CN109337988A

CN109337988A - 一种与enu诱变草鱼家系生长特性相关连的snp标记及检测引物

Info

Publication number: CN109337988A
Application number: CN201811282732.9A
Authority: CN
Inventors: 邹曙明; 王成龙; 郑国栋; 陈杰; 周春雪; 徐文迪
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明公开了一种草鱼SNP标记，草鱼SNP标记为草鱼mstn1基因465ntC/G、草鱼mstn1基因467nt G/A、草鱼mstn2基因909nt C/T和草鱼mstn2基因1024nt G/A中的任一种、任两种、任三种或四种。mstn1基因的GenBank登录号为KM874826.1。mstn2基因的GenBank登录号为KM874827.1。本发明还公开了用于发现或检测该SNP的方法、引物组以及应用。该SNP标记能够用于检测或监测草鱼的体重、全长、体长、体高、头长、尾柄长、尾柄高、体厚或其任意种的组合或任两种的比值。

Description

一种与ENU诱变草鱼家系生长特性相关连的SNP标记及检测引物

技术领域

本发明属于水产科学领域，涉及一种与ENU诱变草鱼家系生长特性相关连的SNP标记。

背景技术

ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)是一种常用的化学诱变剂，它能对基因组DNA碱基产生烷基化修饰，进而引起DNA在复制时发生错配导致突变体生成^[1,2]。ENU主要诱发不定点的单碱基突变，没有任何的倾向性，从而使基因发生突变，其诱变模式与自然变异相似^[3,4]。同时，ENU诱变效率很高，是其他诱变手段的10倍左右。在模式生物中，利用ENU获得大规模突变体进行功能基因的研究已成为常用手段。但在养殖鱼类中的应用报道很少。目前，仅前苏联报道采用ENU诱变结合雌核发育技术获得了鲤优良突变品系^[5]。国内韩启霞等^[6]采用ENU浸泡的方法诱变银鲫得到突变个体。

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肌肉生长抑制素(Mstn)基因是一种肌细胞生长负向调控因子，具有抑制肌肉分化和生长的作用，其表达量与肌肉质量的变化呈负相关^[7,8]。目前，mstn基因在哺乳动物方面针对功能及调控机理进行大量的研究^[9-13]，在水产动物方面还处于cDNA克隆与表达，功能研究相对较少^[14-17]。在鱼类中mstn基因存在两种亚型(mstn1、mstn2)并且时空表达具有较大的差异，濮剑威等^[18]研究表明mstn1在草鱼肌肉、脑和眼中的转录量较高，mstn2只在脑和肌肉中有表达。并且通过注射mstn1型mRNA过表达可导致斑马鱼体节发生期胚胎的前-后轴拉长，背-腹轴变短，脊索轻微扭曲，以及体节发育受到强烈抑制而不分化等现象。注射mstn2型mRNA胚胎早期发育有所延迟并未发生明显变化，但发育至60h之后尾部明显发生严重弯曲。

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子遗传标记在分子育种方面已经得到广泛的应用^[19,20]。

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发明内容

本研究通过ENU诱变草鱼4个家系的生长对比筛选出2个具有显著生长差异的家系，通过双向测序在这2个家系中mstn1、mstn2基因找出SNP位点，为ENU诱变草鱼生长性状的分子标记辅助育种提供候选标记。

经过175d养殖对长江水系邗江群体4个ENU诱变家系进行生长对比，采用显著性比较，偏相关分析和因子分析统计方法对体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析，进而运用双向测序法对mstn1、mstn2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示，ENU诱变家系4的生长速度明显大于ENU诱变家系3，家系4的体长、体高等8个性状也明显大于其他3个家系。对于mstn1，ENU诱变家系4仅在465ntC/G发生错义突变，而家系3则在465ntC/G、467ntG/A两个位点发生错义突变。对于mstn2，家系3和4在909 nt C/T均发生同义突变，而家系3在 1024 nt G/A产生错义突变。以上这些结果表明mstn1、mstn2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼家系4的生长性状优势存在紧密联系。

较为具体地，本发明第一方面公开了一种草鱼SNP标记，所述草鱼SNP标记为草鱼mstn1基因465ntC/G、草鱼mstn1基因467 nt G/A、草鱼mstn2基因909 nt C/T和草鱼mstn2基因1024 nt G/A中的任一种、任两种、任三种或四种。

在一些实施方式中，所述mstn1基因的GenBank登录号为 KM874826.1。

在一些实施方式中，所述mstn2基因的GenBank登录号为KM874827.1。

本发明第二方面提供了一种用于发现或检测如本发明第一方面所述的SNP标记的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取草鱼的基因组DNA。

(2)用PCR方法扩增所述草鱼的基因组DNA，其中，

针对所述草鱼mstn1基因465 ntC/G，引物对(i)为：

第一方向引物：5’-CGGTGCGTGGTGAGGTT，如SEQ ID NO.1所示；

第二方向引物：5’-CGCTTGGATTTTCGGACTGA，如SEQ ID NO.2 所示；

针对所述草鱼mstn1基因467 nt G/A，引物对(ii)为：

第一方向引物：5’-TGTTGCTTTTTCTCCTTCAGTC，如SEQ ID NO.3 所示；

第二方向引物：5’-CCCAAGTCCAGCCAGTA，如SEQ ID NO.4所示；

针对所述草鱼mstn2基因909 nt C/T，引物对(iii)为：

第一方向引物：5’-AGTGCTGTTTGGAGAGAGTGCGTAT，如SEQ ID NO. 5所示；

第二方向引物：5’-GGGTGACATCTTGGTGG，如SEQ ID NO.6所示；

针对所述草鱼mstn2基因1024 nt G/A，引物对(iv)为：

第一方向引物：5’-ACTCCTGGCAGCACAT，如SEQ ID NO.7所示；

第二方向引物：5’-AGCCCGTCAAGTCATC，如SEQ ID NO.8所示；

(3)对PCR扩增产物进行DNA测序；

(4)对DNA测序结果分析。

本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的SNP标记或如本发明第二方面所述的方法在草鱼育种中的应用。

本发明第四方面提供了如本发明第一方面所述的SNP标记或如本发明第二方面所述的方法在草鱼生长状况预测、检测或监测中的应用。

在一些实施方式中，所述草鱼生长状况选自：

草鱼的体重、全长、体长、体高、头长、尾柄长、尾柄高、体厚或其任意种的组合或任两种的比值。

本发明第五方面提供了一种用于检测或监测草鱼生长状况的PCR 引物对，所述PCR引物对选自引物对(a)、引物对(b)、引物对(c)、引物对(d)中的任一种、任两种、任三种或四种。

其中，所述引物对(a)为：

第一方向引物：5’-CGGTGCGTGGTGAGGTT，如SEQ ID NO.1所示；

第二方向引物：5’-CGCTTGGATTTTCGGACTGA，如SEQ ID NO.2 所示；

所述引物对(b)为：

第一方向引物：5’-TGTTGCTTTTTCTCCTTCAGTC，如SEQ ID NO.3 所示；

第二方向引物：5’-CCCAAGTCCAGCCAGTA，如SEQ ID NO.4所示；

所述引物对(c)为：

第一方向引物：5’-AGTGCTGTTTGGAGAGAGTGCGTAT，如SEQ ID NO. 5所示；

第二方向引物：5’-GGGTGACATCTTGGTGG，如SEQ ID NO.6所示；

所述引物对(d)为：

第一方向引物：5’-ACTCCTGGCAGCACAT，如SEQ ID NO.7所示；

第二方向引物：5’-AGCCCGTCAAGTCATC，如SEQ ID NO.8所示。

在一些实施方式中，所述草鱼生长状况选自：

本发明第六方面提供了一种用于检测或检测草鱼生长状况的试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第五方面所述的引物对。

附图说明

图1为比例性状因子主成分得分系数分布图。

图2为4个ENU诱变草鱼家系的各比例性状特征主因子散点图。

图3为家系3和家系4 mstn1基因部分序列SNP位点筛选。

图4为家系3和家系4 mstn2基因部分序列SNP位点筛选。

图5为草鱼ENU诱变育种的程序流程图。

图6为草鱼诱变育种F2代优良家系与对照后代的对照照片。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

1材料与方法

1.1试验材料及管理

ENU诱变草鱼亲本来自于上海海洋大学农业部团头鲂育种中心。 ENU诱变草鱼亲本具体诱变步骤为：

从上海海洋大学青浦鱼类育种试验站保有的长江水系邗江草鱼群体里挑选发育良好的6龄草鱼亲鱼雌、雄亲鱼各4尾，平均体重约 24kg。草鱼雌亲鱼注射促黄体素释放激素A2(LHRH—A2)4μg/kg进行催产，雄鱼剂量减半。雌、雄亲鱼置于产卵池中，流水刺激，在草鱼发情后拉网，立即取雄性草鱼精子开始ENU处理。处理精子时，取不同浓度的ENU工作液(0.5mmol、1mmol、5mmol和10mmol等)浸泡草鱼精子，精子与ENU工作液按1：4稀释，摇匀并放置在室温下，每10min用镊子尖头粘取精液在解剖镜或显微镜下检测精子的活力，在处理30—60min后，与草鱼卵子进行人工干法授精。受精卵置于塑料培养皿(直径90mm)中进行室温培养，每个培养皿放置草鱼受精卵约200颗，每4h用吸管换水和挑死卵，在Nikon SMZl500体视显微镜下进行发育时相观察、统计和拍照，统计体节期胚胎的畸形率和正常鱼苗的出苗率。以1mmol浓度ENU处理的精子能产生一定数量存活的F1后代，同时又能显示出明显的显性突变性状。保留以1mmol 浓度ENU处理草鱼成熟精子获得的诱变鱼苗，待平游后，3个处理组和对照分别放于标准化6个土池发塘和养殖。经8个月的养殖后，年底起捕，并对每条鱼进行PIT标记、测量体重和数码拍照，剪鳍置于 95％酒精保存，并建立个体档案。挑选形态正常、生长快速的ENU突变体可用于今后的育种工作。

我们从上海海洋大学农业部团头鲂育种中心保存的ENU诱变草鱼群体中挑选优良ENU诱变草鱼进行人工繁殖，雌、雄草鱼亲本各4 尾，每尾约25kg。对亲本进行一雌一雄交配方式干法授精，建立4 个ENU诱变草鱼家系。经过175d养殖对4个ENU诱变家系进行生长对比，采用显著性比较，偏相关分析得出家系4和家系3具有明显的生长差异。进而运用双向测序法对mstn1、mstn2基因在具有明显差异的2个家系中进行SNP位点筛选。

较为具体地，挑取6龄优良ENU诱变草鱼亲本进行人工繁殖，雌雄草鱼各4尾，每尾约25kg。对亲本进行一雌一雄交配方式干法授精，建立4个ENU诱变草鱼家系，将每个家系的受精卵分别放到孵化桶里进行孵化，待受精卵孵化成平游的鱼苗后，取每个家系鱼苗约2000尾放到6m×4m×1.5m的水泥池中暂养1个月后，再将每个家系鱼苗平均分到2个水泥池中暂养65天，从鱼苗平游开始计算，第80天通过剪鳍标记法对家系1、家系2、家系3和家系4分别剪左胸鳍、不剪鳍、右胸鳍和左腹鳍加以区分，从每个家系中随机挑选 50尾称量体质量后同池混养，设置3个平行试验组，约每隔30天对每个家系补剪鳍后放回原水泥池，经过175天饲养，对每个水泥池各个家系随机挑选20尾进行生长指标测量，测量完将4个家系草鱼放到同一个土塘进行饲养，放塘之前每个家系各取10尾鱼鳍放到95％酒精中保存于-20℃用于测序。

草鱼ENU诱变育种的程序参见图5所示：草鱼性成熟周期较长，通常需要5年，难以在短时间内获得良种，进行ENU诱变结合生殖操作(精原细胞移植)可加快育种进程。2017年，建立了优良突变体 2166尾，培育出20个ENU诱变优良草鱼F2代生长和抗病优良的家系。同塘生长对比试验，9个优良家系(F2代)的生长速度高于对照 20％。草鱼人工诱变筛选+生殖操作+分子标记育种将是一条缩短草鱼育种周期的道路。

图6显示了草鱼诱变育种F2代优良家系与对照后代的差别，其中两张图所用尺子长度相同。

1.2生长指标测量

用电子称测量体质量，精确到0.01g；用直尺、圆规测量全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚形态性状，精确到0.1cm。

1.3基因组DNA提取及SNPs筛选

参照北京天根生物科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(DP324-03)说明书介绍的方法提取家系3和家系4样品基因组DNA。基因组DNA提取完成后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量和浓度，-20℃保存备用。

根据美国国立生物技术信息中心GenBank数据库公布的草鱼 mstn1、mstn2基因序列(GenBank号依次分别为：KM874826.1； KM874827.1)，采用Primer Premier5软件设计mstn1、mstn2所需的引物，基因所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用引物序列及长度如表1所示。PCR反应体系为50μL，模板 DNA60-100ng，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L) 2μL，Taq酶(2.5U/μL)1μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，0.1％DEPC处理过的去离子水补至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s-90s，35个循环；72℃后延伸10min，4℃终止反应。取3uLPCR扩增产物，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条带符合送测要求后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。测序的结果利用BioEdit 软件确定SNP位点(突变率高于30％)。

表1ENU诱变草鱼mstn1、mstn2基因部分区域扩增SNP位点筛选所用的引物

1.4数据统计与分析

使用SPSS19.0软件^[21]中一般线性模型(GLM)对4个ENU诱变草鱼家系的全长、体长、体高、头长、尾柄长、尾柄高、体厚等性状进行相关性分析。运用NCBI，BioEdit对mstn1、mstn2基因中SNPs位点及氨基酸翻译进行比对。

2结果

2.1ENU诱变草鱼4个家系生长性状对比

由表2可知，第80天，平均体质量为家系1>家系4>家系3>家系2，绝对质量增加率为家系1>家系4>家系3>家系2；第175天，平均体质量为家系4>家系1>家系2>家系3，绝对体质量增加率为家系4>家系2>家系1＝家系3。

表2 4个ENU诱变草鱼家系不同阶段体质量的增长统计

4个ENU诱变草鱼家系在第175天各生长性状情况(表3)，家系 1和家系2的体高和头长，均没有显著性差异外，其他不同阶段每两个家系间的各个性状均有显著性差异。

表3 4个ENU诱变草鱼家系各生长性状特征值

注：同一行数字后的字母不同表示差异显著(P<0.01)

对4个ENU诱变草鱼家系在第175天各形态性状与体质量的相关程度进行了偏相关分析，结果见表4，各形态性状与质量显著性相关由P<0.01判断，因此各家系中与体质量显著性相关的性状分别为：家系1中有全长、体长、尾柄长、体厚，相关系数依次为0.357、0.619、 0.608、0.396；家系2中有全长、体长、头长、体厚，相关系数依次为0.348、0.360、0.687、-0.384；家系3中有全长、体长、尾柄长、尾柄高，相关系数依次为0.529、0.449、-0.351、0.384；家系4中有全长、体长、体厚，相关系数依次为0.629、0.543、0.590。

表4 4个ENU诱变草鱼家系的形态性状与体质量的偏相关分析

注：P<0.01表示极其显著

对4个ENU诱变草鱼家系在第175天的全长、体高、头长、尾柄长、尾柄高、体厚、体质量与体长的比例性状进行了因子分析。通过 KMO和Bartlett检验其度量值为0.705接近1，因此适合因子分析，其中第一主成分(P₁)和第二主成分(P₂)的贡献率分别为39.11％、18.98％，累计贡献率为58.09％，表达式分别为：P₁＝-0.113x₁+0.376 x₂+0.436x₃+0.228x₄+0.006x₅+0.335x₆-0.033x₇，P2＝0.368x₁-0.014 x₂-0.372x₃+0.065x₄+0.400x₅+0.053x₆+0.408x₇，其中x₁为全长/ 体长、x₂为体高/体长、x₃为头长/体长、x₄为尾柄长/体长、x₅为尾柄高/体长、x₆为体厚/体长、x₇为体质量/体长。各比例性状的分布如图1，从图中可以看出7个比例性状分成两组，P1主要代表x₂为体高 /体长、x₃为头长/体长、x₄为尾柄长/体长、x₆为体厚/体长的比例性状，P2主要代表x₁为全长/体长、x₅为尾柄高/体长、x₇为体质量/体长。

每个家系个体根据第一主成分和第二主成分相关系数得分绘制散点图，见图2，家系4在P1、P2得分区域分布明显与其他三个家系不同，家系2和家系3大部分个体分布重叠，家系1与家系2、家系3都有少部分个体质量重叠。

2.2mstn1、mstn2基因序列分析及SNPs位点筛选

本试验根据草鱼mstn1(GenBank为KM874826.1)和mstn2 (GenBank为KM874827.1)设计4对引物分段扩增部分片段，从家系3和家系4分别随机挑选10尾提取基因组DNA进行PCR扩增，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序，碱基在家系内出现2次以上(包括2次)即确定为SNP突变位点。

对于mstn1，家系3和4均在465ntC/G发生错义突变，导致该位点编码的氨基酸由脯氨酸变为精氨酸，家系3还在467ntG/A均发生错义突变，导致该位点编码的氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺 (图3)。

3讨论

3.1生长对比设计

在生长对比试验中，试验对象初始规格的差异可以影响到整个试验结束的结果^[21]，本试验为了减少前期生长差异对后期试验的影响，亲鱼催产、人工授精、受精卵孵化、鱼苗放到水泥池暂养的整个过程均同步进行，到了第80天对每个ENU诱变草鱼家系随机挑取50尾进行剪鳍标记同池混养，设置3个平行试验组，克服不同水泥池对生长对比造成的影响。在整个饲养管理过程中，每天定时投喂2次，每次以水面留有少量饲料为准，每次测量生长性状的操作是在室内进行，并且提前准备足够的冰水，尽量减少高温对草鱼的损伤。鱼类标记一般常用的方法有挂牌、剪鳍、染料标记、荧光标记、电子标记等标记技术，该试验使用的剪鳍标记相对于其他标记有简单操作，持久，对鱼伤害小等优点，李思发等^[22]研究了剪鳍标记部位对吉富罗非鱼生长的影响研究表明剪左胸、右胸、左腹和右腹鳍标记的鱼之间以及剪不同标记的鱼与未剪鳍标记的鱼之间的生长没有显著差异。

3.2家系生长差异分析

从平均体质量和绝对质量增加率来看，经过175天养殖，家系4 在这两方面具有明显的优势，而家系3生长优势最弱，从4个家系各个生长性状对比可知，家系4明显处于优势地位。从各个性状与质量的相关程度的角度分析，每个家系的主要相关性状有所区别，家系1 中相关系数最高的是尾柄长(0.619)，其次是体长(0.619)；家系2 中相关系数最高的是头长(0.687)，明显高于全长、体长、体厚；家系3中相关系数最高的是全长(0.529)；家系4中全长、体长、体厚的相关系数相近。形态比例性状在鱼类分类中是一个很重要指标，庆宁等^[23]通过形态比例性状对华南沿海地区西部不同水系的中间黄颡鱼群体进行了有效分类。本研究通过因子分析将多个相关的形态指标转换为新的、个数较少且相互独立的综合指标，通过4个家系个体在 P1、P2主成分因子得分系数图可以有效区分家系4和家系3，由此可以看出家系4的生长性状相对于家系3具有明显的生长差异。

3.3mstn基因在ENU诱变草鱼家系的SNP多态性

ENU溶液浸泡精子可在草鱼中实现高效诱变，在诱变育种领域具有潜在的应用前景。本文选取的4个ENU诱变草鱼家系均是具有显著的生长优势的个体。通过对mstn1、mstn2基因初筛选出不同的SNP 位点，对于mstn1，家系3和4均在465 ntC/G发生错义突变，家系 3还在467 nt G/A均发生错义突变。对于mstn2，家系3和4均在 909 nt C/T发生同义突变，家系3在1024 nt G/A产生错义突变。由此推测家系3和家系4产生的显著生长差异，与mstn基因的SNP 位点差异导致编码的氨基酸不同，使该基因功能表达差异有联系，因此家系3和家系4可作为试验材料来研究mstn基因相关分子标记的开发，为后续的ENU诱变草鱼的分子标记辅助育种奠定基础。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 一种与ENU诱变草鱼家系生长特性相关连的SNP标记及检测引物

<141> 2018-10-31

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggtgcgtgg tgaggtt 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcttggatt ttcggactga 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgttgctttt tctccttcag tc 22

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagtcca gccagta 17

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtgctgttt ggagagagtg cgtat 25

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggtgacatc ttggtgg 17

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actcctggca gcacat 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcccgtcaa gtcatc 16

Claims

1.一种草鱼SNP标记，所述草鱼SNP标记为草鱼mstn1基因465ntC/G、草鱼mstn1基因467nt G/A、草鱼mstn2基因909nt C/T和草鱼mstn2基因1024nt G/A中的任一种、任两种、任三种或四种。

2.如权利要求1所述的SNP标记，其特征在于：

所述mstn1基因的GenBank登录号为KM874826.1。

3.如权利要求1所述的SNP标记，其特征在于：

所述mstn2基因的GenBank登录号为KM874827.1。

4.一种用于发现或检测如权利要求1或2或3所述的SNP标记的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取草鱼的基因组DNA。

(2)用PCR方法扩增所述草鱼的基因组DNA，其中，

针对所述草鱼mstn1基因465ntC/G，引物对(i)为：

第一方向引物：5’-CGGTGCGTGGTGAGGTT，如SEQ ID NO.1所示；

第二方向引物：5’-CGCTTGGATTTTCGGACTGA，如SEQ ID NO.2所示；

针对所述草鱼mstn1基因467nt G/A，引物对(ii)为：

第一方向引物：5’-TGTTGCTTTTTCTCCTTCAGTC，如SEQ ID NO.3所示；

第二方向引物：5’-CCCAAGTCCAGCCAGTA，如SEQ ID NO.4所示；

针对所述草鱼mstn2基因909nt C/T，引物对(iii)为：

第一方向引物：5’-AGTGCTGTTTGGAGAGAGTGCGTAT，如SEQ ID NO.5所示；

第二方向引物：5’-GGGTGACATCTTGGTGG，如SEQ ID NO.6所示；

针对所述草鱼mstn2基因1024nt G/A，引物对(iv)为：

第一方向引物：5’-ACTCCTGGCAGCACAT，如SEQ ID NO.7所示；

第二方向引物：5’-AGCCCGTCAAGTCATC，如SEQ ID NO.8所示；

(3)对PCR扩增产物进行DNA测序；

(4)对DNA测序结果分析。

5.如权利要求1-3中任一项所述的SNP标记或如权利要求4所述的方法在草鱼育种中的应用。

6.如权利要求1-3中任一项所述的SNP标记或如权利要求4所述的方法在草鱼生长状况预测、检测或监测中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，所述草鱼生长状况选自：

8.一种用于检测或监测草鱼生长状况的PCR引物对，所述PCR引物对选自引物对(a)、引物对(b)、引物对(c)、引物对(d)中的任一种、任两种、任三种或四种。

其中，所述引物对(a)为：

第一方向引物：5’-CGGTGCGTGGTGAGGTT，如SEQ ID NO.1所示；

第二方向引物：5’-CGCTTGGATTTTCGGACTGA，如SEQ ID NO.2所示；

所述引物对(b)为：

第一方向引物：5’-TGTTGCTTTTTCTCCTTCAGTC，如SEQ ID NO.3所示；

第二方向引物：5’-CCCAAGTCCAGCCAGTA，如SEQ ID NO.4所示；

所述引物对(c)为：

第一方向引物：5’-AGTGCTGTTTGGAGAGAGTGCGTAT，如SEQ ID NO.5所示；

第二方向引物：5’-GGGTGACATCTTGGTGG，如SEQ ID NO.6所示；

所述引物对(d)为：

第一方向引物：5’-ACTCCTGGCAGCACAT，如SEQ ID NO.7所示；

第二方向引物：5’-AGCCCGTCAAGTCATC，如SEQ ID NO.8所示。

9.如权利要求8所述的用于检测或检测草鱼生长状况的PCR引物对，所述草鱼生长状况选自：

10.一种用于检测或检测草鱼生长状况的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求8或9所述的引物对。