CN103789441B - 一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 - Google Patents

一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法，利用日本海马和三斑海马的EST序列，共设计了六对SSR分子标记引物，分别为Hmo48、Hmo421、Hmo242、Hmo244、Htr6和Htr8，其中Hmo242和Hmo244属于日本海马与三斑海马共有引物；Hmo48和Hmo421属于日本海马特有引物，Htr6和Htr8属于三斑海马特有引物。提取海马DNA，利用以上引物对其进行PCR扩增。本发明公开的引物在两个海马种群间特异性极高，稳定性极强，因此将PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳检测，可快速判断海马种群，为海马遗传多样性的保护与良种的引进提供了参考。

Description

一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法
技术领域
本发明属于鉴定鱼类物种的分子技术领域，具体涉及一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法。
背景技术
海马（Hippocampus）隶属海龙科、海马属，属国际海洋保护动物，部分种类因环境恶化和人类活动而濒临灭绝。海马是重要的水族观赏动物和名贵的中药材，具有强身健体、补肾壮阳、舒筋活络、消炎止痛、镇静安神、止咳平喘等药用功能，特别是对于治疗神经系统的疾病更为有效，深受东南亚国家的青睐。
海马在世界范围内分布广泛，我国共有13种天然海马，近年来，随着人工养殖海马技术的成功，海马已成为我国海水养殖产业的新星。日本海马和三斑海马是我国目前养殖的重要海马种。由于海马人工繁殖技术的不规范，导致了海马种群的高度近亲繁殖，遗传多样性水平严重降低，优良品种选育已成为当前海马养殖的重要议题。
本发明专利提供了一种稳定性高，快速便捷的两种海马种群鉴别的分子标记方法。本方法开发了两个海马种群间特异性极高，稳定性极强的SSR引物，因此不需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳片段分离，只需要进行常规的琼脂糖凝胶电泳检测即可。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种海马的SSR分子标记引物，本方法开发的两个海马种群间特异性极高，稳定性极强的SSR引物，不需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳片段分离，只需要进行常规的琼脂糖凝胶电泳检测即可完成对种群的快速鉴定。
本发明的另一个目的在于提供了一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法，方法简单，鉴定结果准确，用时短，耗材少，费用低，比片段分离的多态性分析法更为准确实用。
本发明最后一个目的在于提供了一种海马的SSR分子标记引物在日本海马（H.mohnikei）和三斑海马（H.trimaculatus）种群鉴定中的应用。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种海马种群的SSR分子标记引物，引物信息如下：
一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法，其步骤如下：
1）提取待鉴定海马的DNA；
2）用6对引物对海马个体DNA模板进行PCR扩增；
3）对6对引物的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
4）记录6对引物各自的电泳条带信息，进行分析，鉴定种群所属。
一种分子标记引物在日本海马和三斑海马种群鉴定中的应用，其应用过程如下：利用本发明中引物对Hmo242和Hmo244在日本海马与三斑海马中都可扩增出高质量SSR产物；引物对Hmo48和Hmo421仅可在在日本海马中扩增出高质量的SSR产物，在三斑海马中无扩增产物；引物对Htr6和Htr8仅可在在三斑海马中扩增出高质量的SSR产物，在日本海马中无扩增产物。因此，根据琼脂糖凝胶电泳结果分析：若海马个体DNA在Hmo48、Hmo421、Hmo242和Hmo244四对引物PCR扩增后有高质量产物，在Htr6和Htr8两对引物PCR扩增后无扩增条带，则此个体为日本海马；若海马个体DNA在Hmo242、Hmo244、Htr6和Htr8四对引物PCR扩增后有高质量产物，在Hmo48和Hmo421两对引物PCR扩增后无扩增条带，则此个体为三斑海马。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次针对海马，发明了一种鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法，弥补了形态学鉴别的不足，为海马遗传多样性的保护与良种的引进提供了参考。
附图说明
图1为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo48条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马，6、7、8、9、10为三斑海马。
图2为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo421条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马，6、7、8、9、10为三斑海马。
图3为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo242条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马，6、7、8、9、10为三斑海马。
图4为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Hmo244条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马，6、7、8、9、10为三斑海马。
图5为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Htr6条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马，6、7、8、9、10为三斑海马。
图6为日本海马与三斑海马DNA模板在引物Htr8条件下RCR扩增后的琼脂糖电泳结果示意图。
图中1、2、3、4、5为日本海马，6、7、8、9、10为三斑海马。
具体实施方式
实施例1：
海马SSR分子标记引物设计
本发明中引物对Hmo48、Hmo421、Hmo242和Hmo244是根据日本海马EST序列设计得到；引物Htr6和Htr8是根据三斑海马EST序列设计得到，具体信息如下：
实施例2：
一种分子标记引物在日本海马和三斑海马种群鉴定中的应用，其应用过程如下：
1）通过形态学鉴定方法（Lourie et al.,1999），选取日本海马和三斑海马两个海马种群各30个个体，作为鉴定样品；
2）使用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取各海马样本的DNA；
3）应用实施例1中的6对引物对各个海马样本DNA模板进行PCR扩增；
PCR反应体系为10μl体系：
PCR反应过程为：94℃预变性5min，30个循环（94℃变性35s，退火35s，72℃延伸45s），72℃后延伸8min，16℃保存。
用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果判断标准如下：本发明中引物对Hmo242和Hmo244在日本海马与三斑海马中都可扩增出高质量SSR产物；引物对Hmo48和Hmo421仅可在日本海马中扩增出高质量的SSR产物，在三斑海马中无扩增条带；引物对Htr6和Htr8仅可在三斑海马中扩增出高质量的SSR产物，在日本海马中无扩增条带。
因此，根据琼脂糖凝胶电泳结果分析：若海马个体DNA在Hmo48、Hmo421、Hmo242和Hmo244四对引物PCR扩增后有明显条带，在Htr6和Htr8两对引物PCR扩增后无明显条带，则此个体为日本海马；若海马个体DNA在Hmo242、Hmo244、Htr6和Htr8四对引物PCR扩增后有明显条带，在Hmo48和Hmo421两对引物PCR扩增后无明显条带，则此个体为三斑海马。
对6对引物的PCR扩增产物进行浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳；电泳结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示；图中个体1、2、3、4、5为日本海马，个体6、7、8、9、10为三斑海马；电泳结果显示：日本海马群体的5个个体电泳结果完全符合鉴定原则；三斑海马5个个体电泳结果也完全符合鉴定结果。
利用本发明的SSR分子标记的方法对日本海马和中国海马的鉴定结果，与形态学的鉴定方法完全相符。
本方法中海马样本鉴定结果准确，用时短，耗材少，费用低，比片段分离的多态性分析法更为准确实用。
         SEQUENCE LISTING
 
<110>华中农业大学
 
<120>一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法
 
<130>一种用于鉴别两个海马种群的SSR分子标记方法
 
<160>  12
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  1
ccaaacctgctacacgacat                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  2
cacaaagcaagcaagaaagc                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  3
cagttcagggtgtcgtcg                                                   18
 
 
<210>  4
<211>  25
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  4
acagttctaatagtttgatttcgtt                                           25
 
 
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  5
ggacttttgtgacaaggaga                                                 20
 
 
<210>  6
<211>  21
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  6
gtgccaagttgtcttatcag t                                               21
 
 
<210>  7
<211>  21
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  7
tctttggagcttagaaggct a                                               21
 
 
<210>  8
<211>  21
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  8
aagatcttgctcaaagaatc c                                               21
 
 
<210>  9
<211>  18
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  9
ttggtttcgcactgacat                                                   18
 
 
<210>  10
<211>  25
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  10
atagttgggagtattgttacattat                                           25
 
 
<210>  11
<211>  20
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  11
ggctactcaggcgacaaaac                                                 20
 
 
<210>  12
<211>  20
<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  12
gcggaaaatcttcgctattc                                                 20

Claims (2)

1.一种鉴别日本海马与三斑海马的SSR分子标记方法，具体步骤如下：
1)提取待鉴定海马的DNA；
2)用以下6对引物对海马个体DNA模板进行PCR扩增；
Hmo48F:CCAAACCTGCTACACGACAT
R:CACAAAGCAAGCAAGAAAGC
Hmo421F:CAGTTCAGGGTGTCGTCG
R:ACAGTTCTAATAGTTTGATTTCGTT
Hmo242F:GGACTTTTGTGACAAGGAGA
R:GTGCCAAGTTGTCTTATCAGT
Hmo244F:TCTTTGGAGCTTAGAAGGCTA
R:AAGATCTTGCTCAAAGAATCC
Htr6F:TTGGTTTCGCACTGACAT
R:ATAGTTGGGAGTATTGTTACATTAT
Htr8F:GGCTACTCAGGCGACAAAAC
R:GCGGAAAATCTTCGCTATTC；
3)对6对引物的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；
结果判断标准如下：引物对Hmo242和Hmo244在日本海马与三斑海马中都可扩增出高质量SSR产物；引物对Hmo48和Hmo421在日本海马中扩增出高质量的SSR产物，在三斑海马中无扩增条带；引物对Htr6和Htr8在三斑海马中扩增出高质量的SSR产物，在日本海马中无扩增条带。
2.权利要求1所述的方法在日本海马和三斑海马种群鉴定中的应用。
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