CN110358819A - 一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法 - Google Patents

一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于鱼类育种技术领域，公开了一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法，进行选育系斑鳢性逆转；伪雌鱼鉴定；伪雌鱼繁殖；超雄鱼鉴定及超雄鱼扩繁。利用本发明提供的方法步骤，可以培育全雄性乌斑杂交鳢，雄性率93％以上；全雄品种在养殖过程中，养殖7个月，相比普通品种亩产增加8％以上，2斤以上高15％；养殖当年新鱼饲料系数降低0.1；养殖10个月，比普通品种增产26.6％，饲料系数降低0.175‑0.21。本发明进行杂交获得的新品种“乌斑杂交鳢”具有生长速度快、耐低温能力强的优点，可取代北方地区的乌鳢养殖，成为全国性养殖品种。

Description

一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法
技术领域
本发明属于鱼类育种技术领域，尤其涉及一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
鳢是我国重要的淡水优质经济鱼类，具有骨刺少、肉鲜嫩、营养丰富的特点，有去瘀生新，滋补调养等功效，深受消费者喜爱，易于加工，是重要水产品之一。
目前江南及华南地区主要养殖品种为以斑鳢为母本、乌鳢为父本杂交获得的斑乌杂交鳢，黄河及以北主要养殖乌鳢。由于乌鳢只能摄食冰鲜鱼或活饵料，水质污染严重，已被很多地区限制或禁止养殖。斑乌杂交鳢不耐寒，不能推广到北方地区。
本单位以通过连续选育4代的斑鳢为父本和选育2代的乌鳢为母本，进行杂交获得乌斑杂交鳢新品种，生长速度快、耐寒能力强，可以推广到全国大部分地区养殖，取得良好社会和经济效益。
然而，鳢科鱼类中存在显著的生长雌雄差异，雌性规格达到500g以上性腺加快发育，生长减慢，饲料系数提高，商品鱼养成后雄性个体规格是雌性的2倍以上。大规格个体在定价方面比小规格每公斤高2～4元以上，经济效益差异明显。所以在生产中，养殖户一般养殖至当年年底将存塘1斤及以下规格鱼挑出低价出售，这部分鱼90％以上为雌鱼，剩余的鱼(雄鱼占约90％)继续养殖至次年3-4月份养殖到2斤以上出售，以获得较高的价格。养殖全雄性鳢可避免分拣，所有鱼都可养成到商品规格，将提高整体生长速度达20％，市场需求迫切。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术中，通过连续选育4代的斑鳢和选育2代的乌鳢为良种品系亲本，进行杂交获得的新品种，仅解决了抗寒和生长速度问题，没有解决鳢雌雄差异大的问题，其中雌性个体小，性成熟后怀卵造成饲料系数增加，加大了养殖成本。
(2)鳢商品鱼以规格定价，1kg以上个体比1kg以下个体市场价格高50％以上，雌性小个体比例提高，降低了整体价格，严重影响渔民收入。
(3)渔民为了减少雌性个体带来的影响，每年都要在雌性性腺开始发育时对整塘鱼进行挑选，将250g以下个体提前以较低的价格卖出，留下大个体的雄鱼继续养殖，以期获得更高的价格。这耗费了大量的劳动力，增加了支出。
(4)已有技术利用雌核发育的方法生产和扩繁YY超雄乌鳢，伪雌鱼的鉴定需要用后代的性别推测亲本的基因型，而且雌核发育后代成活率非常低，亲本制备效率很低。
解决上述技术问题的难度：鱼类中雌雄差异大、有单性育种需求的鱼类很多。但目前，实现单性育种的鱼类仅全雌大西洋鲑、全雌牙鲆、全雄黄颡鱼几种，大部分鱼类还未实现单性育种技术的突破。主要技术障碍在于伪雌鱼和超雄分子鉴定、伪雌鱼或超雄鱼不能繁殖等问题。
解决上述技术问题的意义：本发明提供全雄乌斑杂交鳢育种中几个关键技术，包括性逆转、伪雌鱼分子鉴定、伪雌鱼繁殖、超雄鱼分子鉴定。利用这些技术可以实现鳢的性别控制，可以以超雄斑鳢生产全雄、超雄斑鳢和乌斑杂交鳢，从而创制新种质和养殖品种。目前全雄品种开展实现小试和中试，取得良好效果。全雄养殖品种的培育，可以大幅提高鳢养殖经济效益，节本增效。同时，也为其他鱼类的性别控制提供技术参考。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法。本发明利用性别特异分子标记同时鉴定伪雌鱼和超雄鱼，效率大大提高。
本发明是这样实现的，一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法，所述全雄乌斑杂交鳢的培育方法包括以下步骤：
步骤一，选育系斑鳢性逆转；将斑鳢鱼苗在水中进行浸泡，投喂浮游动物，适时增补雌激素，驯化人工饲料后投喂雌激素，不再在水中添加雌激素，培育鱼苗，直至性成熟。
步骤二，伪雌鱼鉴定。进行DNA提取、引物设计、PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析。确定样品基因型，根据基因型鉴定性别。
步骤三，伪雌鱼繁殖。将鉴定基因型为雄性、生理性别为雌性的伪雌鱼与良种品系的雄鱼进行繁殖。
步骤四，超雄鱼鉴定。将伪雌鱼的后代剪取少量鳍条，提取DNA，利用鉴定伪雌鱼的分子标记进行鉴定。出现不同于步骤二中基因型的新的纯合子基因型的个体即为超雄鱼。
步骤五，超雄鱼扩繁。
进一步，步骤一选育系斑鳢性逆转中，首先将孵化出苗的良种品系斑鳢鱼苗在含有浓度为1mg/m3β-雌二醇的水中进行浸泡，同时正常投喂浮游动物，换水后根据换水量增补雌激素。
待鱼苗生长到1.5cm时，开始驯化添加人工饲料，人工配合饲料中添加50mg/kgβ-雌二醇。
添加时，β-雌二醇首先溶于无水乙醇中，均匀喷洒于饲料表面同时搅拌，喷洒完后在阴凉的地方晾干，使酒精挥发。拌喂雌激素后，水体中不再添加雌激素。
投喂添加雌激素的饲料40天后停止添加激素，转为正常鱼苗培育，直至性成熟。
进一步，步骤二伪雌鱼鉴定中，具体包括：
1)DNA提取，在上述经过性逆转的性成熟斑鳢中挑选雌鱼，对每条鱼进行电子射频标签标记后取鳍条提取DNA。DNA提取采用本领域的常规技术手段提取，包括酚-氯仿法和各种DNA提取试剂盒。提取总DNA后用无菌水稀释至20ng/ul。
2)引物设计，提取的DNA利用引物进行基因分型，所用引物序列为：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。扩增序列为：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
3)PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析，将样品DNA模板、Primer F、Primer R、PCRpremix、LC green荧光染料混合形成PCR反应体系，再将反应板在PCR仪上进行扩增，扩增后在light scanner分析系统中进行熔解曲线收集，利用仪器自带软件进行分析，确定样品基因型，根据基因型鉴定性别。
进一步，步骤3)中，PCR反应体系为20ul,包括：
2×PCR premix 10ul,primer F 0.6ul，primer R 0.6ul，DNA模板1ul，无菌水6.8ul，LC green 1ul。反应在仪器专用PCR 96孔板中进行，石蜡油覆盖密封。
扩增和检测条件：
按上述反应体系配制好试剂后，将反应板置于普通PCR仪中，设置以下程序：95℃10min。然后进行40个循环，包括95℃15s，62℃30S，72℃40S。然后72℃延伸10min，4℃保存10min后结束。
PCR结束后，将反应板加载到light scanner分析系统中，利用默认设置进行熔解曲线收集和分析。
进一步，步骤三伪雌鱼繁殖中，催产方法为：
(1)亲本催产，首先将亲本暂养池水温调至28℃并维持温度恒定。伪雌鱼母本催产采用两针注射法，第一针每千克鱼体重使用4μg/kg LRH-A2背部肌肉注射。第一针注射后12小时后进行第二针注射，每千克鱼体重使用700IU/kg HCG和10μg/kg LRH-A2，第二针注射后即将母本放入泡沫箱中，箱中水温调节到28℃，水位为2/3高度。
伪雌鱼催产约5-6小时后，挑选1kg左右规格的普通雄鱼进行催产，催产时背部肌肉注射HCG的剂量为120IU/kg。注射后即与母本在泡沫箱中1：1配对自然产卵。
(2)受精卵孵化，产卵后，将亲鱼捞出，鱼卵在原泡沫箱中孵化。孵化24h后将变白坏卵去除，出现黑色环状胚胎的受精卵收集进入孵化池中孵化。
(3)苗种培育，将孵化出膜后能够下沉聚集在一起游动的鱼苗移至水泥池培育，并用丰年虫投喂。待鱼苗生长到3cm，用鱼浆拌饲料进行驯化，逐步过渡
到全部用饲料投喂。培育至5～8cm规格后移至池塘养殖至性成熟。
进一步，步骤五超雄鱼扩繁包括：超雄鱼培育性成熟后，与伪雌鱼繁殖生产超雄鱼，或与乌鳢母本繁殖生产全雄乌斑杂交鳢。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
利用本发明提供的方法步骤，可以在生长速度快、耐低温能力强的“乌斑杂交鳢”新品种的基础上培育全雄品种，雄性率93％以上。全雄品种在养殖过程中不需要人工剔除雌鱼，养殖7个月，相比普通品种亩产增加8％以上，2斤以上比例比人工筛选过的群体高15％以上。养殖当年新鱼饲料系数降低0.1。养殖10个月，比普通品种增产26.6％，饲料系数降低0.175-0.21。新的品种可完全取代北方地区的乌鳢养殖，成为全国性养殖品种，具有非常广阔的市场前景、巨大产业价值和科学价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的全雄乌斑杂交鳢的培育方法流程图。
图2是本发明实施例提供的伪雌鱼的分子鉴定图。
图中：将性逆转后发育成熟为雌性的个体进行基因型鉴定，其中A基因型为伪雌鱼，B基因型为正常雌鱼。
图3是本发明实施例提供的伪雌鱼与普通雄鱼后代中超雄鱼分子鉴定图。
图中：A基因型为XY雄鱼。B基因型为XX雌鱼。C基因型为YY超雄鱼。
图4是本发明实施例提供的超雄鱼与伪雌鱼后代中超雄鱼的分子鉴定图。
图中：基因型A为普通雄鱼。基因型B为超雄鱼。
图5是本发明实施例提供的全雄乌斑杂交鳢与普通杂交鳢生长速度对比图。
图中：每个点为每月分别测量全雄组和普通组生长情况获得的平均体重。养殖到120天全雄鱼平均体重即超过普通组(对照)30％以上。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术中，通过连续选育4代的斑鳢和选育2代的乌鳢为良种品系亲本，进行杂交获得的新品种解决了生长速度和抗寒的问题，但其中的雌鱼生长速度慢、个体小、饲料系数高、商品价值低，造成商品鱼饲料系数增加、价格低，加大了养殖成本，降低养殖效益。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的全雄乌斑杂交鳢的培育方法包括：
S101，选育系斑鳢性逆转。
S102，伪雌鱼鉴定。
S103，伪雌鱼繁殖。
S104，超雄鱼鉴定。
S105，超雄鱼扩繁。
步骤S101选育系斑鳢性逆转中，首先将孵化出苗的良种品系斑鳢鱼苗在含有浓度为1mg/m3β-雌二醇的水中进行浸泡，同时正常投喂浮游动物，换水后根据换水量增补雌激素。待鱼苗生长到1.5cm左右时，开始驯化添加人工饲料，人工配合饲料中添加50mg/kgβ-雌二醇。添加时，β-雌二醇首先溶于无水乙醇中，均匀喷洒于饲料表面同时搅拌，喷洒完后在阴凉的地方晾干，使酒精挥发。拌喂雌激素后，水体中不再添加雌激素。投喂添加雌激素的饲料40天后停止添加激素，转为正常鱼苗培育，直至性成熟。
步骤S102伪雌鱼鉴定中，具体包括：
1)DNA提取，在上述经过性逆转的性成熟斑鳢中挑选雌鱼，对每条鱼进行电子射频标签标记后取鳍条提取DNA。DNA提取可以采用本领域的常规技术手段提取，包括酚-氯仿法和各种DNA提取试剂盒。提取总DNA后用无菌水稀释至20ng/ul。
2)引物设计，提取的DNA利用引物进行基因分型，所用引物序列为：
Primer F：5'AACATGACCCAAGAAGAGAATAAT 3'SEQ ID NO：1。
Primer R：5'GGCTGTGATTTTCATCCAACTGAGTT 3'SEQ ID NO：2。
扩增序列(不含引物)为：
序列1：GAATGGAAAGATTCGAAGCATGGTTAGCGGAACATGTCTCAGAATGCATTTGGGGGC SEQID NO：3。
序列2：GAATGGAAAGAGGGGC SEQ ID NO：4。
其中序列2中间缺失41bp序列。当扩增的碱基序列仅为序列1时，样品为遗传雌性，当样品为序列1和2时，样品为遗传雄性。
3)PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析，将样品DNA模板、Primer F、Primer R、PCRpremix、LC green荧光染料混合形成PCR反应体系，再将反应板在PCR仪上进行扩增，扩增后在light scanner分析系统中进行熔解曲线收集，利用仪器自带软件进行分析，确定样品基因型，根据基因型鉴定性别。
其中PCR反应体系为20ul,包括：
2×PCR premix 10ul,primer F 0.6ul，primer R 0.6ul，DNA模板1ul，无菌水6.8ul，LC green 1ul。反应在仪器专用PCR 96孔板中进行，石蜡油覆盖密封。
扩增和检测条件：
按上述反应体系配制好试剂后，将反应板置于普通PCR仪中，设置以下程序：95℃10min。然后进行40个循环，包括95℃15s，62℃30S，72℃40S。然后72℃延伸10min，4℃保存10min后结束。
PCR结束后，将反应板加载到light scanner分析系统中，利用默认设置进行熔解曲线收集和分析。
结果判定：收集熔解曲线后，样品的基因型可根据曲线峰即可鉴别。如下图中，熔解曲线为双峰的样品基因型为雄性，仅有1个与双峰右侧峰相同的峰的样品为雌性。基因型为雄性，而生理为雌性的个体为伪雌鱼。
如图2所示，伪雌鱼的分子鉴定(将性逆转后发育成熟为雌性的个体进行基因型鉴定，其中A基因型为伪雌鱼，B基因型为正常雌鱼)图。
步骤S103伪雌鱼繁殖中，将上述鉴定基因型为雄性、生理性别为雌性的伪雌鱼与良种品系的雄鱼进行繁殖。催产方法为：
(1)亲本催产，首先将亲本暂养池水温调至28℃并维持温度恒定。伪雌鱼母本催产采用两针注射法，第一针每千克鱼体重使用4μg/kg LRH-A2背部肌肉注射。第一针注射后12小时后进行第二针注射，每千克鱼体重使用700IU/kg HCG和10μg/kg LRH-A2，第二针注射后即将母本放入泡沫箱中，箱中水温调节到28℃，水位为2/3高度。
伪雌鱼催产约5-6小时后，挑选1kg左右规格的普通雄鱼进行催产，催产时背部肌肉注射HCG的剂量为120IU/kg。注射后即与母本在泡沫箱中1：1配对自然产卵。
(2)受精卵孵化
产卵后，将亲鱼捞出，鱼卵在原泡沫箱中孵化。孵化24h后将变白坏卵去除，出现黑色环状胚胎的受精卵收集进入孵化池中孵化。
(3)苗种培育
将孵化出膜后能够下沉聚集在一起游动的鱼苗移至水泥池培育，并用丰年虫投喂。待鱼苗生长到3cm规格，用鱼浆拌饲料进行驯化，逐步过渡到全部用饲料投喂。培育至5～8cm规格后移至池塘养殖至性成熟。
步骤S104超雄鱼鉴定包括：
伪雌鱼后代理论上有三种基因型，分别为XX雌性、XY雄性和YY雄性。利用上述鉴定伪雌鱼的分子标记进行鉴定，鉴定标记、仪器和PCR程序同步骤S102。如图3伪雌鱼与普通雄鱼后代中超雄鱼分子鉴定，其中A基因型为XY雄鱼，B基因型为XX雌鱼，C基因型为YY超雄鱼。
步骤S105超雄鱼扩繁包括：上述利用伪雌鱼与普通雄鱼繁殖的后代中25％为超雄鱼，为提高超雄鱼生产效率，将伪雌鱼与超雄鱼进行繁殖，其后代中有50％为超雄鱼。伪雌鱼与超雄鱼后代全部为雄性，其基因型鉴定如图4超雄鱼与伪雌鱼后代中超雄鱼的分子鉴定所示，其中基因型A为普通雄鱼，基因型B为超雄鱼。
上述超雄鱼培育性成熟后，可与伪雌鱼繁殖生产超雄鱼，也可与乌鳢母本繁殖生产全雄乌斑杂交鳢。繁殖方法与伪雌鱼繁殖相同。
本发明通过将斑鳢雄性性逆转为雌性，将伪雌鱼与普通雄鱼繁殖产生超雄鱼，再利用超雄鱼与伪雌鱼生产超雄鱼，并利用分子标记鉴定伪雌鱼和超雄鱼，避免了测交鉴定的繁琐过程，加快了新品种培育效率。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
应用实例1：
2015年，利用上述方法，性逆转斑鳢苗种2万尾。至2016年养殖至性成熟后，挑选272尾生理雌鱼进行分子鉴定，经鉴定其中121尾为伪雌鱼。利用这121尾伪雌鱼与普通雄鱼配对繁殖，最终仅2尾伪雌鱼成功产受精卵，并孵化出苗种500余尾。鱼苗培育至2017年性成熟后，检查共获得288尾，均为雄鱼。经基因型鉴定，其中YY鱼为54尾。利用上述YY超雄鱼中5尾与乌鳢母本配对繁殖，生产2万余尾全雄乌斑杂交鳢，经过5个月养殖，解剖鉴定生理性别，雄性率为100％，而对照组雄性率仅为38％。利用其中10尾与斑鳢伪雌鱼配对繁殖，产生5000尾后代，培育至2018年，获得性成熟亲鱼684尾，经鉴定含有超雄鱼348尾。利用上述超雄鱼与乌鳢母本生产全雄乌斑杂交鳢苗种300万尾，在中山、珠海、佛山进行试验养殖。
养殖实例2：
珠海斗门某养殖场同时养殖全雄乌斑杂交鳢和普通杂交鳢，两口相邻池塘面积均为6亩，分别于2018年5月22日放塘体长8厘米(体重约5.5克)规格普通杂交鳢鱼种6.5万尾，6月12日放塘相同规格全雄杂交鳢6.9万尾，全雄组养殖密度略高于普通组，全雄苗放塘时，普通杂交鳢组已生长至15克左右，养殖管理和投喂饲料均相同，7月12日开始每月进行对比测量。
对比测量结果如下：
初始规格 30天 62天 90天 120天
全雄组 5.0 59.3 179.7 338.5 775.2
对照组 15.0 96.7 207.5 316.8 580.1
全雄杂交鳢组在初始规格显著小于普通杂交鳢组的情况下，养殖90天后达到相同规格，养殖到120天平均体重即超过普通组30％以上。经抽样检查，全雄组雄性率97％，对照普通杂交鳢雄性率46％。如图5所示。
养殖实例3：
2018年12月，珠海市养殖全雄和普通杂交鳢的两个5亩池塘出鱼，其中养殖全雄的塘苗种为5月25日生产，12月5日出塘，普通苗种为5月21日生产，12月28日出塘。全雄组养殖194天，出鱼69023斤。普通组养殖221天，出鱼63826斤。经抽样测量，全雄组平均重1.8斤，2斤上69％，饲料系数1.02。普通组均重1.6斤，2斤上54％，饲料系数1.12。全雄组养殖时间少27天的情况下，平均规格更大，饲料系数降低0.1。
2019年3月1日，中山三角某全雄杂交鳢养殖池塘出塘，经加工厂抽样检测，雄性率93％，1千克以上规格占比94.6％，1千克以下规格4.6％。经测算，全雄杂交鳢养殖池塘的饲料系数1.15，而同场其他池塘普通杂交鳢均经过12月份挑鱼，将250克以下小规格雌鱼挑出上市后剩下约90％为雄性的大规格鱼继续养殖，至同期，挑选后的鱼塘1千克以上规格占89-91％，饲料系数为1.32～1.36。全雄杂交鳢养殖不用在越冬前挑雌鱼，一直养殖至上市，饲料系数降低0.17-0.21，大规格占比更高，养殖优势非常显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
佛山市南海百容水产良种有限公司
<120> 一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacatgaccc aagaagagaa taat 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctgtgatt ttcatccaac tgagtt 26
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaatggaaag attcgaagca tggttagcgg aacatgtctc agaatgcatt tgggggc 57
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaatggaaag aggggc 16

Claims (7)

1.一种全雄乌斑杂交鳢的培育方法，其特征在于，所述全雄乌斑杂交鳢的培育方法包括：
伪雌鱼鉴定，进行DNA提取、引物设计、PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析；确定样品基因型，根据基因型鉴定性别；
伪雌鱼繁殖，将鉴定基因型为雄性、生理性别为雌性的伪雌鱼与良种品系的雄鱼进行繁殖；
超雄鱼鉴定，利用鉴定伪雌鱼的分子标记进行鉴定。
2.如权利要求1所述的全雄乌斑杂交鳢的培育方法，其特征在于，伪雌鱼鉴定中，具体包括：
1)DNA提取，在上述经过性逆转的性成熟斑鳢中挑选雌鱼，对每条鱼进行电子射频标签标记后取鳍条提取DNA；DNA提取采用本领域的常规技术手段提取，包括酚-氯仿法和各种DNA提取试剂盒；提取总DNA后用无菌水稀释至20ng/ul；
2)引物设计，提取的DNA利用引物进行基因分型，所用引物序列为：
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；扩增序列为：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；
3)PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析，将样品DNA模板、Primer F、Primer R、PCRpremix、LC green荧光染料混合形成PCR反应体系，再将反应板在PCR仪上进行扩增，扩增后在light scanner分析系统中进行熔解曲线收集，利用仪器自带软件进行分析，确定样品基因型，根据基因型鉴定性别。
3.如权利要求2所述的全雄乌斑杂交鳢的培育方法，其特征在于，步骤3)中，PCR反应体系为20ul,包括：
2×PCR premix10ul,primer F0.6ul，primer R0.6ul，DNA模板1ul，无菌水6.8ul，LCgreen1ul；反应在仪器专用PCR96孔板中进行，石蜡油覆盖密封；
扩增和检测条件：
按上述反应体系配制好试剂后，将反应板置于普通PCR仪中，设置以下程序：95℃10min；然后进行40个循环，包括95℃15s，62℃30S，72℃40S；然后72℃延伸10min，4℃保存10min后结束；
PCR结束后，将反应板加载到light scanner分析系统中，利用默认设置进行熔解曲线收集和分析。
4.如权利要求1所述的全雄乌斑杂交鳢的培育方法，其特征在于，伪雌鱼繁殖中，催产方法为：
(1)亲本催产，首先将亲本暂养池水温调至28℃并维持温度恒定；伪雌鱼母本催产采用两针注射法，第一针每千克鱼体重使用4μg/kg LRH-A2背部肌肉注射。第一针注射后12小时后进行第二针注射，每千克鱼体重使用700 IU/kg HCG和10μg/kg LRH-A2，第二针注射后即将母本放入泡沫箱中，箱中水温调节到28℃，水位为2/3高度；
伪雌鱼催产约5-6小时后，挑选1kg左右规格的普通雄鱼进行催产，催产时背部肌肉注射HCG的剂量为120 IU/kg。注射后即与母本在泡沫箱中1：1配对自然产卵；
(2)受精卵孵化，产卵后，将亲鱼捞出，鱼卵在原泡沫箱中孵化；孵化24h后将变白坏卵去除，出现黑色环状胚胎的受精卵收集进入孵化池中孵化。
(3)苗种培育，将孵化出膜后能够下沉聚集在一起游动的鱼苗移至水泥池培育，并用丰年虫投喂；待鱼苗生长到3cm，用鱼浆拌饲料进行驯化，逐步过渡到全部用饲料投喂；培育至5～8cm规格后移至池塘养殖至性成熟。
5.如权利要求1所述的全雄乌斑杂交鳢的培育方法，其特征在于，伪雌鱼鉴定前需进行：
选育系斑鳢性逆转；将斑鳢鱼苗在水中进行浸泡，投喂浮游动物，增补雌激素，驯化人工饲料后投喂雌激素，培育鱼苗，直至性成熟。
6.如权利要5所述的全雄乌斑杂交鳢的培育方法，其特征在于，选育系斑鳢性逆转中，首先将孵化出苗的良种品系斑鳢鱼苗在含有浓度为1mg/m3β-雌二醇的水中进行浸泡，同时正常投喂浮游动物，换水后根据换水量增补雌激素；
待鱼苗生长到1.5cm时，开始驯化添加人工饲料，人工配合饲料中添加50mg/kgβ-雌二醇；
添加时，β-雌二醇首先溶于无水乙醇中，均匀喷洒于饲料表面同时搅拌，喷洒完后在阴凉的地方晾干，使酒精挥发；拌喂雌激素后，水体中不再添加雌激素；
投喂添加雌激素的饲料40天后停止添加激素，转为正常鱼苗培育，直至性成熟。
7.如权利要求1所述的全雄乌斑杂交鳢的培育方法，其特征在于，超雄鱼鉴定后还需进行超雄鱼扩繁；
所述超雄鱼扩繁包括：超雄鱼培育性成熟后，与伪雌鱼繁殖生产超雄鱼，或与乌鳢母本繁殖生产全雄乌斑杂交鳢。
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