CN106480226A

CN106480226A - 乌鳢雄性分子标记引物及应用

Info

Publication number: CN106480226A
Application number: CN201611247108.6A
Authority: CN
Inventors: 阮惠云
Original assignee: WUHAN DABANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN DABANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2017-03-08

Abstract

本发明属于水产生物技术领域，具体提供了乌鳢雄性分子标记引物及应用，所述引物是基于分子标记Contig‑359642和Contig‑418354设计的，具体为：Contig‑359642上游引物：TATGTAGCCACCACTGTCTGC，Contig‑359642下游引物：GGGTGGAGTCTGTCCTGCT。Contig‑418354上游引物：TTTCAAAACAAATACTCCCTC，Contig‑418354下游引物：TGAACCAGGCACAAACTTA。利用本发明提供的引物可对乌鳢的性别进行快速准确的鉴定，乌鳢或斑乌鳢全雄单性育种提供了基础。

Description

乌鳢雄性分子标记引物及应用

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中鱼类性别鉴定技术，更具体涉及乌鳢雄性分子标记引物及应用，利用本发明提供的引物可对乌鳢进行性别鉴定，在全雄乌鳢、全雄斑乌杂交鳢育种和苗种持续规模化生产中具有重要的应用价值，同时在其它生物全雄育种及苗种生产中也具有应用前景。

背景技术

乌鳢(Channa argus Cantor，1842)，属鲈形目(Perciformes)，鳢科(Channidae)，鳢属(Channa)，俗名为生鱼、黑鱼等。因其肉嫩刺少，蛋白质含量丰富，且具有生肌补血等药用价值，耐低氧能力强，2014年乌鳢年产量达到510340吨，位列中国淡水鱼类的第十位，是中国重要的淡水经济鱼类。乌鳢雌核发育研究结果，推测乌鳢性别遗传机制为雄鱼异配。乌鳢雄性比雌性生长快，同龄商品规格的成鱼，雄性的体重平均比雌性大30％，乌鳢全雄单性育种及规模化定向养殖具有更高的经济效益。

雄性异配鱼类的全雄单性育种首先得制备出超雄鱼，获得超雄鱼可通过几种途径，如生理雌鱼诱导性逆转、雄核发育等，但关键是如何经济、快速、准确地鉴定。传统的方法是通过测交实验，依据子代性别比例来判断父本的性染色体组成，即是XY还是YY。由于测交实验一是时间耗费长，通过解剖能识别乌鳢性腺至少需要四个月；二是规模化成本高，每组测交子代的单独养殖占用巨大的养殖资源。对于乌鳢全雄单性育种及规模化定向养殖，经济、快速、准确地鉴定乌鳢超雄鱼至关重要。

目前关于乌鳢性染色体的研究很少，未见关于其异形性染色体的报道，已有的性别分子标记未能严格区分雌、雄性乌鳢。在其它鱼类，遗传育种学家们运用不同的分子标记技术在鱼类中已经找到了一些性别特异的或性别连锁的DNA片段，例如大西洋鲑(Salmosalar L.)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、青鳉(Oryzias latipes)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，但基本上都是运用SSR和AFLP分子标记开发技术获得。这些分子标记开发方法花费高、工作量大，耗时长。

限制位点相关DNA(restriction site associated DNA，RAD)测序技术应用于鱼类性别标记的开发，在斑马鱼(Danio rerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、太平洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus L.)、肉色平鲉(Sebastes carnatus)和黄黑平鲉(Sebastes chrysomelas)等鱼类中筛选出了性别相关的分子标记。该技术是基于对全基因组中伴随每个位点特异的限制性内切酶的小DNA片段进行标记，受限制性酶切位点的限制，常需要几种限制性内切酶酶切。

本发明基于雌雄乌鳢基因组高通量测序数据，利用基因组组装和基因组比对等生物信息学分析方法，在基因组范围内快捷、准确筛选乌鳢雄性分子标记。

发明内容

本发明的目的在于提供乌鳢雄性分子标记引物，本发明提供了基于分子标记Contig-359642和Contig-418354设计的引物，其中：

Contig-359642上游引物：TATGTAGCCACCACTGTCTGC

Contig-359642下游引物：GGGTGGAGTCTGTCCTGCT

Contig-418354上游引物：TTTCAAAACAAATACTCCCTC

Contig-418354下游引物：TGAACCAGGCACAAACTTA。

本发明的另一个目的在于提供了乌鳢雄性分子标记引物的应用，包括利用所述引物进行乌鳢的性别鉴定以及乌鳢及斑乌鳢全雄单性育种及规模化定向养殖。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

乌鳢雄性分子标记引物的获得：

申请人通过：一)雌雄乌鳢基因组高通量测序；二)Y染色体特异DNA片段的富集；三)Y染色体连锁(雄性)分子标记的筛选；四)雄性分子标记的进一步验证四个步骤，获得了乌鳢雄性分子标记Contig-359642和Contig-418354，针对两个分子标记设计的引物为：

Contig-359642上游引物TATGTAGCCACCACTGTCTGC

Contig-359642下游引物GGGTGGAGTCTGTCCTGCT

Contig-418354上游引物TTTCAAAACAAATACTCCCTC

Contig-418354下游引物TGAACCAGGCACAAACTTA。

乌鳢雄性分子标记引物的应用，包括利用Contig-359642分子标记引物或Contig-418354分子标记引物对乌鳢的性别进行鉴定或对乌鳢(或斑乌鳢)进行全雄单性育种及规模化定向养殖，或是联合Contig-359642分子标记引物和Contig-418354分子标记引物对乌鳢的性别进行鉴定或对乌鳢(或斑乌鳢)进行全雄单性育种及规模化定向养殖。

本发明的优点是简单、快捷、准确。其特点是：

1.运用1尾雌鱼、1尾雄鱼和48尾雌鱼DNA混合池进行高通量测序；

2.采用一尾雌鱼基因组测序reads经过组装作为reference，雄鱼Kmer-60作为query进行比对，再将不能与reference比对的雄鱼Kmer-60进行组装，获得雄鱼基因组特异性Contig；

3.然后以雄鱼基因组特异性Contig为reference，雌鱼DNA混合池测序reads为query进行比对，富集得到196条包含来自Y染色体的特异DNA片段的Contig；

4.最后通过雌雄鱼DNA混合池的引物筛选、雌雄鱼个体DNA的引物筛选，获得乌鳢雄性分子标记。

附图说明

图1为雄鱼特有Kmer-60的获得示意图。

图2为雄鱼特有候选片段长度分布情况示意图。

图3为Y染色体特有片段获取示意图。

图4为Y染色体特有片段长度分布情况示意图。

图5为雌、雄混合池中均获得目的条带引物的PCR产物示意图。

图6为引物Contig-359642F/R的雌、雄个体检测PCR产物电泳图

图中展示了其中的48尾的检测结果。

图7为引物Contig-418354F/R的雌、雄个体检测PCR产物电泳图

图中展示了其中的48尾的检测结果。

图8为引物Contig-359642F/R和Contig-418354F/R在其他来源36尾乌鳢个体PCR检测电泳图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

乌鳢雄性分子标记的获得：其步骤包括：

一)测序文库构建及重测序

1.乌鳢DNA样品制备：

繁殖期间剪取乌鳢雌、雄各96个个体尾尾鳍，依次按雌鱼F1-F96、雄鱼M1-M96编号，采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品，并用1％琼脂塘凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop2000)进行质量和浓度检测，达到高通量测序的要求。

2.测序文库构建和高通量测序：

取雌鱼F1、雄鱼M1DNA样品，构建400-500bp片段测序文库，利用Illumina Hiseq XTen平台进行双末端(Paired-End)PE150测序，分别获得F1、M1基因组测序clean data53.99G(359,946,114reads)和54.17G(361,160,556reads)。

从F2-F49共48份DNA样品中，取等量混匀成雌鱼DNA混合池，构建400-500bp片段测序文库，利用Illumina Miseq平台进行双末端PE150测序，获得雌鱼DNA混合池测序cleandata5.91G(38,487,986reads)。

文库构建具体步骤参考NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina说明书，测序由深圳华大基因科技服务有限公司完成。

二)Y染色体特异DNA片段的富集

1.包括雌鱼基因组Contig组装：

运用SOAPdenovo2软件(https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo2)中all方法对雌鱼F1测序reads进行基因组组装，共获得784,393条雌鱼Contig，总大小为651Mb，其中N50＝3.9Kb，N80＝1.1Kb；获得507,119条雌鱼Scaffold，总大小为678Mb，其中N50＝37.0Kb，N80＝9.0Kb(图1)。

2.雄鱼特异性DNA片段获得：

在雄鱼M1每条read的特定位置(起始坐标：11，终止坐标：70)截取一段60nt的序列，生成雄鱼Kmer-60。以雌鱼F1基因组Contig作为reference，雄鱼Kmer-60作为query，采用Bowtie2软件(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)进行序列比对(图2)，弃掉能够比对的Kmer-60(图2中整齐排列的浅蓝色的Kmer-60)，收集不能比对的Kmer-60(图2中随机排列的深蓝色的Kmer-60)，获得271,700,328条不能比对上雌鱼reference的雄鱼Kmer-60,这就是雄鱼特有的Kmer-60。

采用IDBA(Iterative De Bruijn Graph Assembler)软件(http://i.cs.Hku.hk/ ～alse/hkubrg/projects/idba/index.html)对271,700,328条雄鱼特有的Kmer-60进行组装，获得515,091条雄鱼Contig。雄鱼Contig主要分布于250-500bp，占总数的77.10％；长度≧1500bp的Contig占总数的0.26％。由此获得雄鱼基因组特异性Contig(图3)。

3.Y染色体特异DNA片段的富集：

以雄鱼基因组特异性Contig为reference，雌鱼DNA混合池测序reads(150bp)为query，采用Bowtie2软件进行序列比对。比对结果显示，雌鱼DNA混合池中的reads能与雄鱼reference中的大部分Contig成功比对，仅有196条雄鱼Contig没有任何一条雌鱼DNA混合池的read能比对得上。这些雄鱼Contig(196条)的长度主要分布于220-340bp，占总数的77.04％；长度≧580bp的Contig占总数的6.63％。这196条Contig中包含来自Y染色体的特异DNA片段(图4)。

三)Y染色体连锁分子标记的筛选

1.引物设计与合成：

基于上述196条雄鱼Contig序列，采用Primer5软件(软件使用参照PrimerPREMIER Version5.0for Windows and Power Macintosh)设计PCR引物，引物按Contig-xxF/R编号(xx代表Contig号码)，如Contig-107794的引物编号为Contig-107794F/R(F代表上游引物，R代表下游引物，下同)。引物由生工(上海)生物工程公司合成。

2.Y染色体连锁片段富集：

从F1-F96和M1-M96DNA样品中取等量混匀成雌鱼DNA混合池和雄鱼DNA混合池，以混合池DNA为模板，196对引物分别进行PCR扩增。PCR扩增反应总体系为20μl，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng。PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，39个循环，72℃终延伸2min。PCR反应完成，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，结果：14对引物仅在雄鱼DNA混合池中获得扩增条带；142对引物在雄鱼DNA混合池和雌鱼DNA混合池中均能获得相同大小的扩增条带(图5)；其余40对引物在雌、雄鱼DNA混合池中均未获得扩增条带。经过96对引物在雌雄鱼DNA混合池进行PCR扩增，富集了14条contig可能是Y染色体连锁片段。

3.Y染色体连锁分子标记的筛选及确认：

选择上述中的14对引物分别对雌雄各96尾个体进行PCR检测，PCR扩增反应总体系为20μl，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng。PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，39个循环，72℃终延伸2min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，2对引物在雄性个体中均扩增出同样大小的片段，在雌性个体中均未检测到扩增片段，两对引物分别为Contig-359642F/R(图6)和Contig-418354F/R(图7)，代表它们分别对应的Contig是Contig-359642和Contig-418354，其余12对引物在雌雄群体中的检测结果并未呈现明显规律，难以严格区分雌雄性别。

切下来自Contig-359642F/R和Contig-418354F/R扩增的琼脂糖凝胶电泳条带，用Gel Extraction Kit(Omega公司)回收，回收产物链接到商业载体pMD18-T(Takara公司)，采用标准方法转化到大肠杆菌DH5α(北京全式金生物技术有限公司)，常规PCR法筛选含有目标片段的阳性克隆，擎科创新生物科技有限公司进行Sanger测序。测序结果显示，PCR扩增序列与Contig-359642和Contig-418354引物涵盖的序列一致。说明Contig-359642、Contig-418354为乌鳢Y染色体连锁片段，是乌鳢的雄性分子标记。针对Contig-359642和Contig-418354分别设计引物，具体为：

Contig-359642上游引物TATGTAGCCACCACTGTCTGC，

Contig-359642下游引物GGGTGGAGTCTGTCCTGCT。

Contig-418354上游引物TTTCAAAACAAATACTCCCTC，

Contig-418354下游引物TGAACCAGGCACAAACTTA。

实施例2：

乌鳢雄性分子标记引物的应用，包括下述步骤：

1.DNA样品制备：

从武汉市水果湖生鲜市场购买经目测已性成熟的乌鳢，经解剖得到雌、雄性别乌鳢各36尾。分别剪取尾鳍，同样采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品。

2.PCR扩增验证：

采用引物Contig-359642F/R和Contig-418354F/R分别对上述雌、雄各36个乌鳢DNA样品进行PCR扩增验证。

PCR扩增反应总体系为20μl，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng。

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，39个循环，72℃终延伸2min。

PCR反应结束，产物经琼脂糖凝胶电泳，结果：引物Contig-359642F/R和Contig-418354F/R在36尾雄鱼DNA样品中均能扩增出条带，在36尾雌鱼DNA样品中均不能扩增出条带(图8)。表明分子标记Contig-359642和/或Contig-418354可用于鉴定乌鳢的性别鉴定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉达邦生物科技有限公司

<120> 乌鳢雄性分子标记引物及应用

<130> 乌鳢雄性分子标记引物及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tatgtagcca ccactgtctg c 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggtggagtc tgtcctgct 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttcaaaaca aatactccct c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgaaccaggc acaaactta 19

Claims

1.乌鳢雄性分子标记引物：Contig-359642上游引物：TATGTAGCCACCACTGTCTGC，Contig-359642下游引物：GGGTGGAGTCTGTCCTGCT。

2.乌鳢雄性分子标记引物：Contig-418354上游引物：TTTCAAAACAAATACTCCCTC，Contig-418354下游引物：TGAACCAGGCACAAACTTA。

3.一种用于鉴定乌鳢性别的试剂盒，包括引物：Contig-359642上游引物：TATGTAGCCACCACTGTCTGC，

Contig-359642下游引物：GGGTGGAGTCTGTCCTGCT，Contig-418354上游引物：TTTCAAAACAAATACTCCCTC，Contig-418354下游引物：TGAACCAGGCACAAACTTA。

4.权利要求1或权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在鉴定乌鳢性别中的应用。

5.权利要求1或权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在乌鳢或斑乌鳢全雄单性育种中的应用。