CN116732157A - 一种用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记，所述的分子标记能够检测雄性乌鳢和雄性斑鳢Y染色体上的特异核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。本发明还提供一种鉴定乌鳢、斑鳢或杂交鳢的遗传性别和品种的方法，是使用PCR扩增引物来进行扩增上述特异核苷酸片段的全部或部分片段，根据扩增DNA条带大小和数量确定其性别和品种。本发明在筛选出乌鳢和斑鳢Y染色体中一段4‑5kb比较保守的雄性特异插入片段的基础上，设计了用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记引物，该引物可对乌鳢、斑鳢或杂交鳢性别和品种进行快速准确地鉴定。
Description
技术领域
本发明属于淡水经济鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记。
背景技术
乌鳢(Channa argus)隶属鲈形目(Perciformes)、鳢科(Channidae)、鳢属(Channa)，俗称黑鱼、生鱼、乌鱼、财鱼等。金乌鳢(AlbinoChanna argus)是由于乌鳢体色相关基因slc45a2突变产生的一种白化品系。研究表明乌鳢在生长过程中表现出明显的性别二态性，2-3龄雄性的体型大约是雌性的两倍。而与其亲缘关系很近的斑鳢(Channamaculata)同样也表现出性别二态性，雄性生长速度明显快于雌性。此外，在鳢科鱼类的养殖繁育生产中，发现两种鳢科鱼类的杂交品种——杂交鳢，根据其杂交父母本不同又分为斑乌鳢(斑鳢♀×)和乌斑鳢(/>×斑鳢♀)，呈现出不同的杂种优势，也表现出相似的生长性状上的性别二态性。因此，开展鳢科鱼类全雄育种技术研究，对于提高鳢科鱼类的养殖产量和经济效益具有重要意义。
由于乌鳢、斑鳢和杂交鳢在外观上非常相似，尤其在其仔稚鱼和幼鱼阶段，从外部形态上难以区分性别和品种。因此在开展杂交鳢全雄育种技术相关研究中，筛选出与性别和品种相关的分子标记成为了关键。近年来，测序技术得到迅猛发展，高通量测序成本变得越来越低。基于高通量测序技术，越来越多经济鱼类的性别分子标记被发现，如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)、金钱鱼(Scatophagusargus)、大刺鳅(Mastacembelus armatus)、以及红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)等。
迄今为止，尽管国内外虽有能够成功鉴定乌鳢、斑鳢遗传性别的分子标记的报道，但是主要是单核苷酸多态性标记，实际使用比较困难，要么是群体特异性的，适用范围较窄。也就是说，还没有一种性别标记可以同时适用于乌鳢、斑鳢和杂交鳢，并且还能够将其品种区分出来。因此，开发一种简便且能准确鉴定遗传性别的分子标记在鳢科鱼类全雄育种中具有极大的生产应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记，能够简便且准确的鉴定乌鳢、斑鳢或杂交鳢的遗传性别和品种；在筛选获得通用分子标记的基础上，所建立的PCR鉴别方法可在乌鳢、斑鳢或杂交鳢雌雄个体的基因组DNA中扩增特异的片段，从而达到区分乌鳢、斑鳢或杂交鳢遗传性别和品种的目的。
本发明首先提供雄性乌鳢和雄性斑鳢Y染色体上的特异核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
本发明再一个方面还提供检测上述特异核苷酸片段的分子标记的一种用途，是在鉴定乌鳢、斑鳢或杂交鳢的遗传性别和品种中的应用；
所述的分子标记，其一种为PCR扩增引物；
作为本发明一个实施例的具体记载，所述的PCR扩增引物对，序列信息如下：
Marker-F：5′-GAAGCAAGTAGAAGGAAAGAAG-3′，
Marker-R：5′-CTTTCCTCCCACACACATAG-3′。
本发明还提供一种鉴定乌鳢、斑鳢或杂交鳢的遗传性别和品种的方法，是使用PCR扩增引物来进行扩增上述特异核苷酸片段的全部或部分片段，根据扩增DNA条带大小和数量确定其性别和品种。
其中乌鳢和斑鳢在雄性个体中有特异扩增片段，使用上述的引物对的扩增产物在雄性乌鳢中特异性片段大小为1156bp，雄性斑鳢中片段大小为1147bp；
而雌性杂交鳢中扩增出2条DNA条带，雄性杂交鳢中能够扩增出3条DNA条带，其中一条是雄性亲本对应的条带，另外两条带(～200bp和～500bp)分别为斑鳢和乌鳢中的常染色体扩增片段。
本发明的引物对还可以用于金乌鳢或白甲乌鳢的雌雄性别鉴定。
本发明与现有技术相比的有益效果：
(1)本发明基于乌鳢和斑鳢的雌、雄样本的全基因组重测序数据，利用基因组组装、比对和深度分析等方法，筛选出乌鳢和斑鳢Y染色体中一段4-5kb比较保守的雄性特异插入片段，设计了用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记引物，该引物可对乌鳢、斑鳢或杂交鳢性别和品种进行快速准确地鉴定；
(2)本发明的引物扩增稳定性高，效率高，鉴定成本低，且适用范围广，能用于进行乌鳢(包括金乌鳢等表型变异品系)、斑鳢、乌斑鳢、斑乌鳢以及它们XX伪雄鱼、XY伪雌鱼和YY超雄鱼的遗传性别鉴定。
附图说明
图1为开发用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记引物的生物信息学分析流程。
图2为乌鳢和斑鳢的雄性特异序列分别与雌性参考基因组性染色体的同源性分析结果图。
图3为通用分子标记引物在乌鳢不同种群(山东省济宁市和江苏省连云港市)雌雄个体中进行验证的电泳图。
图4为通用分子标记引物在金乌鳢(山东省临沂市)雌雄个体中进行验证的电泳图。
图5为通用分子标记引物在斑鳢(广东省佛山市)雌雄个体中进行验证的电泳图。
图6为通用分子标记引物在斑乌鳢(广东省佛山市)雌雄个体中进行验证的电泳图。
具体实施方式
本发明利用乌鳢和斑鳢的雌、雄样本的全基因组重测序数据，对雄性基因组进行组装后，对比雌性基因组版本，利用图1所示的生物信息学分析流程，获得了乌鳢和斑鳢Y染色体中一段4-5kb比较保守的雄性特异插入片段，在这一雄性特异插入片段设计引物，开发雌雄性别和品种鉴定的通用分子标记。利用设计合成的引物，对乌鳢、斑鳢或杂交鳢的雌雄样本进行PCR扩增，根据扩增DNA条带大小和数量确定其性别和品种。
本发明实施例中所述的用于乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的通用分子标记引物序列如下所示：Marker-F：GAAGCAAGTAGAAGGAAAGAAG，Marker-R：CTTTCCTCCCACACACATAG。
其中特异性片段仅在雄性个体中有扩增，乌鳢中特异性片段大小为1156bp，斑鳢中片段大小为1147bp，杂交鳢中与其父本长度一致。雌性杂交鳢中扩增出2条DNA条带，雄性杂交鳢中能够扩增出3条DNA条带。
但还可以针对所筛选的特异性片段来设计其它引物对，该引物对的扩增产物能够区分乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种。
本发明还提供一种利用所述引物进行乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种鉴定的方法，所述方法运用PCR扩增技术在乌鳢、斑鳢或杂交鳢雌雄个体的基因组DNA中扩增特异的片段；
所述PCR反应体系如下：DNA模板(50ng/μL)1μl，Taq Plus Master Mix II(2×)10μL，正向/反向引物(10μM)各1μL，dd H2O补齐至20μL；
所述PCR反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15sec，52℃退火20sec，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃延伸5min；待PCR反应结束后琼脂糖凝胶进行电泳，根据扩增DNA条带大小和数量确定其性别和品种，其中特异性片段仅在雄性个体中有扩增，乌鳢中特异性片段大小为1156bp，斑鳢中片段大小为1147bp，杂交鳢中与其父本长度一致。雌性杂交鳢中扩增出2条DNA条带，雄性杂交鳢中能够扩增出3条DNA条带。
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
对乌鳢、斑鳢性别特异性序列的鉴定，筛选鉴定的总体工作流程如图1所示，其中主要包含全基因组重测序、雄性基因组组装、参考基因组比对、性别特异性序列筛选鉴定的步骤，具体如下：
1、利用已知性别的20尾雌性和20尾雄性乌鳢以及12尾雌性和12尾雄性斑鳢为样品，取鳍条组织，使用海洋动物基因组抽提试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP324)提取总DNA并建库进行全基因组重测序(WGS)。
2、通过Fastp(v 0.20.0)软件对乌鳢和斑鳢WGS数据进行过滤去除低质量序列，然后使用Masurca软件(v 4.0.5)分别对乌鳢和斑鳢的雄性WGS数据进行组装，构建乌鳢和斑鳢的雄性参考基因组。
3、对雄性参考基因组质量进行评估后，使用BWA(v 0.7.17)mem模式(参数：mem-t4-k 32-M-R)将雌性和雄性测序数据分别比对到雄性参考基因组。使用SAMtools(v 1.10)(参数：-bS-t)，将比对文件转换为BAM格式。然后，SAMtools的“depth”命令对BAM文件中每个位置的覆盖率和深度信息进行统计。其中，在所有雄性样本均有覆盖而在所有雌性样本中均没有覆盖深度的位置为雄性特异性序列。
4、通过Blast比对筛选乌鳢和斑鳢中保守的雄性特异序列，其中，核苷酸序列为SEQ ID NO:1的片段为乌鳢雄性特异片段，其长度～4.7kb；核苷酸序列为SEQ ID NO:2的片段为斑鳢雄性特异片段，其长度～4.0kb。
将乌鳢和斑鳢的雄性特异序列分别与雌性基因组性染色体进行同源性分析，如图2所示。在乌鳢和斑鳢保守区域设计通用性别鉴定分子标记引物，其上游引物Marker-F的序列为GAAGCAAGTAGAAGGAAAGAAG(SEQ ID NO:3)，Marker-R：CTTTCCTCCCACACACATAG(SEQ IDNO:4)。
实施例2
本实施例的实施对象是不同地理种群(山东省济宁市和江苏省连云港市)的乌鳢成鱼，通过解剖方法鉴别了雌雄性别，然后取45个雌性和45个雄性用来验证本发明的标记的可靠性。
1、DNA样本的制备
将保存在无水乙醇中的鳍条组织取出，采用常规柱式离心法(海洋动物组织基因组提取试剂盒，天根生化科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(QuickDrop)进行质量和浓度检测。
2、性别和品种鉴定的通用分子标记的扩增
以Marker-F和Marker-R为引物，以提取的不同地理种群(济宁和连云港)的乌鳢DNA为模板，模板终浓度是50ng/μL，用Taq PCR Mix预混液对片段进行扩增验证，PCR的反应体系如表1所示。
表1：PCR的反应体系表
反应条件为：95℃，3min；95℃，15sec；52℃，20sec；72℃；1.5min，35cycles；72℃，5min，4℃，∞。待PCR反应结束后琼脂糖凝胶进行电泳。验证结果如图3所示。雄鱼中扩增的1156bp片段的序列为SEQ ID NO:5。
实施例3
本实施例的实施对象为取自山东省临沂市的1龄金乌鳢，雌雄各15尾，其它方法步骤如实施例2，验证结果如图4。从图4可以看出本发明引物和方法同样适用于金乌鳢的性别鉴定。
实施例4
本实施例的实施对象为取自广东省佛山市的斑鳢成鱼，雌雄各15尾，其它方法步骤如实施例2，验证结果如图5。从图5可以看出本发明引物和方法同样适用于斑鳢的性别鉴定。其中雄鱼中的特异性的1142bp片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
实施例5
本实施例的实施对象为取自广东省佛山市的杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂，斑乌鳢)，雌雄各15尾，其它方法步骤如实施例2，验证结果如图6，在雌性杂交鳢中能够扩增2条带(～200bp和～500bp)，而雄性杂交鳢中则扩增出3条，其中多出1条与雄性乌鳢一致的条带(1156bp)。从图6可以看出在本发明引物和方法不仅能够鉴别杂交鳢的性别，同时产生的条带数量与乌鳢(图3)和斑鳢(图5)均不同。根据图3-图6中PCR所扩增出条带的数量和长度，也可以快速区分出乌鳢、斑鳢和杂交鳢。其中，在雌性乌鳢中扩增出1个常染色体片段(～200bp)，雄性乌鳢中扩增出2个，包括常染色体片段和雄性特异片段(1156bp)；在雌性斑鳢中扩增出1个常染色体片段(～500bp)，雄性斑鳢中扩增出2个，包括常染色体片段和雄性特异片段(1147bp)；而在雌性杂交鳢中能够扩增出其父母本的常染色体片段2个(～200bp和～500bp)，雄性杂交鳢中则扩增出3个，包括其父母本的常染色体片段2个以及与其雄性亲本一致的特异片段。
综上，本发明利用全基因组重测序的方法来寻找乌鳢、斑鳢的性别特异性序列，并以通过特异序列设计获得可用于鉴定乌鳢、斑鳢、杂交鳢性别和品种的通用分子标记PCR引物。
Claims (10)
1.一种雄性乌鳢Y染色体上的特异核苷酸片段，其特征在于，所述的特异核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1。
2.一种雄性斑鳢Y染色体上的特异核苷酸片段，其特征在于，所述的特异核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2。
3.检测权利要求1和/或权利要求2所述的特异核苷酸片段的分子标记在制备用于鉴定乌鳢、斑鳢或杂交鳢的遗传性别和品种的检测制品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的分子标记，为PCR扩增引物。
5.一种用于鉴别权利要求1和/或权利要求2所述的特异核苷酸片段的PCR扩增引物对，特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3，下游引物的序列为SEQ IDNO:4。
6.一种鉴定鉴定乌鳢、斑鳢、金乌鳢、白甲乌鳢或杂交鳢的遗传性别和品种的方法，其特征在于，所述的方法是使用扩增引物来扩增权利要求1和/或权利要求2所述的特异核苷酸片段的全部或部分片段，根据扩增DNA条带大小和数量确定其性别和品种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ IDNO:3，下游引物的序列为SEQ ID NO:4。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的引物对的扩增产物在雄性乌鳢中特异性片段大小为1156bp，雄性斑鳢中片段大小为1147bp。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的引物对在雌性杂交鳢中扩增出2条DNA条带，雄性杂交鳢中扩增出3条DNA条带。
10.一种用于鉴定乌鳢、斑鳢或杂交鳢的遗传性别和品种的PCR扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求5所述的引物对。
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