加入1U/μL SAP酶0.5μL、10×SAPbuffer0.17μL和超纯水1.33μL。反应程序为：37℃，40min；85℃，5min；4℃保存。
所述步骤（3）中单碱基延伸反应为：在消化产物中加入超纯水0.755μL、10×PCR buffer0.2μL、反应浓度为1×iPLEX终止反应Mix0.2μL、7μM/14μM单碱基延伸引物0.804μL和反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μL。反应程序为：94℃30s；40个循环：94℃5s，52℃5s和80℃5s×5个内部循环；72℃3min；最后4℃保存。
所述步骤（1）PCR扩增前，还包括miRNA-1606基因突变位点的检测步骤：以鸡全基因组DNA（包含miRNA-1606前体序列/pre-mir-1606）为模板，利用引物对P1（测序）进行PCR扩增（扩增鸡miRNA-1606前体序列在内的片段），取扩增产物电泳获得目的片段，测序判断miRNA-1606基因（pre-mir-1606基因）的突变位点，引物对P1为：
正向引物：5’-ATGGCAGGTAAACATTTGAG-3’（见SEQ ID NO:4），
反向引物：5’-GATTTGCTCAGCCCCAGCTTC-3’（见SEQ ID NO:5）。
所述利用引物对P1进行PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix12μL、10pmol/L的正、反向引物各1μL、100ng/μL DNA模板0.5μL、灭菌超纯水10.5μL，总体积25μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。
本发明的有益效果：
本发明提供的鸡miRNA-1606基因的单核苷酸多态性，利用DNA池测序的方法筛查鸡miRNA-1606基因的多态性位点，结果表明该基因第35位存在C或A的碱基多态性，而且进一步表明该基因与鸡的体重，体尺标和屠体性状显著相关，多态性可作为辅助选择标记及在育种中应用，从而加快良种选育速度和提高种群品质。
本发明提供的鸡miRNA-1606基因的单核苷酸多态性的检测方法，针对其多态性的特性，设计了特定的PCR引物扩增，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）技术结合单引物延伸反应，将处理好的样品利用飞行质谱进行单个SNP位点的检测。通过对核酸片段分子量直接鉴定多态性，能够准确、快速，省时省力的检测单核苷酸的多态性。
本发明中鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法在检测大量的DNA样本时，准确可靠、通量灵敏、检测时间短、性价比高，可广泛推广。同时，本发明利用分型统计结果与鸡的生长和屠体性状进行关联性分析表明：该C或A突变与鸡的生长和屠体性状显著相关，A等位基因有利于鸡的生长发育。
本发明提供了一种在DNA水平上筛查和检测与鸡生长和屠体性状密切相关的分子遗传标记，能够用于鸡的辅助选择和分子育种，对提高鸡的生长和屠体性状具有重要的作用。
附图说明
图1为本发明实施例3中用于测序检测多态性的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2为实施例3中鸡miRNA-1606前体中SNP位点多态性的示意图；
图3为实施例3中PCR克隆筛查到的鸡miRNA-1606第35位C-A突变的SNP多态性测序图谱；
图4为实施例3中鸡miRNA-1606基因第35位C或A多态性的三种基因型质谱峰图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，包括引物对P2（PCR扩增引物）和引物P3（单碱基延伸引物），
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。
实施例2
本实施例中鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，包括500nM引物对P2480μL、500nM单碱基延伸引物P3480μL、25mM dNTP mix48μL、5U/μL Hotstar Taq48μL、iPLEX单碱基延伸酶19.68μL、10×PCR buffer300μL、25mM MgCl2156μL、超纯水888μL、iPLEX终止反应Mix96μL、1U/μL SAP酶240μL、10×SAP buffer81.6μL；
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。
实施例3
本实施例中鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，包括以下步骤：
一、材料准备
动物材料：固始鸡-安卡鸡F2代资源群。
固始鸡是我国著名的优良地方鸡种，属于黄鸡类型，它以固始县为中心，在特殊的生态环境和饲养条件下，经过长期闭锁繁衍而自然形成。固始鸡具有产蛋多、蛋大壳厚、遗传性能稳定等特点，为蛋肉兼用鸡，为我国宝贵的家禽品种资源之一。具有以下突出的优良性状：耐粗饲，抗病力强，适宜野外放牧散养；二是肉质细嫩，肉味鲜美，汤汁醇厚，营养丰富，具有较强的滋补功效；三是母鸡产蛋较多，蛋大，蛋清较稠，蛋黄色深，蛋壳厚，耐贮运。
安卡肉鸡是当今世界优良的肉用鸡种之一，也是目前国内生长速度最快的红黄羽肉鸡，具有适应性强，耐应激，长速快，饲料报酬高等特点。
动物材料的培育：固始鸡-安卡鸡资源群按F2远缘半同胞设计方案组建，试验共建立7个家系，其中正交系4个为安卡鸡♂×固始鸡♀，反交系3个为固始鸡♂×安卡鸡♀。F0代是从蛋肉兼用型固始鸡和肉用型安卡鸡纯系中分别选取种鸡，按公母鸡1:6比例配组而成，要求所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正，以保证F1代个体在各个位点的杂合。从每个家系的F1后代中选留一只公鸡，按公母1:9比例与其他家系母鸡交配产生F2代，要求与配公母鸡之间没有亲缘关系，F1代的种用母鸡也尽量散布在各个家系中，选种时尽量选择外貌表现丰富，呈现杂合的个体，保证F2代性状产生较大分离。该群体共包括F0代42只鸡，F1代70只鸡，F2代860只鸡，资源群体中F2代有完整经济性状的772个个体。
饲养方法为：鸡群饲养于河南农业大学试验鸡场，屠宰试验在河南农业大学家禽遗传改良实验室完成。鸡群饲养期营养水平：0～4周龄能量水平为12.40MJ/kg，蛋白质水平为20.1%；5～8周龄能量水平为12.70MJ/kg，蛋白质水平为18.2%；9～12周龄能量水平为12.75MJ/kg，蛋白质水平16.0%。各家系混群，笼养，自由采食，充足饮水。
二、鸡基因组DNA的提取与检测
1、鸡基因组DNA的提取
以固始鸡-安卡鸡资源群体F2代共772只鸡为材料，每只鸡颈静脉抽血5mL，EDTA抗凝（10mmol/L Tris-Cl，0.2mmol/L EDTA，PH8.0），置-80℃保存。采用酚氯仿抽提法从F2代资源群体血液样本中提取基因组DNA，溶于TE中，4℃保存备用，具体操作步骤如下：
（1）取全血80μL于1.5mL离心管中，加入500μL TE缓冲液，10μL蛋白酶K（10mg/mL），12μL25%的SDS裂解液，振荡10min混匀，55℃水浴过夜；
（2）加入等体积的Tris饱和酚，振荡混匀10min，10,000rpm，离心10min；
（3）取上清，再加入等体积Tris饱和酚，振荡混匀10min，10,000rpm，离心10min；
（4）取上清，等体积加入酚/氯仿/异戊醇混合溶液（25:24:1）振荡混匀，10,000rpm，离心10min；
（5）取上清，加等体积酚/氯仿混合溶液（24:1）振荡混匀，10,000rpm，离心10min；
（6）取上清，加入2倍体积预冷至-20℃的无水乙醇，微振荡，10,000rpm离心10min；
（7）弃上清，加入500μL70%乙醇清洗沉淀，倒置室温下风干，加入适量的TE（pH8.0）溶解DNA，4℃保存直至DNA完全溶解，1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。
2、分光光度法检测基因组DNA浓度
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm和280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度的计算公式如式（1）所示：
DNA（ng）=50×OD260值×稀释倍数   （1）
DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至100ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。
三、鸡miRNA-1606基因多态性的检测
1、鸡miRNA-1606基因突变位点的检测
（1）DNA池的构建
随机选取100个浓度为100ng/μL DNA样品，分别取0.5μL DNA混合构建成DNA池。
（2）扩增引物设计
以鸡miRNA-1606基因在Genbank中的基因组序列的同源保守区序列为参考（登录号：MI0007333），用oligo设计鸡miRNA-1606的测序PCR引物P1，扩增片段总长度为332bp（野生型见SEQ ID NO:6，突变型见SEQ ID NO:7），用于测序检测多态性的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱如图1所示（图中M为Marker DNA，1-8均为样品的扩增片段）。
测序PCR引物P1为：
正向引物：5’-ATGGCAGGTAAACATTTGAG-3’，
反向引物：5’-GATTTGCTCAGCCCCAGCTTC-3’。
（3）PCR克隆鸡的miRNA-1606的DNA序列
以DNA池为模版，用测序PCR引物对P1进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为25μL（见表1）。
表1 PCR反应体系
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。
（4）PCR产物测序
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化。在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，具体操作按照试剂盒说明书进行。
将PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行测序。将测序峰图进行分析和序列比对，如图2（图中阴影部分表示引物，下划线部分表示miRNA-1606前体序列，方框表示突变碱基）和图3（图中阴影表示为突变位点）所示，在miRNA-1606基因前体第35位存在C>A多态性。
2、质谱分析样本的准备
（1）PCR扩增
根据测序结果获取SNP位点及其前后78bp的序列，将260/280在1.8-2.0之间的720个基因组DNA浓度调整到20ng/μL，体积在20μL，以包含miRNA-1606基因的鸡全基因组DNA为模板，利用引物对P2进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为5μL（见表2）；
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’。
表2 PCR反应体系
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃30s，72℃退火60s，72℃延伸5min，45个循环；4℃保存。
（2）SAP纯化
PCR扩增后，利用碱性磷酸酶消化反应剩余的dNTPs，在步骤（1）PCR扩增产物中加入1U/μl SAP酶0.5μL、10×SAP buffer0.17μL和超纯水1.33μL；反应程序为：37℃，40min；85℃，5min；4℃保存。
（3）单碱基延伸
消化处理后，利用引物P3进行单碱基延伸反应，在步骤（2）消化产物中加入超纯水0.755μL、10×PCR buffer0.2μL、反应浓度为1×iPLEX终止反应Mix0.2μL、7μM/14μM单碱基延伸引物0.804μL和反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μL，反应程序为：94℃30s，40个循环：94℃5s，52℃5s和80℃5s×5个内部循环，72℃3min；最后4℃保存。
（4）鸡miRNA-1606基因第35位点多态性的质谱分型
将步骤（3）处理的样本分析物加到芯片上，与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒（10-9s）强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照miRNA-1606基因第35位存在的C>A多态性质荷比率的差异得以分离，在真空小管中飞行到达检测器。根据平台自带的软件自动生成SNP分型结果，分别为CC、CA和AA三种基因型，如图4所示，图a、b、c分别AA基因型、CC基因型和CA基因型的质谱峰图。
（5）鸡miRNA-1606基因的第35位点的多态性频率统计分析
等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率，取值在0-1之间，
如式（2）所示：
Pi＝[2（ii）＋（ij1）＋（ij2）＋………＋（ijn）]/2N （2）
式中，Pi：第i个等位基因频率；
i：为纯合复等位基因；
j1、j2、………jn：与i共显的第1到第n个等位基因。
基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的相对比率，如式（3）所示。
基因型频率＝基因型个体数/测定群体总数 （3）
对F2资源群体中miRNA-1606的位点C>A的基因型频率统计分析结果见表2。表2结果显示，在F2资源群体中179只为CC基因型，371只为CA基因型，170只为AA基因型。CC、CA和AA基因型频率分别为0.249、0.515和0.236。C和A等位基因的频率分别为0.506和0.494（见表3）。
表3 miRNA-1606基因在F2代资源群中基因型频率和基因频率
（6）鸡miRNA-1606基因前体第35位的多态性与鸡生长性状的关联分析
关联分析模型：利用SPSS（19.0）软件分析基因位点与体重，体尺标及屠体性状的相关性。确保每个性状数据呈正态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应和benferroni多重比较法比较各基因型间的差异，结果见表4和表5。模型I为该位点多态与生长性状的关联分析模型，模型II为该多态位点与屠体性状的关联分析模型，具体见式（3）、（4）。
Model I：yijklm=μ+Gi+Sj+Hk+fl+eijklm   （3）
Model II：yijklm=μ+Gi+Sj+Hk+fl+b(Wijklm-W)+eijklm   （4）
式中：yijklm为个体表型值；μ为总体均值；Gi为基因型固定效应；Sj为性别效应；Hk为批次效应；fl为家系效应作为随机效应；b为屠宰重的回归系数；Wijklm为个体屠宰重；W为群体平均体重，eijklmn为随机误差。
表4 miRNA-1606多态位点C>A突变与鸡生长性状之间的方差分析
注：同行之间相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同
的大写字母表示差异极显著（P<0.01）。
由表3可知，miRNA-1606前体第35位C>A突变位点与8周龄体重、10周龄体重和12周龄体重显著关联，并且均表现为AA型和CA型个体的体重均高于CC型个体所对应的体重，且AA和CA型之间差异不显著。结果表明A等位基因有利于鸡体重的增加，C等位基因不利于鸡的体重增加。鸡miRNA-1606基因第35位的单核苷酸多态性中的AA基因型作为鸡体重性状的标记辅助选择育种中提高鸡体重的分子遗传标记。
表5 miRNA-1606多态位点C>A突变与鸡体尺性状之间的方差分析
注：同行之间相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同的
大写字母表示差异极显著（P<0.01）。
由表4可知，miRNA-1606多态位点C>A突变与不同周龄的体尺指标显著关联，并且几乎均表现为AA型和CA型个体的体尺指数高于CC型个体，AA型个体体尺指数低于CA型个体。表明A等位基因有利于鸡体型的形成。鸡miRNA-1606基因第35位的单核苷酸多态性中的AA基因型作为鸡体尺指标的标记辅助选择育种中改善鸡体型的分子遗传标记。

Claims (10)

1.一种鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：主要包括引物对P2和引物P3，
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。
2.根据权利要求1所述的鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：还包括dNTP mix、Hotstar Taq、iPLEX单碱基延伸酶、缓冲液、MgCl2及iPLEX终止反应Mix。
3.根据权利要求2所述的鸡miRNA-1606基因多态性检测试剂盒，其特征在于：包括500nM引物对P2480μL、500nM单碱基延伸引物P3480μL、25mM dNTP mix48μL、5U/μLHotstar Taq48μL、iPLEX单碱基延伸酶19.68μL、10×PCR buffer300μL、25mM MgCl2156μL、超纯水888μL、iPLEX终止反应Mix96μL、1U/μL SAP酶240μL、10×SAP buffer81.6μL。
4.一种鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）PCR扩增：以鸡全基因组DNA为模板，利用引物对P2进行PCR扩增；
（2）SAP纯化：PCR扩增后，利用碱性磷酸酶消化反应剩余的dNTPs；
（3）单碱基延伸：消化处理后，利用引物P3进行单碱基延伸反应；
（4）样本分析：取步骤（3）处理的样本，利用MALDI-TOF技术进行质谱分析；
引物对P2为：
F Primer：5’-ACGTTGGATGAACAAGCAGCGTGAATGGTC-3’，
R Primer：5’-ACGTTGGATGTTCAGGACTGTTCTGTTGCC-3’；
引物P3为：5’-GTTGCCCCCTCTTTCAGT-3’。
5.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR扩增的反应体系为：超纯水1.85μL、10×PCR buffer0.625μL、25mM MgCl20.325μL、25mM dNTP0.1μL、5U/μL Hotstar Taq0.1μL、500nM Primer mix1μL、10ng/μL鸡全基因组DNA1μL，总体积5μL。
6.根据权利要求5所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃30s，72℃退火60s，72℃延伸5min，45个循环；4℃保存。
7.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中消化反应为：在PCR扩增产物中加入1U/μL SAP酶0.3μL、10×SAP buffer0.17μL和超纯水1.53μL；反应程序为：37℃，40min；85℃，5min；4℃保存。
8.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中单碱基延伸反应为：在消化产物中加入超纯水0.755μL、10×iPLEX buffer0.2μL、反应浓度为1×终止反应iPLEX Mix0.2μL、7μM/14μM单碱基延伸引物0.804μL和反应浓度为1×iPLEX单碱基延伸酶0.041μL；反应程序为：94℃30s，40个循环：94℃5s，52℃5s和80℃5s×5个内部循环，72℃3min；最后4℃保存。
9.根据权利要求4所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）PCR扩增前，还包括miRNA-1606基因突变位点的检测步骤：以鸡全基因组DNA为模板，利用引物对P1进行PCR扩增，取扩增产物电泳获得目的片段，测序判断miRNA-1606基因的突变位点，引物对P1为：
正向引物：5’-ATGGCAGGTAAACATTTGAG-3’，
反向引物：5’-GATTTGCTCAGCCCCAGCTTC-3’。
10.根据权利要求9所述的鸡miRNA-1606基因多态性的检测方法，其特征在于：所述利用引物对P1进行PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix12μL、10pmol/L的正、反向引物各1μL、100ng/μL DNA模板0.5μL、灭菌超纯水10.5μL，总体积25μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。
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