CN103798169B - 一种快速建立yy超雄黄颡鱼改良繁育系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法，主要步骤为：筛选黄颡鱼野生雄性亲本、黄颡鱼野生亲本种质资源评估、通过与现有YY♀交配构建YY♂和YY♀基础育种群体、YY♂和YY♀基础育种群体的选育、YY♂和YY♀的测交验证、YY♂超雄黄颡鱼改良繁育系的快速扩群以及YY♂超雄黄颡鱼改良繁育系的建立，重复最后一步，即可建立成所述改良繁育系。本发明的方法增加了超雄鱼的遗传多样性，提高了受精率、孵化率与存活率，同时可以缩短育种时间，更可以批量进行，规模化生产性状改良的YY♂超雄鱼和XY全雄鱼，大大提高产量，增加经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类养殖新品种改良及鱼类生理遗传繁殖技术领域，是以传统群体选育、微卫星标记、人工性逆转、鱼类性别特异性分子标记PCR检测和测交验证等集成技术，提高全雄黄颡鱼生产性能的控制鱼类性别及品系改良，一种快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法。
背景技术
黄颡鱼是淡水养殖的重要鱼类。据《2013中国渔业统计年鉴》数据显示，2012年黄颡鱼养殖产量达25.7万吨，苗种需求估计量达150亿尾。但是由于黄颡鱼苗种生产存在规模小、质量差、市场混乱等问题，优质苗种的匮乏已成为目前限制黄颡鱼养殖业快速发展的瓶颈。
在相同的养殖条件下，雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30%以上，因此，发明人发明了采用性逆转和雌核发育持续产生全雄黄颡鱼（中国专利号：ZL200610166518.8，公开号1994072，公开日2007年07月11日）的方法，建立了超雄黄颡鱼繁育种群（中国专利号：ZL200810197519.8，公开号101390503，公开日2009年03月25日）。该技术体系能够满足全雄黄颡鱼的规模化可持续生产的需要，为全雄黄颡鱼新品种在全国应用和推广打下坚实的基础。其中超雄黄颡鱼繁育系的稳定性和可靠性在全雄黄颡鱼的可持续利用方面具有非常重要的地位，目前该繁育系中YY生理雌鱼是来自于YY超雄鱼性逆转的产物，均是来自于同一家系，且均是雌核发育的后代，所以亲缘关系非常近。如果超雄黄颡鱼繁育系长期实施近交，可能会引起如生长性能和繁殖能力等性状下降，表现出近交衰退现象，对全雄黄颡鱼的可持续利用是不利的。
近十几年来，科研人员通过基因工程技术、细胞工程技术和杂交育种技术等在水产动物遗传改良，新品种选育和病害控制基础研究，特别是在养殖性状的遗传改良方面取得了一定进展。但是还未见结合传统群体选育、微卫星标记、人工性逆转、鱼类性别特异性分子标记PCR检测和测交验证等技术，对YY超雄黄颡鱼繁育系进行遗传改良的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是来自于同一家系的繁育系会出现近交衰退现象，对全雄黄颡鱼可持续利用不利而现有技术没有一种快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法。
本发明提供的快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法，步骤如下：
（1）筛选黄颡鱼野生雄性亲本：从不同水域收集野生黄颡鱼作为不同的地理群体，筛选出个体大、体色纯正和二龄以上的雄性亲本XY♂个体；
（2）黄颡鱼野生亲本种质资源评估：分析步骤（1）筛选出的不同地理群体雄性亲本的遗传多样性和地理群体间亲缘关系，进行遗传评价，筛选出遗传多样性最丰富的地理群体；
（3）构建YY♂和YY♀基础育种群体：步骤（2）筛选出的地理群体雄性亲本XY♂，与现有YY♀卵子交配，子代（含XY♂和YY♂）形成YY♂雄性基础育种群体；部分子代（含XY♂和YY♂）用雌激素进行人工性逆转（逆转成XY♀和YY♀），形成YY♀雌性基础育种群体；
（4）YY♂和YY♀基础育种群体的选育：步骤（3）获得的两个基础育种群体均培育至冬片阶段，分别淘汰小个体50%，留下的培育至春片再淘汰小个体50%；留下来的个体用X染色体特异标记引物进行基因型PCR鉴定，剔除含有X染色体的黄颡鱼，留YY♂和YY♀备用，强化培育作为候选亲鱼；
（5）YY♂和YY♀的测交验证：候选亲鱼YY♂与XX♀交配，候选亲鱼YY♀与XY♂交配，筛选测交后代中均为100%雄鱼的家系，获取改良YY♂和改良YY♀品系；
（6）YY♂超雄黄颡鱼改良繁育系的快速扩群：取步骤（5）的改良YY♂和改良YY♀进行交配、改良YY♂和现有YY♀进行交配、或改良YY♀和现有YY♂进行交配，获得100%的YY♂超雄黄颡鱼；
（7）YY♂超雄黄颡鱼改良繁育系的建立：取步骤（6）的100%YY♂超雄黄颡鱼，在鱼苗开口时，取一部分YY♂超雄鱼按步骤（3），用雌激素诱导性逆转成为YY♀生理雌鱼；将YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼养至性成熟后，再进行交配，持续生产YY♂超雄鱼；
重复步骤（7），建立成YY超雄鱼改良繁育系。
其中步骤（5）测交筛选的方法：候选雌鱼（含有XY♀和YY♀），和普通雄鱼（XY♂）测交，如果是YY♀，则后代均为雄性（基因型为YY或XY，各占约50%），如果是XY♀，则后代有1/4雌鱼（基因型XX占25%为雌鱼；基因型XY占50%，YY占25，均为雄鱼）；候选雄鱼（含有XY♂和YY♂），和普通雌鱼（XX♀）测交，如果是YY♂，后代均为雄性（基因型XY），如果是XY♂，后代有1/2雄鱼（基因型XX占50%为雌鱼，基因型XY占50%为雄鱼）。
其中所述现有YY♀和现有YY♂均为现有技术已知，例如专利号ZL200810197519.8公开的方法建立的超雄鱼繁育系中的生理雌鱼YY♀和超雄鱼YY♂。
优选地，步骤（1）中每个水域收集的野生黄颡鱼不低于1000尾，筛选出的雄性亲本XY♂不低于200尾。数量越多，越可以维持种群的遗传多态性。
优选地，步骤（2）采用微卫星标记技术进行遗传多样性和地理群体间亲缘关系。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.引入野生种质资源，同时建立多个改良YY超雄黄颡鱼繁育系，增加了超雄鱼的遗传多样性，提高了受精率、孵化率与存活率。
2.利用原有的YY生理雌鱼，并结合了染色体性别特异分子标记和测交验证技术，只需2代就可以建立超雄鱼改良系，它适用于雄性配子异型鱼类超雄鱼改良繁育体系的建立。该技术比专利ZL200810197519.8中的技术缩短了一代育种时间，可见，这种繁育种群的方法是快速的、有效的。
3.有明显的经济和社会效益：由于采用了YY♀生理雌鱼和YY♂超雄鱼交配法，可以迅速获得大量的改良YY♂超雄鱼，产品可批量进行，改良YY♂超雄鱼与普通XX雌鱼交配，规模化生产性状改良的XY全雄黄颡鱼，大大提高产量，增加经济效益。
附图说明
图1为ＹＹ超雄黄颡鱼繁育系改良方法技术原理图。
图2为ＹＹ超雄黄颡鱼繁育系改良工序流程方框图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
请参照图1和图2，实施例中所述的“现有YY♀”和“现有YY♂”可以选用专利号ZL200810197519.8公开的方法建立的超雄鱼繁育系中的生理雌鱼YY♀和超雄鱼YY♂。
1.筛选黄颡鱼野生亲本：从长江上游、长湖、洞庭湖、珠江水系、淮河、黑龙江、黄河等不同水域收集野生黄颡鱼作为不同的地理群体，每个地理群体捕捞约1000尾野生黄颡鱼，进行首次筛选，挑选个体较大、体色纯正和二龄以上的雄亲本XY♂个体，数量200尾以上（由于捕捞的是成鱼，可以直接从外形上进行雌雄区分），筛选方法也可以采用其他不伤害鱼体的现有技术。
2.黄颡鱼种质资源调查和种质遗传评价：运用微卫星标记技术，研究不同地理群体黄颡鱼种质资源的遗传多样性和不同地理群体之间的亲缘关系，进行不同地理群体黄颡鱼种质遗传评价，筛选不同地理群体相应的遗传标记，并选择遗传多样性最丰富的群体1个，为YY超雄黄颡鱼繁育品系改良育种奠定基础。
具体分析方法：
按常规方法从不同地理群体黄颡鱼尾鳍样品中提取基因组DNA，样品数量为40尾以上。根据目前所报道的文献设计10对微卫星多态性引物（见表1），进行PCR扩增反应，反应体系为25μL：2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL25mMMgCl2，1UTaqDNA聚合酶，0.5μL10mMdNTPs，0.5μM上下游引物，20ngDNA，加双蒸水至25μL。扩增条件为：94℃30s，退火30s，72℃30s，循环数为40。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶检测，鉴定有扩增产物后再用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE电泳）检测，银染，并用凝胶成像系统对凝胶进行拍摄并保存图片。通过与DNA分子量标准（pBR322DNA/MspI）比较来判读等位基因大小。
利用Popgene软件统计微卫星基因座的等位基因频率（P）、等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ae）、预期杂合度（He）、观测杂合度（Ho）。同时利用该软件测试了每个群体各个位点的哈代-温伯格平衡（Hardy-WeinbergEquilibrium，HWE），计算了不同群体的遗传相似指数（I）、遗传距离（Ds）、基因分化系数（GST）和基因流（Nm）。并根据Botstein等（1980）的分类方法计算位点多态性系含量（PIC）。PIC=，式中Pi、Pj分别为群体中第i和第j个等位基因频率，n为某一基因座上等位基因数。
用PHYLIPV3.6软件包（PhylogenyInferencePackage）gendist程序计算Nei氏遗传距离，再用UPGMA（类平均法）算法进行聚类分析。
结果判定：杂合度可以反应群体遗传多样性的高低，平均期望杂合度值越高，反映群体的遗传一致性越低，其遗传多样性就越丰富。
不同地理群体间亲缘关系分析：根据聚类先后顺序可以反映种群间亲缘关系的远近。聚类为一个分支的，我们可以选择其中一个群体构建一个改良系；如果亲缘关系较远，我们可以构建亲缘关系较远的改良系，进行各种改良系之间的生长性能对比，为以后筛选养殖性能最优的组合奠定基础。
3.构建YY♂和YY♀基础育种群体：步骤2中选择的遗传多样性最丰富的地理群体（野生雄性黄颡鱼XY♂）中，筛选30尾，取精巢后匀浆，混精后与现有YY♀交配，形成用于选育的YY♂雄性基础育种群体（鱼苗为XY♂和YY♂）。
同时所得部分鱼苗用雌激素进行性逆转，性逆转方法：以卤虫幼体为雌激素载体，将其先在150μg/L的17-alpha乙炔基雌二醇（EE2;Sigma）溶液中浸泡1小时，再抽滤取出富集雌激素的卤虫投喂已开口摄食的黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准。连续投喂40天，性逆转率达95%以上。形成用于选育的YY♀雌性基础育种群体（鱼苗为XY♀和YY♀，其中还有不到5%的XY♂和YY♂）。
由于黄颡鱼是雄性配子异型的鱼类，其性别体制是XX♀/XY♂，雌、雄鱼的比例近似为1:1。野生雄性黄颡鱼XY♂和现有YY♀交配产生的鱼苗为XY♂和YY♂，各约50%。经EE2性逆转之后，XY♂和YY♂均约有95%逆转成XY♀和YY♀，形成YY♀雌性基础育种群体。
将YY♂雄性基础育种群体和YY♀雌性基础育种群体分别转移至水泥池中，用蛋白质含量为43%的甲鱼饲料养至性成熟。
4.YY♂雄性和YY♀雌性基础育种群的选育：结合性别特异性分子标记和群体选择法进行。
步骤3获得的两个基础育种群培育到冬片阶段，留大规格鱼种，淘汰小个体50%；春片再如上淘汰一次。筛选过的春片用X染色体特异标记Pf-X62引物对性逆转YY♀雌性基础育种群体（包括XY♀和YY♀，以及少量XY♂和YY♂）、和YY♂雄性基础育种群体（包括XY♂和YY♂）黄颡鱼进行基因型PCR鉴定（具体方法参照专利ZL200810236650.0黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法），剔除含有X染色体的黄颡鱼（即XY♂和XY♀），留YY♂和YY♀备用。
Pf-X62引物：
上游引物：agagagatgaagaagggggacaag(SEQIDNO.21)；
下游引物：Aatctgttcattgatggcgc(SEQIDNO.22)。
基因型PCR鉴定方法：
按常规方法从黄颡鱼尾鳍样品中提取基因组DNA，以X染色体特异标记Pf-X62引物，进行PCR扩增反应，反应体系为25μL：2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL25mMMgCl2，1UTaqDNA聚合酶，0.5μL10mMdNTPs，0.5μM上下游引物，20ngDNA，加双蒸水至25μL。扩增条件为：94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环数为36。
扩增结果判定：
Pf-X62引物组合可以从黄颡鱼XX雌鱼和XY雄鱼基因组中扩增出一个片段大小为598bp或258bp的特异DNA片段，从YY雄鱼基因组中不能扩增出该特异片段。
强化培育作后备亲鱼，选择个体较大、体色纯正的作为候选雄鱼YY♂和候选雌鱼YY♀（实际操作中可能做不到100%准确率，因此候选亲鱼中可能含XY♂和XY♀），作配对亲本。5.测交验证：将步骤4中得到候选雄鱼YY♂与普通雌鱼XX♀测交，候选雌鱼YY♀和普通雄鱼XY♂测交，筛选出基因型确定的超雄鱼YY♂和生理雌鱼YY♀。测交可分为以下步骤：
5.1人工催产：取性成熟的候选YY♂与普通XX♀、原有YY♀，候选YY♀与普通XY♂、原有YY♂按常规方法进行人工催产。
5.2人工授精：把每尾候选雄鱼YY♂的大部分精巢用匀浆器研磨后分成两份，一份与普通雌鱼XX♀卵子授精（编号组1），另一份与原有YY♀卵子授精（编号组2）；每尾候选雌鱼YY♀卵子分成两份，一份卵子与普通雄鱼XY♂精子授精（编号组3），另一份与原有YY♂超雄鱼精子授精（编号组4）。
之所以将候选亲鱼与原有YY♂和原有YY♀交配，是为了缩短育种时间。如果确认编号组1的子代全部为雄性，则编号组2即为图1所示的YY超雄黄颡鱼改良繁育系3。特别是YY♂，人工授精时要杀鱼取精，因此最好分成2份同时跟YY♀交配，否则即使确定了是YY♂，也没有精子可以利用了。
5.3性比分析：受精卵孵出鱼苗后，将每个交配组合的卵黄苗各取50尾，利用Y染色体特异标记Pf-Y62引物进行基因型PCR鉴定，筛选编号组1和编号组3子代为100%雄性（基因型为YY）的家系，可推断其供试鱼基因型为YY，从而挑选出确认的YY♂和YY♀，获取稳定可靠的改良YY♂和改良YY♀品系。
Pf-Y62引物：
上游引物：agagagatgaagaagggggacaag(SEQIDNO.21)；
下游引物：AATCTGTTCATTGATGGCTG(SEQIDNO:23)。
基因型PCR鉴定方法：
按常规方法从黄颡鱼鱼苗样品中提取基因组DNA，以Y染色体特异标记Pf-Y62引物，进行PCR扩增反应，反应体系为25μL：2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL25mMMgCl2，1UTaqDNA聚合酶，0.5μL10mMdNTPs，0.5μM上下游引物，20ngDNA，加双蒸水至25μL。扩增条件为：94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环数为36。
扩增结果判定：
Pf-Y62引物组合可以从黄颡鱼XY雄鱼和YY超雄鱼基因组中扩增出一个片段大小为568bp的特异DNA片段，从XX雌鱼基因组中不能扩增出该特异片段。
6.YY超雄鱼改良品系的快速扩群：取步骤5.3中确定的改良YY♂和改良YY♀进行交配，或改良的YY♂和原有的YY♀交配(编号组2)，或改良的YY♀和原有的YY♂交配(编号组4)，快速获得100%的YY♂超雄鱼。
7.YY超雄鱼改良繁育系的建立：取步骤6中产生的100%YY♂超雄鱼，在鱼苗开口时，取一部分YY♂超雄鱼按工序3，用雌激素（EE2;Sigma）诱导性逆转成为YY♀生理雌鱼。将YY♂和YY♀养至性成熟后，再进行交配，可持续生产YY♂超雄鱼。
重复工序7，则可建立YY超雄鱼改良繁育系。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCELISTING
<110>武汉百瑞生物技术有限公司
<120>一种快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法
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Claims (3)
1.一种快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）筛选黄颡鱼野生雄性亲本：从不同水域收集野生黄颡鱼作为不同的地理群体，筛选出个体大、体色纯正和二龄以上的雄性亲本XY♂个体；
（2）黄颡鱼野生亲本种质资源评估：分析步骤（1）筛选出的不同地理群体雄性亲本的遗传多样性和地理群体间亲缘关系，进行遗传评价，筛选出遗传多样性最丰富的地理群体；
（3）构建YY♂和YY♀基础育种群体：步骤（2）筛选出的地理群体雄性亲本XY♂，与现有YY♀卵子交配，子代形成YY♂雄性基础育种群体；部分子代用雌激素进行人工性逆转，形成YY♀雌性基础育种群体；
（4）YY♂和YY♀基础育种群体的选育：步骤（3）获得的两个基础育种群体均培育至冬片阶段，分别淘汰小个体50%，留下的培育至春片再淘汰小个体50%；留下来的个体用X染色体特异标记引物进行基因型PCR鉴定，剔除含有X染色体的黄颡鱼，留YY♂和YY♀备用，强化培育作为候选亲鱼；
（5）YY♂和YY♀的测交验证：候选亲鱼YY♂与XX♀交配，候选亲鱼YY♀与XY♂交配，筛选测交后代中均为100%雄鱼的家系，获取改良YY♂和改良YY♀品系；
（6）YY♂超雄黄颡鱼改良繁育系的快速扩群：取步骤（5）的改良YY♂和改良YY♀进行交配、改良YY♂和现有YY♀进行交配或改良YY♀和现有YY♂进行交配，获得100%的YY♂超雄黄颡鱼；
（7）YY♂超雄黄颡鱼改良繁育系的建立：取步骤（6）的100%YY♂超雄黄颡鱼，在鱼苗开口时，取一部分YY♂超雄鱼按步骤（3），用雌激素诱导性逆转成为YY♀生理雌鱼；将YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼养至性成熟后，再进行交配，持续生产YY♂超雄鱼；
重复步骤（7），建立成YY超雄鱼改良繁育系。
2.根据权利要求1所述的快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法，其特征在于，步骤（1）中每个水域收集的野生黄颡鱼不低于1000尾，筛选出的雄性亲本XY♂不低于200尾。
3.根据权利要求1所述的快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法，其特征在于，步骤（2）采用微卫星标记技术进行遗传多样性和地理群体间亲缘关系分析。
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