CN105256050B - 杏鲍菇复合群est-ssr分子标记特异引物体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了杏鲍菇复合群EST‑SSR分子标记特异引物体系，它是采用5对分子标记特异引物，在检测过程中同时使用，在30个杏鲍菇复合群菌种中有多态性，在30个杏鲍菇复合群中进行的遗传多样性分析与侧耳属白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇的分类常识相吻合，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的5对引物对应用于更多杏鲍菇复合群上，进行种质资源和遗传多样性分析，5对分子标记特异引物均来自于杏鲍菇复合群发育相关基因EST序列，为克隆杏鲍菇复合群发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础，并且大大缩短了分析周期，提高研究效率，对食用菌分子标记选择育种的发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其在鉴别杏鲍菇复合群的不同菌株的用途。
技术背景
杏鲍菇（Pleurotus eryngii），又名刺芹侧耳，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鲍鱼的口感而得名。是近年来开发栽培成功的及食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。阿魏菇（Pleurotus ferulae）又名阿魏侧耳、阿魏蘑，属担子菌亚门层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属，是干旱草原上具有代表性的蕈菌。由于其子实体脆嫩可口，香味浓郁，有草原牛肝菌的美称；又因其具有消积、杀虫、治疗肉积、痞块、久疟、疳劳等药效，当地群众誉之为天山神菇和西天白灵芝。白灵菇(Pleurotus eryngii subsp. tuoliensis) 是白灵侧耳的商品名称，隶属于真菌门、担子菌亚门、真菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是近年来逐渐发展起来的食用菌新秀之一。
杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇形态相似，且遗传关系尚不明确。有研究人员认为，阿魏蘑与白灵菇为刺芹侧耳种下的2个变种，但也有人认为，这三者分别为不同的种。白灵菇与阿魏蘑在外观和口感上均很接近，人们易将两者混淆。但实际上它们是亲缘关系非常近的两个种。利用PCR 产物克隆测序测定了阿魏菇、白灵菇与杏鲍菇rDNA 内转录间隔区( ITS)的序列，测序比对结果表明，阿魏蘑、白灵菇和杏鲍菇三者之间亲缘关系较近，其中白灵菇与杏鲍菇具有非常近的亲缘关系,但阿魏蘑、白灵菇和杏鲍菇为3个不同的种。因此，本发明中暂称三个菌种为杏鲍菇复合群。
食用菌最早是采用形态学特征为分类依据，虽然形态特征能在一定程度上进行很好的类群的划分，但子实体的形态特征易受外界环境条件的影响，因而很不稳定。因此，形态鉴别不能准确反映被鉴定物种的分类地位。除了形态学分类外，还有利用拮抗试验、同工酶分析来进行菌株的鉴定，但是他们都各自有一些缺点，受影响的因素很多，还需要辅助其他试验才能将菌株鉴别清楚。
近年来，随着分子生物学和生物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的发展。目前，用于作物种质资源鉴定的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但对于核心种质构建、基因性状鉴定、品种指纹图谱建库等研究，SSR分子标记是公认的最佳方法。开发SSR标记主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等。其中数据库搜索法,尤其是从表达序列标签(EST)数据库中搜索，开发EST-SSR标记，已经成为一种广为采用的方法。EST-SSR标记相对于基因组SSR标记而言，由于其来自于转录谱，能够反映出转录区的差异，使EST-SSR标记可以直接与目标性状(如高产或多抗)相联系，在分子标记辅助选择上具有更高的应用价值。
针对食用菌的SSR分子标记引物系统比较少，目前国内外还没有针对杏鲍菇复合群鉴定的专用EST-SSR分子标记特异引物，因此本发明对于杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇及其复合群的资源鉴定和开发利用具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用。
杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和\或5；
引物1：AAGAGACCGCAAACGAAATG
CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA
引物2：GAAAGCTCGCCATCAGACTC
AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC
引物3：ATCGGATTCGTTGTCGGTAG
CGGATTCCTCCTCTTCTTCC
引物4：ATCTCACGTTGAGCAGGTCC
ACCTATCACGAGCCGCATAC
引物5：TCCTCTATCTCGCCCATCAC
GGGACAGCCTATTCGAGGAT
杏鲍菇复合群的不同菌株鉴定方法，它包括：
1）提取杏鲍菇复合群菌种的基因组DNA；
2）以基因组DNA为模板，用上述引物体系进行扩增；
3）sequi-Gen GT核酸电泳系统上进行聚丙烯酰胺电泳分离，照相后统计条带，转换成0-1数值，利用软件SPSS10.0进行聚类分析。
本发明提供了杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它是采用5对分子标记特异引物，在检测过程中同时使用，在30个杏鲍菇复合群菌种中有多态性，在30 个杏鲍菇复合群中进行的遗传多样性分析与侧耳属白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇的分类常识相吻合（图1），是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的5对引物对应用于更多杏鲍菇复合群上，进行种质资源和遗传多样性分析；5对分子标记特异引物均来自于杏鲍菇复合群发育相关基因EST 序列，为克隆杏鲍菇复合群发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础。
附图说明
图1 为基于5对SSR 位点数据构建的30份杏鲍菇复合群UPGMA 聚类图。图中的品种或种名后的字母代表杏鲍菇复合群菌种的类型。
具体实施方式
一、提取DNA
（1）配制DNA 提取缓冲液：2% CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0 和DNA溶解缓冲液TE：10 Mm Tris；1 Mm EDTA；PH=8.0。
（2）对上述30个杏鲍菇复合群菌株材料进行如下处理：
1) 吸取5 ml CTAB提取缓冲液置于65 ℃水浴锅中预热,加0.1 g PVP (去除酚类物质)。
2) 分别称取0.1 g不同的杏鲍菇复合群菌株的菌丝体放入研钵中，于液氮中迅速研磨成粉并转入65 ℃预热的DNA提取液中，颠倒离心管5-10次。(不要剧烈振荡，防止DNA断裂)并放入65 ℃水浴中30 min，期间轻轻颠倒摇动几次。
3) 4℃，10000 rpm离心5 min，吸取上清液并加其等体积氯仿/异戊醇(24：1)轻轻混匀，10000 rpm离心10 min。
4) 取上清液，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)反复抽提。
5) 加入1/10体积NaAc(3 mol/L，pH5.2)和2倍体积冷乙醇，轻轻颠倒离心管几次后置于-20 ℃冰箱中2 h来沉淀DNA。
6) 取出于4 ℃，10000rpm离心10 min。
7) 用70 %乙醇洗涤沉淀。在超净工作台上将沉淀吹干。
8) 加100 μl TE缓冲液回溶DNA沉淀，同时加入2 μl RNase，置37 ℃处理1 h。
9) 转入1.5 ml离心管中，将总体系扩大后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿/异戊醇(24:1)分别抽提。
10) 吸取上清，重新沉淀DNA，用70 %乙醇洗，吹干。
11) 加入100 μl的TE或去离子水回溶。取1-2 μl样品与1 %的琼脂糖凝胶上电泳，检查样品DNA的质量。
（3）将杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇不同发育时期的材料进行转录组测序分析，筛选得到40对EST-SSR引物，具体见表2。
以步骤（2）提取的待鉴定样品总DNA为模板DNA，以筛选后得到40对特异引物为检测体系引物：EST-SSR标记引物1-40，进行PCR扩增，PCR采用20μl反应体系：
在20μl反应体系中分别加入10×PCR buffer(Mg2+) 2μl，2mM dNTP 0.2μl，5U TaqDNA polymerase 0.1μl，正向引物0.1μl，反向引物0.5μl，荧光标识引物0.4μl，50ng/μlDNA 模板 2μl。PCR反应程序为：94℃预变性5 min后进入循环；94 ℃变性30s，60℃复性45s，72℃延伸l min，反应进行35个循环；72℃后延伸10min。
（4）将步骤（3）PCR扩增后的产物与上样缓冲液（98%的去离子甲酰胺10 Mm EDTA（pH8.0)，0.025%二甲苯青，0.025%嗅酚兰）混合均匀后，取2μl点样，在Sequi-Gen GT核酸电泳系统(BIO-Rad，USA)中通过6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电极缓冲液为1×TBE(TriS-硼酸)，在25 ℃、2000 V恒压下电泳2 h。
通过银染法显影，拍照、记录结果，银染法具体步骤如下：
1、电泳完毕后，胶板用10%醋酸溶液缓慢摇动并固定15分钟，然后用去离子水漂洗3次；
2、将漂洗后的胶板用含有0.1w/v硝酸银和0.15%甲醛的溶液染色30分钟；
3、染色后，用去离子水漂洗胶板2-3次，然后用含有3%碳酸钠和0.15%甲醛的溶液染色3-5分钟，缓慢摇动，直到条带清晰；然后放入10%醋酸溶液固定10分钟，然后用去离子水漂洗5-10分钟，晾干，照相记录。
利用40对EST-SSR引物对30个杏鲍菇复合群品种的DNA进行扩增,并利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测。发现其中的5对EST-SSR引物（即本发明所述标记SEQ ID NO：1-10，其序列特征如表2 所示）在30个不同的杏鲍菇复合群菌种上表现多态性，将30个菌株利用5对EST-SSR引物进行聚丙烯酰胺电泳后得到的多态性条带转换成0-1数值（有条带记为1，无条带记为0），将得到的0-1数值表录入excel表中，利用生物统计软件SPSS10.0将之前统计的数值进行0-1型变量聚类分析，得到30个不同的杏鲍菇复合群菌株的UPGMA 聚类图，聚类得到的树状图表明这5对EST-SSR引物可以将30个不同的杏鲍菇复合群分为杏鲍菇、白灵菇和阿魏菇三大类（相应的菌株信息及编号见表1），这种分类结果与杏鲍菇复合群的形态学分类相符合（供试的30个菌株已经进行了出菇试验，并通过形态学进行了鉴定，分别为10株杏鲍菇，10株白灵菇，10株阿魏菇），而且通过树形聚类图也可以看出，分属杏鲍菇、白灵菇和阿魏菇的各个菌株均能够区分开（相同的菌株会聚类到一起），说明这5对EST-SSR引物能够用于杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇及其复合群的种质资源鉴定，并可用于杏鲍菇复合群种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中。
<110> 吉林农业大学
<120> 杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用
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Claims (2)
1.杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和5；
引物1：AAGAGACCGCAAACGAAATG；
CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA；
引物2：GAAAGCTCGCCATCAGACTC；
AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC；
引物3：ATCGGATTCGTTGTCGGTAG；
CGGATTCCTCCTCTTCTTCC；
引物4：ATCTCACGTTGAGCAGGTCC；
ACCTATCACGAGCCGCATAC；
引物5：TCCTCTATCTCGCCCATCAC；
GGGACAGCCTATTCGAGGAT；
所述的杏鲍菇复合群为杏鲍菇、白灵菇和阿魏菇。
2.杏鲍菇复合群的不同菌株鉴定方法，它包括：
1）提取杏鲍菇复合群菌种的基因组DNA；
2）以基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物体系进行扩增；
3）sequi-Gen GT核酸电泳系统上进行聚丙烯酰胺电泳分离，照相后统计条带，转换成0-1数值，利用软件SPSS10.0进行聚类分析；
所述的杏鲍菇复合群为杏鲍菇、白灵菇和阿魏菇。
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| 基于ITS序列分析对我国主要栽培的侧耳品种的鉴定及评价;郑和斌等;《菌物学报》;20061231;第25卷(第3期);全文 * |
| 阿魏蘑、白灵菇及杏鲍菇亲缘关系的研究;郑和斌等;《食用菌学报》;20051231;第12卷(第4期);1-4 * |
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