CN106719114B

CN106719114B - 暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种及生产方法

Info

Publication number: CN106719114B
Application number: CN201511017786.9A
Authority: CN
Inventors: 成乐天; 朴仁锡; 金钟燮; 林同奎; 崔昌植; 柳光烈; 文温周; 金保均
Original assignee: Chungcheongnamdo
Current assignee: Chungcheongnamdo
Priority date: 2015-11-18
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2035-12-29
Also published as: CN106719114A; KR101632842B1

Abstract

本发明生产暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种，具体包括分别从暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性提取卵和精液，并实施它们之间的人工授精而得到受精卵之后，对受精卵进行孵化及培育的步骤。根据本发明的方法生产的新的杂交种品种具有快速成长的优点，还能够期待由现有的低的生产率和经济性而衰退的河豚的养殖产业的增加。

Description

暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种及生产方法

技术领域

本发明涉及一种暗纹东方鲀(OLIVE TAKIFUGU OBSCURUS)和红鳍东方鲀(TAKIFUGU RUBRIPES)之间的杂交种及其杂交方法，更具体而言，涉及一种暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种及生产方法，其包括自暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性中分别提取卵和精液，并实施它们之间的人工授精来获得受精卵之后，孵化受精卵及进行培育的步骤，从而能够生产出具有快速的生长率的养殖品种。

背景技术

河豚是一种主要栖息在热带及温带区域的暖和的海热地带的鱼种，在韩国国内捕捞如中华多纪魨

红鳍东方鲀

暗纹东方鲀

黄鳍东方鲀

及怀氏兔头鲀

等6余种，并用于食用。目前，沿岸的河豚资源量因过度而表现出每年急剧减少的趋势，但是为满足市场的需求，要求扩大养殖的河豚目标品种及增加生产量。

目前，在韩国实现了红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的两种河豚养殖，但与其他养殖鱼种相比，由于在河豚的最初生长过程中，攻击性和在同种之间共食(cannicalism)现象非常突出，因此在培育方面有很多困难，并且在个体特性上因成长速度慢而需要商业化的时间太长，因此在产业化方面非常困难。

但是，通过研究人员的长期努力红鳍东方鲀能够完全实现养殖，已经成功实现商业化。红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)属于鲀科，分布于韩国整个沿岸和日本海西部、中国东海等地带，属于在河豚种类中在全世界范围内养殖最多的品种。在红鳍东方鲀的形态特征上，身的背部呈黑褐色，中部以银灰色为基本颜色，且多个眼镜大小的黑点以1～2条线的方式延伸至尾鳍。红鳍东方鲀成长至商品化的大小，即生长至1kg需要18个月的时间，且在河豚类中属于大型品种。

相反，暗纹东方鲀因生物学特性和强烈的共食行为及攻击性，在实现完全养殖方面遇到了困难。暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)是一种属于鲀形目(Tetraodontiformes)的鲀科(Tetraodontidae)的鱼类，成鱼的背部为橄榄色，腹侧由于是白色，因此呈现光彩，且在腹部具有较宽的鲜黄色的纵带。主要分布区域在韩国的西、南海和中国的东、南海等海域。众所周知的是，其在成为母鱼之前栖息在海中，而到了产卵期的4～5月份时则逆流而上至江河的中上流，在铺着砾石的江底产卵的溯河型生态。

暗纹东方鲀与其他河豚不同的是，其具有如下优点，即由于对盐分的适应性非常强，使得不仅在海面，而且在内陆水域也可以进行养殖，且其是售价达到约50000韩元/kg的高附加价值的一种鱼种。相反，其也具有如下缺点，即为生产350g以上的商品化暗纹东方鲀，需要进行30个月以上的长期饲养。如上所述，暗纹东方鲀需要长期饲养，因此使得可能会由疾病导致生产性降低、且存在用于过冬的供暖费及人力消耗会增高，以及共食率高等问题。基于上述问题，对于暗纹东方鲀的水产渔业来讲，虽然其具有很高的附加价值，但仍在回避对此鱼种的养殖。因此需要付出为了使暗纹东方鲀养殖普遍化且大众普及化的努力。

另外，在鱼类中，为了对在地理上分离分布的两种群之间的分类学上的分支进行探讨，且掌握由外来种的流入引起的本地种的遗传性污染程度，会对杂交种进行研究。在人工生产鱼类杂交种的过程中，虽然存在初期生长及能否成熟等很多变数，但最近随着养殖业的发展，正在进行着关于开发具有两个品种的优点的新的养殖目标品种的研究。

所进行的这种研究可以通过使杂交种第一代表达的某些性状比作为亲鱼使用的两个品种的性状更优秀的杂交优势(heterosis)来进行说明。但是，由于杂交优势不是在所有的性状中表现的现象，因此为了生产具有优秀的性状的杂交种，不断进行着对多种鱼种之间的杂交研究。目前，只有少数鱼种用于作为关于韩国内的杂交鱼类的研究，如关于泥鳅和泥鳅的杂交种及杂交三倍体、比目鱼和圆斑星鲽的杂交种的细胞遗传学及分子生物学研究等。

并且，如果可以以暗纹东方鲀和红鳍东方鲀为对象，通过杂交技术生产具有两个品种的优良性状的杂交种时，在解决上述问题的同时，其还可作为养殖鱼种在产业上具有很高的价值。

现有技术文献

专利文献:

韩国授权专利号第10-0724805号

韩国公开专利公报第10-2011-0005259号

韩国公开专利公报第10-2000-0063064号

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明是因为如上所述的需求而提出，其所要解决的技术问题在于，提供一种暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种及生产方法，这种生产方法具体包括自暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性中分别提取卵和精液，并实施它们之间的人工授精来获得受精卵之后，孵化受精卵及培育的步骤，因此这种杂交种具有快速的成长率，且具有因杂交种优势的抗病性。

技术方案

作为用于解决上述技术问题的方案，本发明提供一种暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种生产方法，其由如下步骤构成：分别从暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性进行采卵及采精的步骤；用干式法对所述获得的卵和精液进行人工授精的步骤；在淡水条件下使所述进行人工授精的受精卵孵化的步骤；使所述孵化的仔鱼

稚鱼

引入至海水的步骤。

所述孵化步骤的淡水的条件是水温为18～20℃且盐度为5psu，在孵化3日之后，进行仔鱼、稚鱼的海水引入步骤，并且，海水的条件是水温为22～24℃且盐度为31psu，在孵化3日之后，完成海水引入步骤，并且，海水的条件是水温为22～24℃且盐度为31psu。

并且，本发明提供一种暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的受精卵，其是通过分别从暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性提取卵及精液，并利用其进行人工授精而得到的。本发明还提供一种暗纹东方鲀和红鳍东方鲀间的杂交种，该杂交种是分别从暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性提取卵及精液，并通过对其进行人工授精而得到的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀间的杂交种的受精卵进行孵化培育而得到。

有益效果

根据本发明的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种，其作为具有暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之的中间性状的新品种，具有成长快的优点、且与产业价值高的暗纹东方鲀的外形相似，因此具有很高的附加价值的有点。

附图说明

图1为表示对用本发明的方法生产的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种、暗纹东方鲀、红鳍东方鲀在2周～16周期间以两周为间隔来进行测量的体重的折线图。

图2为对用本发明的方法生产的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种和暗纹东方鲀、红鳍东方鲀的实验鱼的外形和大小进行比较的照片。

图3表示了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的流式细胞仪图表。

图4表示了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的核型(A、B、C)和染色的核仁形成区(NORs)中期(D、E、F)。

图5表示了对于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的肾脏、肝、肠等的组织学部位。

图6表示了外部红细胞形态(A、B、C)和二倍体的染色的腮细胞核仁形成区(NOR)(D、E、F)和从暗纹东方鲀诱导的三倍体。

图7表示了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的视网膜的组织学切片。

具体实施方式

本发明涉及一种将自暗纹东方鲀和红鳍东方鲀中提取的卵和精液进行人工授精并成熟的杂交种及生产方法。以下通过具体的实施例，对本发明进行详细说明。

Ⅰ.暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种生产方法

1.暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种生产方法

本发明的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的生产方法，其由如下步骤构成：压迫暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性的腹部来对卵和精液进行采卵及采精的步骤；用干式法使上述获得的卵和精液实现人工授精的步骤；在水温范围为18～20℃且盐度为5psu的淡水条件下使上述受精卵孵化的步骤；在3日之后，使上述孵化的仔鱼、稚鱼引入至水温范围为22～24℃且盐度为31psu的海水的步骤。以下通过更加具体的实施例说明时，如下所示。

在本发明中，卵和精液进行采卵及采精的步骤的实验鱼，即暗纹东方鲀雌性(337±8.7g)和红鳍东方鲀雄性(1876±16.7g)是从在忠清南道水产研究所饲养中的3～5年生个体中筛选产卵期成熟状态良好的个体并使用于实验。为诱导暗纹东方鲀雌性的产卵而将人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG；西格玛(Sigma)，美国(USA))以1000IU/kg注射于腹腔，在经过36小时之后开始以3小时为时间间隔轻轻地按下腹部，以对成熟卵进行采卵。用腹部压迫法从红鳍东方鲀雄性采取精液之后，将收集的精液以10倍稀释于0.85％生理盐水，并在授精中使用。

本发明的授精的步骤可通过使上述获得的卵和精液直接接触而诱导授精的干式法来实现暗纹东方鲀成熟卵和红鳍东方鲀精子的人工受精。

本发明的孵化步骤因考虑种间受精卵的孵化条件而将受精卵分别收容于淡水及海水来进行孵化管理。此时作为对照组，以相同的方法分别对暗纹东方鲀和红鳍东方鲀进行人工授精，且将暗纹东方鲀受精卵收容于淡水、将红鳍东方鲀受精卵收容于海水来进行孵化管理。另外，杂交的受精卵分别收容于海水和淡水进行孵化管理。

各实验组的受精卵在授精3分钟之后在包含克莱白土(cray-earth)的饲养水中搅拌30秒去除粘附性质。搅拌之后用灭菌的过滤饲养水洗卵，并转至漏斗状的孵化器而对受精卵进行孵化管理。用过滤饲养水洗卵，并使用胶质去除剂去除粘液质的操作能够防止因卵之间相互粘连而导致孵化率降低的现象。比较合适的是，胶质去除用125-250μm粒子大小的酸性白土(fuller's earth)与受精卵混合并在搅拌3分钟之后进行洗净处理。表1表示各实验组的受精卵的孵化期间的环境条件。

[表1]

各实验组的受精卵孵化条件

	温度(℃)	盐度(psu)	水
				暗纹东方鲀(River puffer)	19	5	孵化3天后提供海水
红鳍东方鲀(Tiger puffer)	19	31	-
				杂交种(淡水)	19	5	孵化3天后提供海水
杂交种(海水)	19	31	-

本发明的海水供给步骤是在上述孵化步骤中，将在淡水条件下孵化的仔鱼、稚鱼在3日之后供给至水温范围为22～24℃且盐度为31psu的海水的步骤。此后，在孵化之后作为孵化的仔鱼、稚鱼的食物，将少量的海产小球藻(chlorella)混合于饲养水中，从孵化的第3天开始以3～10个体/mL的水平供给轮虫(rotifer)，孵化13～45日龄时以3～10个体/mL的水平供给卤虫无节幼体(Artemia nauplius)幼虫。从孵化15日龄开始供给混合饲料。在所有实验区以相同的方式供给食物生物及混合饲料。

在饲养期间，从2周开始至16周的时间内以2周为间隔来测量成长情况，在用麻醉剂麻醉稚鱼之后将全长和体重测量至毫米(mm)和克(g)单位。在实验期间饲养水温为23.7±0.84℃，溶解氧为4.2～6.5ppm。

2.暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种生产方法结果及形态的检测

检测了用本发明的方法生产的杂交种的生产结果及亲鱼中表现出的外在的形态。表2表示了用上述方法生产的暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的授精率、发眼卵率、孵化率、孵化后至7天的初期存活率。

[表2]

暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的授精率、发眼卵率、孵化率、稚鱼及仔鱼存活率(孵化后第7天％)

	授精率	发眼卵率	孵化率	存活率
					暗纹东方鲀(River puffer)	86.4	77.7	67.2	94.9
红鳍东方鲀(Tiger puffer)	88.8	73.1	58.5	90.8
					杂交种(淡水)	85.7	71.6	61.7	83.4
杂交种(海水)	81.1	66.3	48.7	43.7

与暗纹东方鲀相同地、从淡水孵化诱导的杂交种受精卵(淡水)以授精率85.7％、发眼卵率71.6％、孵化率61.7％、存活率83.4％，与作为对照组的暗纹东方鲀受精卵的授精率、发眼卵率、孵化率、存活率比较时，并无大的差异。

但是，在红鳍东方鲀受精卵的孵化环境的海水中孵化诱导的杂交种受精卵(海水)实验组的受精卵以授精率81.1％、发眼卵率66.3％、孵化率48.7％、存活率43.7％，虽然在授精率和发眼卵率与作为对照组的红鳍东方鲀受精卵比较时无大的差异，但在孵化率和存活率方面显示出明显的差异。以上述结果为基础，暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种受精卵在调节为水温19℃、盐度5psu的淡水环境下进行孵化被认为比较合适。

为判断产业价值而查看存活率时，在淡水条件下孵化的杂交种的存活率为83.4％，与存活率为94.9％、90.9％的双亲，即暗纹东方鲀、红鳍东方鲀进行比较时，存活率为中等至相似的水平，可判断出杂交种的初期存活率具有产业价值。

以下的表3表示了分别从暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的仔鱼及稚鱼孵化之后，在2周～16周期间以2周为间隔测量的体重结果，图1为表示对用本发明的方法生产的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种、暗纹东方鲀、红鳍东方鲀在2周～16周期间以两周为间隔来进行测量的体重的折线图。

[表3]

暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的仔鱼及稚鱼孵化之后，在2周～16周期间测量的体重结果

根据饲养日龄的暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交种河豚的16周的成长实验结果是：从孵化后6周的期间，在体重方面，暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交种河豚之间未显示出显著的差异，但从孵化后的第6周开始与暗纹东方鲀进行比较时，红鳍东方鲀和杂交种河豚的体重以显著的差异增大同时，随着饲养日龄愈增加，红鳍东方鲀及杂交种河豚的体重与暗纹东方鲀的体重相比显示出越来越大的差异。相反，比较红鳍东方鲀及杂交种河豚的成长时，在饲养期间未显示出显著的差异。

图2为对用本发明的方法生产的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种和暗纹东方鲀、红鳍东方鲀的实验鱼的外形和大小进行比较的照片。在最上部示出了传统的暗纹东方鲀(river puffer)和红鳍东方鲀(tiger puffer)的成鱼。中间部和最下部是分别表示用本发明的实验方法孵化之后16周的暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的稚鱼及仔鱼，以及比较3只稚鱼及仔鱼而示出的结果。

杂交种的外形与在背部散落有小的橄榄色斑点的红鳍东方鲀明显具有明显地外形上的差异，但与暗纹东方鲀在外型上未显示出大的差异。因此，根据本实验诱导的杂交种的外部形态显示出与雌性暗纹东方鲀相似的结果，因此认为其将在产业上具有价值。

Ⅱ.暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种遗产学分析

为了阐明根据本发明的方法生产的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种的遗传特性，并且判别杂交种，故以下实施了遗产学分析。

1.暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种遗传学分析实验

1)染色体数目及核型分析

为实验组的染色体数目及核型分析而依据金等人(Kim et al.(1982))的方法，利用肾脏组织制备了染色体标本。向10只随机抽样的标本以适当的浓度(1～10μg/g)腹腔注射秋水仙碱(colchicine)，放置3～4小时之后，摘取肾脏并细切之后，在常温下由贮存液(0.075M KCI)进行了30分钟处理。对贮存液处理的肾脏组织细胞用固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)经由3次进行了固定。

用空气干燥法制作了载玻片标本，用5％迈-格氏加姬姆萨溶液染色了10～15分钟。制备好的标本在光学显微镜(×1000)下进行观察，并对于每个个体，以可判读的50多个的染色体中期分裂相为对象进行了计数，核型分析按照莱文等(Levan et al.(1964))的方法进行了分析。

2)测量红细胞大小

任意提取10只暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及它们之间的杂交种，从各个个体的尾柄部静脉采集血液之后，涂抹于载玻片，并用100％乙醇固定。之后，用姬姆萨溶液进行染色。对于每个个体，测量了120个红细胞，在光学显微镜(×1000)下用测微仪(micrometer)测量了红细胞细胞及核的长径(a)和短径(b)。表面积用abπ/4(Sezaki and Kobayashi，1978)公式，体积用4(a/2)×(b/2)×π/3(Lemoine and Smith，1980)公式进行计算。

3)红细胞的核仁形成区(NORs)

任意提取10只暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及它们之间的杂交种，摘取鳃组织之后，在4℃的卡诺氏(Carnoy)溶液(1：3乙酸：乙醇)中固定30分钟以上。并且，用同样的方法再固定之后冷藏保管至分析。

将充分固定的各组织块放置于载玻片之后，充分供给45％乙酸，然后依据刀切法(chopping method)使各组织分散于载玻片上。在载玻片涂抹上述各个组织之后，用95％乙醇进行固定。对于固定好的上述载玻片标本，滴上将50％硝酸银(AgNO₃)和明胶溶液(gelatin solution)(溶剂是1％甲酸，溶质是2％明胶)以2:1比例混合(Howell et al.，1979)制备的染色液，之后盖上玻片盖住之后，在68℃的切片加温器(slide warmer)进行100秒的显色反应，然后用蒸馏水洗净，利用光学显微镜(×1000)观察红细胞的NORs。

4)测量DNA含量

为分析暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及它们之间的杂交种的DNA含量而执行了流式细胞术。为防止血液的凝固而用ACD溶液(0.48g柠檬酸(citric acid)，1.32g柠檬酸三钠(trisodium citrate)，1.47g葡萄糖(glucose)，100mL蒸馏水(distilled water))涂布1mL一次性注射器之后，从鱼体尾柄部采集0.1～0.2mL的血液，利用血细胞计数器(hemocytometer)以1～2×10⁶cell/mL计数血液，并固定于75％乙醇中。

为DNA染色而在半胱氨酸蛋白酶抑制剂DNA双步骤试剂盒(Cystain DNA 2stepskit，派德有限公司明斯特(Partec GmbH Munster)，德国)2mL中添加各标本100μl然后，在暗凉条件下染色15～30分钟，使用Partec PA-II流式细胞仪(派德有限公司明斯特，德国)来测量了DNA含量。

5)组织学观察

任意提取10只暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及它们之间的杂交种，摘取肝、眼球、肠及肾脏，利用组织学方法测量了细胞核大小。将各个脏器分别固定在10％中性福尔马林中。在经过24小时之后，在各个样品中用新的10％中性福尔马林进行了替换，且在替换24小时之后，放入波恩氏溶液(Bouin’s solution)(苦味酸750ml，福尔马林250ml，乙酸5ml)中24小时，从而使组织进行了软化。

将软化好的组织在流动的水中水洗24小时之后，分别在70％、80％、90％、100％乙醇中放入各1小时进行脱水，接着分别放入工业用二甲苯和试剂用二甲苯中各1小时进行脱醇。将脱醇的样品放入软石蜡(soft paraffin)中12小时，以使软石蜡渗透至样品组织内，之后再放入硬石蜡中12小时，以使硬石蜡渗透至组织内。

对于经过渗透过程的样品，将其放入包埋模具中，利用包埋机(EG1150H，徕卡(Leica)，德国)以硬石蜡包埋为正方形形状，利用切片机(microtome)(RM2235，徕卡，德国)将包埋的样品以6μm单位进行切削，之后涂抹在载玻片上。涂抹的载玻片用苏木精-伊红染色法进行染色之后进行了镜检。测量了视网膜的厚度、肝细胞的核面积、肠上皮细胞的核长度、肾脏的二次近端小管的细胞及核的长轴和短轴及面积等。

2.暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种遗传学分析实验结果

1)染色体数目及核型分析结果

图3表示了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的流式细胞仪图表。A为暗纹东方鲀，显示出最高点的平均值大致接近于200；B为杂交种，最高点显示出接近于240；A为红鳍东方鲀，最高点大致显示出290。

以下的表4中示出了在暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的鳃组织的100个细胞之间的不同数目的核仁

含量。二倍体的核仁的数目显示1或2，三倍体的核仁显示为1、2或3。这些值表示三倍的组的平均值±标准偏差。

[表4]

暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的鳃组织的100个细胞之间的不同数目的核仁含量

查看上述表4时，可观察到如下所述的鳃组织的核仁含量：在暗纹东方鲀的第一个染色体中为36.8次、第二个染色体中为64.2次，在红鳍东方鲀的第一个染色体中为40.5次、第二个染色体中为59.5次，在杂交种的第一个染色体中为40.6次、第二个染色体中为59.4次。

图4表示了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的核型(A、B、C)和染色的核仁形成区(NORs)中期(D、E、F)。在A中表示了暗纹东方鲀(2n＝44)的中期(左)和核型图(右)。B表示杂交种(2n＝48)的中期(左)和核型图(右)。C表示红鳍东方鲀(2n＝48)的中期(左)和核型图(右)。D表示暗纹东方鲀的着色的核仁形成区(NORs)中期，E表示杂交种的着色的核仁形成区(NORs)中期，F表示红鳍东方鲀的着色的核仁形成区(NORs)中期。箭头是指显微镜的端着丝点染色体

条的长度表示10μm。

由于在大部分的情况下，杂交种的染色体由杂交种诱导时所使用的亲鱼的雌雄各自的一组单倍体(haploid)染色体构成，因此通过染色体数目或者核型分析来判别杂交种是准确度非常高的方法。

2)红细胞大小测量结果

表5比较了本发明的暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的肾脏的近端小管和中肠上皮的核大小的情况。各自的值表示三个组的平均值±标准偏差。在相同的行中，上标表示具有显著的差异(P<0.05)。通过表面积＝1/4×abπ，体积＝4/3×π(a/2)×(b/2)²公式进行计算。a表示细胞或者核的最大轴，b表示细胞或者核的最小轴。

[表5]

对于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种比较肾脏的近端小管和中肠上皮的核大小

图5表示了对于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的肾脏、肝、肠等的组织学部位。A表示暗纹东方鲀的肾脏组织切片，B表示杂交种的肾脏组织切片，C表示红鳍东方鲀的肾脏组织切片。D表示暗纹东方鲀的肝组织切片，E表示杂交种的肝组织切片，F表示红鳍东方鲀的肝组织切片。G表示暗纹东方鲀的肠组织切片，H表示杂交种的肠组织切片，I表示红鳍东方鲀的肠组织切片。在图5中图示的罗马字母缩写是指血管(BV，Blood vessel)，肝细胞核(HC，nucleus of hepatocyte)，中肠上皮细胞(ME，midgut epithelium)，二次近端小管的核(SPT，secondary proximal tubule)。

在查看上述的表5和图5时，对于肾小管细胞、肝细胞及肠上皮细胞核的大小，虽然也与红细胞的细胞和核的大小相类似地、在暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间显示出显著的差异，但在暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交种的三个组之间未显示出显著的差异。

3)红细胞的核仁形成区(NORs)结果

以下的表6表示了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的红细胞和核的比较。各自的值表示了三个组的平均值±标准偏差。在相同的行中，上标表示具有显著的差异(P<0.05)。通过表面积＝1/4×abπ，体积＝4/3×π(a/2)×(b/2)²公式进行了计算。a表示细胞或者核的最大轴，b表示细胞或者核的最小轴。

[表6]

暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的红细胞和核的比较

图6表示了外部红细胞形态(A、B、C)和二倍体的染色的腮细胞核仁形成区(NOR)(D、E、F)和从暗纹东方鲀诱导的三倍体。A和D表示暗纹东方鲀，B和E表示杂交种，C和F表示红鳍东方鲀。在空气干燥的各个组中显示污迹，并用迈-格氏加姬姆萨来进行染色。箭头是指染色的核仁形成区，条的长度表示10μm。

在查看上述表6和图6时，对于红细胞和核的大小，在红细胞和核的长轴、短轴、表面积及体积等所有评价项目中，暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间显示出显著的差异。但是，杂交种的红细胞和核的长轴、短轴、表面积及体积为暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的中间数值，暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交种三个组之间未显示出显著的差异，因此按照确认杂交种时最容易的方法，即由切瓦萨斯(Chevassus(1983))的红细胞的细胞及核大小测量方法，就能将根据本发明的方法生产的杂交种判断为暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种。

4)DNA含量测量结果

以下的表7表示暗纹东方鲀(Takifugu obscures)、红鳍东方鲀(T.rubripes)、按照本发明的方法生产的杂交种的DNA含量。

[表7]

本发明的杂交种、红鳍东方鲀、暗纹东方鲀的DNA含量

为测量上述表7的DNA含量而由泥鳅(泥浆泥鳅(mud loach)，大鳞泥鳅(Misgurnusmizolepis)(2.81皮克/核(pg/nucleus)))的DNA含量使用为参考标准。在查看各自的DNA含量时，暗纹东方鲀为1.84pg/nucleus及红鳍东方鲀为2.64pg/nucleus，对于杂交种(hybrid)显示它们的中间值2.15pg/nucleus。这样的结果像反应了上述图4中的说明，即反映了暗纹东方鲀的染色体数目(2n＝44)、杂交种群的染色体数目(2n＝48)、红鳍东方鲀的染色体数目(2n＝48)的差异。

5)组织学观察结果

以下的表8表示对于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种，从眼球的各个结构层和外部核层的数目中表示其厚度。各自的值表示了三个组的平均值±标准偏差。在相同的行中，上标表示显著的差异(P<0.05)。

[表8]

对于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种，从视网膜的各个结构层和外部核层的数目中表示其厚度

图7表示了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀、杂交种的视网膜的组织学切片。A表示暗纹东方鲀，B表示杂交种，C表示红鳍东方鲀，各个罗马字母缩写表示上皮细胞层(EL)、神经节细胞层(GCL)、内核层(INL)、内网层(IPL)、外核层(ONL)、外网层(OPL)及视杆和视锥层(RCL)。条的长度表示10μm。

观察上述表8和图7时，对于视网膜的厚度，在暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间显示显著的差异，但在暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交种的三个组之间未显示显著性的差异。对于角膜层、视细胞层

外界膜、外部颗粒层、外部网状层、内部颗粒层、内部网状层、神经节细胞层、视神经纤维层和外层细胞核的数目，在暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交种之间未显示出显著性的差异。

观察如上所述的实验实施例的结果时，暗纹东方鲀(♀)和红鳍东方鲀(♂)的杂交种与亲鱼在存活率方面相类似，外形上与在使用的亲鱼中的雌性暗纹东方鲀更类似，但在成长变化方面与亲鱼的雄性红鳍东方鲀相类似。但是杂交种判别结果大部分显示亲鱼的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的中间值，能够判断出是暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种，因此通过暗纹东方鲀(♀)和红鳍东方鲀(♂)的杂交化评价及成长评价，可确认作为新的养殖品种的杂交种河豚的产业化可能性。

产业上可利用性

通过生产暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的杂交种，使得能够解决现有的低的生产效率和经济性的暗纹东方鲀养殖的问题，从而能够生产出在短期内具有高成长率且具有暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的中间性质的新品种，因此能够提高河豚养殖产业的生产性，因此不仅能够对养殖基础的扩大及水产领域的发展作出贡献，还可通过提高养殖技术的国际竞争力能够对增加渔业的所得发挥贡献，因此在产业上具有可利用性。

Claims

1.一种暗纹东方鲀和红鳍东方鲀间的杂交种生产方法，其特征在于，由如下步骤构成：

分别从暗纹东方鲀的雌性和红鳍东方鲀的雄性进行采卵及采精液的步骤；

通过所述获得的卵和精液进行人工授精的步骤；

在淡水条件下使进行所述人工授精的受精卵孵化的步骤；

使所述孵化的仔鱼、稚鱼引入至海水的步骤。

2.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀间的杂交种生产方法，其特征在于，

所述孵化步骤的淡水的条件是水温为18～20℃，且盐度为5psu。

3.根据权利要求2所述的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀间的杂交种生产方法，其特征在于，

在孵化3日之后，进行仔鱼、稚鱼的海水引入步骤，海水的条件是水温为22～24℃，且盐度为31psu。

4.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀间的杂交种生产方法，其特征在于，

所述暗纹东方鲀和红鳍东方鲀间的杂交种的DNA含量为21.5±0.02pg/nucleus。