CN106381331B - 草鱼生长速度相关的snp标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过对NPY基因部分片段进行扩增，通过SNaPshot SNP分型方法，提供一种草鱼生长速度相关的SNP标记，其中，S1位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子(ATG，以ATG的第一个核苷酸为第一位)起第639位，且该位置处碱基为T或A；S2位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子起第892位，且该位置处碱基为C或A。这两个SNP位点可用于鉴定或选育生长速度较快的草鱼，为筛选和建立草鱼快长新品系奠定基础。

Description

草鱼生长速度相关的SNP标记及其应用
【技术领域】
本发明属于动物分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种草鱼生长速度相关的SNP标记、用于检测SNP单倍型的序列、引物对及该SNP标记在辅助草鱼快长品系的选育工作中的应用。
【背景技术】
草鱼(Ctenopharyngodon idella)属雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、草鱼属(Ctenopharyngodon)，是我国淡水养殖鱼类中年产量最大的养殖对象，因草鱼生长速度快，肉质鲜美，深受人们喜爱。目前养殖草鱼还有一定的效益空间，但从生产支出看，2008年以来饲料成本不断上涨，饲料成本占了草鱼养殖的70％以上成本。近年来，草鱼亲鱼遗传背景不清、近亲繁殖导致草鱼出现种质退化的现象，草鱼在繁殖过程中多采用对挑选的亲鱼进行人工催产后放入产卵池让其自然交配产卵，在这种繁殖过程中虽然在一定程度上减少了草鱼后代遗传多样性的降低，对草鱼遗传多样性的保护有一定的积极意义。但是这种繁殖方式往往也要根据生产上的需要，繁殖过程中产池中的亲鱼从1组到30组不等(1组为1尾雌鱼和1尾雄鱼)，这种模式亲鱼与亲鱼之间交配繁殖是随机的，由于亲本遗传信息不清，往往会导致近亲繁殖和亲本质量较差的在一起繁殖，这样繁殖出的草鱼鱼苗质量没有保障，往往导致成活率低，生长缓慢等。
选育出生长速度更快的草鱼新品种可以节约饲料成本，缩短养殖周期进而大幅度降低草鱼养殖成本，因此，开发快速可靠的育种技术，进行草鱼快长品种(系)的培育十分必要。在开展常规选育研究的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可加快草鱼良种选育进程。SNP是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸变异而产生的多态性，位于基因编码区的非同义SNP可导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SNP尤其重要，最终引起生物表型的变化。此外，在SNP标记研究和应用中发现，基因组上相邻SNPs的等位位点倾向以整体形式遗传给后代，这种一组相关联的SNPs等位位点被称作单倍型(haplotype)。为了更有效的鉴定与性状密切相关的分子标记，必须对整个基因序列上的SNPs所构成的单倍型进行关联分析。
神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一种含36个氨基酸残基的神经递质，其结构与Y肽(PYY)和胰多肽(PP)相近，因此被归为胰多肽家族。广泛分布于哺乳动物的中枢和周围神经系统及组织、器官，与许多部位的神经元中其他神经递质共存，如去甲肾上腺素，也可以由非神经元细胞合成及释放。NPY参与体内多种生理调节过程，对脊椎动物的摄食起到重要的促进作用，NPY对能量代谢有重要的调节作用，其主要生物学功能还包括对食物摄取、血压、激素分泌、生长发育、调节体温、生物节律、性行为等生理过程的调节作用。
SNaPshot SNP分型是一种以单碱基延伸原理为基础，同时利用多重PCR对多个已知SNP位点进行遗传分型的方法。在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI3730测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。
【发明内容】
本发明通过对NPY基因部分片段进行扩增，通过SNaPshot SNP分型方法，提供一种草鱼生长速度相关的SNP标记，并用于鉴定或选育生长速度较快的草鱼，为筛选和建立草鱼快长新品系奠定基础。
本发明的具体技术方案如下：
一种草鱼生长速度相关的SNP标记，包括两个SNP位点S1和S2，所述S1位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子(ATG，以ATG的第一个核苷酸为第一位)起第639位，且该位置处碱基为T或A；所述S2位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子起第892位，且该位置处碱基为C或A；所述NPY基因的内含子1序列如SEQ ID NO：1所示，其中，SEQ ID NO：1的核苷酸序列如下：
CTGTCTGGAATGACTGGAAATACTGTGGTTACATTGCCAAATAATCCATGCAAAGTTATCAACAGAGCACACATACAATCCAAAATCCCTTATTCTAACTCTTTTATCCTATGGTTTGAGCACAATGGCCATGTTTTTTTAGCTCCAGCAAAACTAATGCATTTTGACCCAGTTTCATATCATGCCTGAATCAATCAAATGCTTTCCATTTCCTCTCCATTTCAAGGTGTTTTTTTTAATCATCATTTCATCTCCAAAAAGACGCATCCTTGTATGCATATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTTATTTTTTTTGGAGGGTGGGGGGGTCCATTTTACTTCATTATTTTTGCTGAGGGAATCATTGAAGGGAAAAAATCACTTTCTCTAATGTTTCTCCTGCTTTTCAGATTTTACATTTGAGAAAAAGACCTCAGTAATACATTGTCTTCTCGAACAATGTCTCGCACTGTTCTCGGATATTACAAAATACCAAGTCTGCTATCAAAAGTCAGATTTTTGTATAGATTTTTAATATGAGCTGAAACATTTTTCTTAAAATTTATCCAAAGGTTAAGCTATCCACATTTATTTTATAACTTTCTTGCTCATATTGTATGTTGACACTTGTCTCGTTTGTGTCTATTTTTTCTTTTATAATTTTAAGGGGAAACATAAACAAATGGGACAAATGCTTCATTGAAACAATACCGAGTTATGAAAGAGCAATAAAGCTTTCCTCTGGCTTTATATACATAAATATCATGCAATATATCATGATAATCATAAAATGGCTCTTTGTTTGCTCTATAGGATAAATGAAACCTTGCCTATCAGGTTCAGCATATGTGTAGGTAGATATCAAGATGACATTTTTAGTAAAGAACACCAGAACAACCTAAGAAGTTTAAAAGGTGAATCAGGTGGACAAAACTGGCAGTTTCAGATGATGACTCGAACCTCTTGTGTTTAGTGCAAAATAACGTCCCTAAATAACCTCCCACGCATTCAAATGAGGACCAAACAAGCGCGTTTTAAAGCAGTGATGACAGAGGATTTAATCCGTGACGCGGGCTCGCGCGCATCAAAAGAGTCGCGCGCAATTGCGCGTGGGCTCCTCTCTTTATGGCACGAGCCATACAAGTATAAAACCAGGCGACGCACGACTCAGATTGCAGAAAATTGGAGAAGTCGAGACCCACCGAGCAAGAAGGGCAATCAAGACCTCATTCAAGGAAGTGTAAGTGCATGATTTATATTATGCTTTTACGTTATATGGAAGCTTTATTTTATTAAAAGTTTTATTTCTTTTAGAAAGTAATGAAATTTAGTTGTTGTTAAATATCTTTATTAGGTTAGTATTATTAAATATCAAGTGTTATGATACAATAACTAGTTTAATACAGACCACAATCCAGCCCAAGCATCTTCTGGATGTGTTAAGATTTGTGATTATTACTTTTTAGAACATTATATTACGTATTAGCACAAATACTTTTGCTTTGTTTTATCTCAGATGCATCCAAACATGAAAATGTGGATCGGTTGGGCAGCGTGTGCCTTCCTCTTGTTCGCCTGCTTGGGAACTCTTACGGAAGGGTATCCAACAAAACCCGACAACCCGGGAGAGGACGCACCTGCGGAGGAGCTCGCCAAGTACTATTCTGCGCTAAGACACTACATCAACCTAATAACAAGGCAGAGGTAAGCTCCTCTTTATTTCTATACTCTTTAAAAGAATTGATAGAATTGTTTCAAATTCTAGCTCGAGTTTTTCCTTTTCTTTCTTTTCACATTATTTACTCTCAATTTATTATCGACAAAAGTTTATCTTTAGCCTGTTTCTGCAGTTTTAGCGGTTTAAAAACACCAAAATGGGCTCGAAAGCAACTGGGGACTGGAAAACTATAGTCCAGTTTTTTCACTGTAATAATCCGCAGATGAAACCCCGCTGACTCTCTAATTGAGTGCGCACTACACAGCGCTTTAAATGTGTTTCTTTGCTGTGTTATAACAGCGGGATGTGGTTTTGTAGCTACTTACAAAAATTCATTGCTGAATGCCCTTTCTTAATTATTGACGAGACGAAATAAACAGTTTTGACAGCGAGCAAAGTATCAAAAAGAAATACTAAGGAACTGTTACAAATGAGCTTAAATTCCTCCGCATTACTAAAGTATTTTCCCTTCCGCCTAGAGAAAAAGGGAGAATAGATTAGACTACAAGTGGAAATGGAAATGATGCACTTCATTCAAAGCGTATCCTCGTCTAGGACTTGTGGGAAACAAGTGAAAATGGACATTGGGATCTATGTGATCTACGGTGGGGTCAGGGATATATATTGTATGGTAGGCTAAGAAGTCTCGAAGTAGACTAAGTTAATGTTTAACAAACGTTTGAGGGGGCGCCAAAAGACAAAATTATTTTACAAAAGTTGACTCCACTTATAAGTACTGTATAATACCTACATTGGTGTGATTTTGAGGTCTTTGTTCTGTTTGACAGGTATGGCAAAAGGTCCAGCGCTGACACCTTAATATCAGACCTTCTGATTGGTGAAACAGAGTCCCACCCCCAGACCAGATAAGGTTTATAAACTGATATTAGACAGCTTATAACTGATTGATTATTCATTTATAACAATATTACAGTCAGTGTTTTATTCACTATTCTTAACATCAGTTGGAACAGTGAGCACTTTATTATGTAGAAAGTTTTTAAGTTAAGACGTTAAGAATTTATGGCTGTTTATCCACAGATATGAGGACCATTTGGTGTGGTGATCTCAGCAATTGTGTTTACGCAGTCATGTCCATGTGTCATCCTGTTATACAGTCACCAAATCTCATCAAATTGAAATCTTCTGTATCATCAAGATCAACAACTTGCTGTGAAGTACCACAGCCATAATCAGGATAGTGAAAACACTGCAGAACATTCAAATAACACATCAAATCCTTATGTCTGTACATGTCTATGTGAAATGCATACATATGGTTGCACTGGATATGGCCTTGTTGACGCGTGCTGTCTCTGGACTCACCGAAGGTCAATCAGCTGTTCAACAAGACAATTGTACAGAGACTTACTGTGTGTATTTGTGTTGTGTCCATTGTAAACCCAAATATCAAAAGAGAACATTA
发明人发现，S1和S2两个SNP位点在所测群体中检测到四种单倍型：ATAC、AAAA、TTCC和ATAA，分别命名为D1，D2、D3和D4，发现单倍型为D1(ATAC)和D2(AAAA)的草鱼体质量显著高于D3(TTCC)和D4(ATAA)草鱼。进而，通过检测草鱼的上述SNP标记的单倍型，能够在相同养殖条件下有效挑选体生长速度较快的草鱼，进一步的，本发明的SNP标记能够用于快长类草鱼的分子标记辅助育种，进而能够根据实际育种需求对草鱼亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼后代(鱼苗)，对快长草鱼苗种生产有积极意义，并可以大大节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快草鱼育种进程。
本发明的另一目的是提供用于扩增上述两个SNP位点S1和S2所在基因片段的引物对，所述引物对具有SEQ ID No：2-3所示的核苷酸序列，其具体序列如下：
SEQ ID No：2(上游引物)：AACAGTTTTGACAGCGAGCA
SEQ ID No：3(下游引物)：GCTGGACCTTTTGCCATACC
本发明的另一目的是提供用于检测上述两个SNP位点S1和S2单倍型的2条延伸引物，其中，用于检测S1位点的引物具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，用于检测S2位点的引物具有SEQ ID No：5所示的核苷酸序列：
SEQ ID No：4(检测S1的延伸引物)：TTTTTTTTAAGGAACTGTTACAAATGAGCT
SEQ ID No：5(检测S2的延伸引物)：TTTTTTTTTTTTTTTAACAAACGTTTGAGGGGGCG
本发明的另一目的是提供一种利用SNP位点鉴定草鱼生长性能的方法，具体包括以下步骤：
(1)提取样品DNA，贮存备用；
(2)PCR扩增反应：利用上述具有SEQ ID No：2-3所示核苷酸序列的引物对，对待测草鱼DNA进行PCR扩增，获取含有S1位点和S2位点的目标片段；
(3)凝胶检测和纯化：将步骤(2)获得的扩增产物用1％的琼脂糖凝胶(120V，30min)，琼脂糖凝胶在紫外灯下显色，检测到432bp单条谱带，即用ExoI和Sap对PCR产物进行纯化；
(4)延伸反应：利用上述具有SEQ ID No：4-5所示核苷酸序列延伸引物，对纯化后的PCR产物进行延伸反应；
(5)分型判定：延伸反应结束后，取1uL延伸产物，加8uL上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴，测序仪型号为ABI 3730XL，进行SNaPshot分型，根据测序结果峰图的颜色可判断所测个体的单倍型，若为D1(ATAC)和D2(AAAA)，则判定该样品为快长型草鱼，若为D3(TTCC)和D4(ATAA)，则判定该样品为普通草鱼。
上述利用SNP位点鉴定草鱼生长性能的方法，步骤(1)中，提取样品DNA的方法具体包括以下步骤：
(A)取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时；
(B)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；
(C)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；
(D)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。
上述利用SNP位点鉴定草鱼生长性能的方法，步骤(2)中，PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
上述利用SNP位点鉴定草鱼生长性能的方法，步骤(3)中，PCR产物纯化的条件为：PCR产物3uL，ExoI 0.2uL，Sap 0.2uL，ExoI buffer 0.7uL，加H2O补至7uL；37℃45min，80℃15min。
上述利用SNP位点鉴定草鱼生长性能的方法，步骤(4)中，延伸反应体系为：纯化后的PCR产物2uL，SNaPshot Mix试剂1uL，延伸引物混合2uL，加水补至6uL；反应条件为：96℃1min，96℃10s，52℃5s，30cycles，60℃30s。
本发明的优点及应用效果：
本发明利用分子遗传学及分子生物学的方法获得一个草鱼体生长速度相关的SNP标记，由于本发明所获得的单倍型是依据NPY基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。利用该标记的单倍型可以简单快速的鉴定快长草鱼，也可用于指导选育快长草鱼新品系。
【附图说明】
图1为NPY基因片段中检测到的SNP位点，其中，a为S1(T+639A)位点，b为S2(C+892A)位点；
图2为SEQ ID No：2-3所示核苷酸序列引物对的扩增产物凝胶电泳图；
图3为待测草鱼个体a、b、c三个个体的SnaPshot分型检测峰图。
【具体实施方式】
为了验证本发明的应用效果，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1
一、SNP位点的筛选
选取不同来源的的草鱼群体样本4个，分别为：西江群体(XJ)样本于2005年取自珠江水系西江江段，宁乡群体(NX)样本于2004年取自长江支流湘江江段，沅江群体(YJ)于2004年取自长江支流沅江江段，洪湖群体(HH)样本于2004年取自长江主流湖泊洪湖。长江水系和珠江水系样本都是从江或湖里捕捞的野生小草鱼，养殖到(13.0±2.0)kg后取鳍条组织用无水乙醇固定，-20℃保存于珠江水产研究所。每个群体取5个个体共20个个体用于NPY基因的SNP筛选。通过对样品的NPY基因序列进行比对，如图1所示，发现2个SNP位点S1和S2，其中，S1位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子(ATG，以ATG的第一个核苷酸为第一位)起第639位，且该位置处碱基为T或A；S2位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子起第892位，且该位置处碱基为C或A；所述NPY基因的内含子1序列如SEQ ID NO：1所示。
二、单倍型的测定
1、样品处理和DNA提取：
从现有的珠江水产研究所良种基地同塘养殖的草鱼混合家系群体中随机挑选商品规格298尾，平均体质量为1460.95g，用MS-222麻醉后测量体质量，剪鳍条保存于无水乙醇中。
取上述待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。
加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。
加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。
用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。
2、PCR扩增反应：
利用具有SEQ ID No：2-3所示核苷酸序列的引物对，对待测草鱼DNA进行PCR扩增，获取含有S1位点和S2位点的目标片段，扩增产物的大小为423bp。其中，PCR反应体系为：DNA1uL，10×buffer 1.5uL，MgCl2(25mM)1.5uL，dNTP(10mM)0.3uL，引物混合(10P)0.15uL，Taq(5U/uL)0.3uL，加H2O补至15uL；PCR反应条件为：95℃3min，94℃15s，60℃15s，-0.5℃/Cycles 11cycles，72℃30s，94℃15s，54℃15s，24cycles，72℃30s，72℃3min；所述引物对对应的DNA片段的位置如下：
GTGGTTTTGTAGCTACTTACAAAAATTCATTGCTGAATGCCCTTTCTTAATTATTGACGA
上游引物：AACAGTTTTGACAGCGAGCA
GACGAAATAAACAGTTTTGACAGCGAGCAAAGTATCAAAAAGAAATACTAAGGAACTGTTACAAATGAGCTXAAATTCCTCCGCATTACTAAAGTATTTTCCCTTCCGCCTAGAGAAAAAGGGAGAATAGATTAGACTACAAGTGGAAATGGAAATGATGCACTTCATTCAAAGCGTATCCTCGTCTAGGACTTGTGGGAAACAAGTGAAAATGGACATTGGGATCTATGTGATCTACGGTGGGGTCAGGGATATATATTGTATGGTAGGCTAAGAAGTCTCGAAGTAGACTAAGTTAATGTTTAACAAACGTTTGAGGGGGCGYCAAAAGACAAAATTATTTTACAAAAGTTGACTCCACTTATAAGTACTGTATAATACCTACATTGGTGTGATTTTGAGGTCTTTGTTC
下游引物：CCATACCGTTTTCCAGGTCG
TGTTTGACAGGTATGGCAAAAGGTCCAGCGCTGACACCTTAATATCAGACCTTCTGATTGGTGAAACAGAGTCCCACCCCCAGACCAGATAAGGTTTATAAACTGATATTAGACAGC
注：XY分别为两个SNP标记位点S1，S2，X处的碱基为T或A，Y处的碱基为C或A。
3、凝胶检测和纯化：
将步骤(2)获得的扩增产物用1％的琼脂糖凝胶(120V，30min)，琼脂糖凝胶在紫外灯下显色，如图2所示，检测到432bp单条谱带，即用ExoI和Sap对PCR产物进行纯化。其中，PCR产物纯化的条件为：PCR产物3uL，ExoI 0.2uL，Sap 0.2uL，ExoI buffer 0.7uL，加H2O补至7uL；37℃45min，80℃15min。
4、延伸反应：利用具有SEQ ID No：4-5所示核苷酸序列延伸引物，对纯化后的PCR产物进行延伸反应。其中，延伸反应体系为：纯化后的PCR产物2uL，SNaPshot Mix试剂1uL，延伸引物混合2uL，加水补至6uL；反应条件为：96℃1min，96℃10s，52℃5s，30cycles，60℃30s。
(5)分型判定：延伸反应结束后，取1uL延伸产物，加8uL上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴，测序仪型号为ABI 3730XL，进行SNaPshot分型，根据测序结果峰图的颜色可判断所测个体的单倍型，若为D1(ATAC)和D2(AAAA)，则判定该样品为快长型草鱼，若为D3(TTCC)和D4(ATAA)，则判定该样品为普通草鱼。
如图3所示，a、b、c分别为其中3个个体的SnaPshot分型后的结果，在每个个体中，前面的峰代表S1(T+639A)位点的峰图，后面的峰代表S2(C+892A)位点的峰图，峰图的颜色及对应核苷酸分别为：绿色—A，红色—T，黑色—C，蓝色—G，因此，可以判定个体a的单倍型为D2(AAAA)，个体b的单倍型为D1(ATAC)，个体c的单倍型为D3(TTCC)，即判定个体a和b为快长型草鱼。
三、单倍型与草鱼生长速度之间的关联分析和验证
按照上述“二、基因型测定”的方法，得到所测的298个草鱼个体的单倍型，包括D1(ATAC)、D2(AAAA)、D3(TTCC)和D4(ATAA)四种单倍型，利用Popgene(Version3.2)分析处理等位基因频率(等位基因频率＝等位基因的样本数/总样本数)，具体分布结果见表1：
表1单倍型在草鱼群体中的频率
利用SPSS17.0软件一般线性模型(General Linear Model，GLM)，分析SNP位点的不同基因型与草鱼主要生长性状(体质量)进行关联分析，NPY的4个单倍型与草鱼群体的关联分析结果见表2。
表2：草鱼NPY基因2个位点不同基因型与草鱼群体体质量的关联分析
注：同一列数值中，肩标含相同字母者表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)，不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)。
由表2可知，不同基因型草鱼在体质量上存在差异显著(P<0.05)，基因型D1的体质量显著大于D3型和D4型(P<0.05)，D1型的增重率分别比D3型和D4型快27.08％和36.03％，基因型D2的体质量显著大于D3型和D4型(P<0.05)，D2型的增重率分别比D3型和D4型快24.43％和33.19％，D1型和D2型之间无显著差异(P>0.05)，D3型和D4型之间无显著差异(P>0.05)，说明D1和D2单倍型的草鱼生长速度较快，与预期一致。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.用于扩增草鱼生长速度相关的SNP标记位点S1和S2所在基因片段的引物对，其特征在于，所述S1位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子起第639位，且该位置处碱基为T或A；所述S2位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子起第892位，且该位置处碱基为C或A；所述NPY基因的内含子1序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo：2-3所示。
2.用于扩增草鱼生长速度相关的SNP标记位点S1和S2单倍型的延伸引物，其特征在于，所述S1位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子起第639位，且该位置处碱基为T或A；所述S2位于NPY基因的内含子1序列中自起始密码子起第892位，且该位置处碱基为C或A；所述NPY基因的内含子1序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测S1位点的引物的核苷酸序列如SEQID No：4所示，用于检测S2位点的引物的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
3.一种利用SNP位点鉴定草鱼生长性能的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)提取样品DNA，贮存备用；
(2)PCR扩增反应：利用如SEQ ID No：2-3所示核苷酸序列的引物对，对待测草鱼DNA进行PCR扩增，获取含有S1位点和S2位点的目标片段；
(3)凝胶检测和纯化：将步骤(2)获得的扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳电压120V，电泳时间30min，琼脂糖凝胶在紫外灯下显色，检测到432bp单条谱带，即用ExoI和Sap对PCR产物进行纯化；
(4)延伸反应：利用如SEQ ID No：4-5所示核苷酸序列延伸引物，对纯化后的PCR产物进行延伸反应；
(5)分型判定：延伸反应结束后，取1uL延伸产物，加8uL上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴，测序仪型号为ABI 3730XL，进行SNaPshot分型，根据测序结果峰图的颜色可判断所测个体的单倍型，若为ATAC和AAAA，则判定该样品为快长型草鱼，若为TTCC和ATAA，则判定该样品为普通草鱼。
4.根据权利要求3所述的鉴定草鱼生长性能的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取样品DNA的方法具体包括以下步骤：
(A)取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时，裂解液包含10mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L EDTA、0.5％SDS、30mg/L RNase、100mg/L蛋白酶K，裂解液的pH为8.0；
(B)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，其中，酚/氯仿/异戊醇混合物中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25：24：1；
(C)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；
(D)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μlTE溶解DNA，4℃贮存备用，所述TE包含10mmol/L Tris－HCl、1mmol/L EDTA，TE的pH为8.0。
5.根据权利要求3所述的鉴定草鱼生长性能的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系为：
DNA 1uL
10×buffer 1.5uL
MgCl2 1.5uL,浓度25mM
dNTP 0.3uL，浓度10mM
引物混合0.15uL，浓度10P
Taq 0.3uL，浓度5U/uL
H2O补至15uL
PCR反应条件为：
95℃ 3min
94℃ 15s
60℃ 15s -0.5℃/Cycles 11cycles
72℃ 30s
94℃ 15s
54℃ 15s 24cycles
72℃ 30s
72℃ 3min。
6.根据权利要求3所述的鉴定草鱼生长性能的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR产物纯化的条件为：PCR产物3uL，ExoI 0.2uL，Sap 0.2uL，ExoI buffer 0.7uL，加H2O补至7uL；37℃45min，80℃15min。
7.根据权利要求3所述的鉴定草鱼生长性能的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，延伸反应体系为：纯化后的PCR产物2uL，SNaPshot Mix试剂1uL，延伸引物混合2uL，加水补至6uL；反应条件为：96℃1min，96℃10s，52℃5s，30cycles，60℃30s。
8.权利要求1所述的引物对在鉴别或选育快长型草鱼品种中的应用。
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