CN116042896B - 一种广叶绣球菌SP-A菌株鉴定的indel分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种广叶绣球菌SP‑A菌株鉴定的indel分子标记，所述分子标记分别为indel2或indel6；所述indel2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述indel6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；同时设计扩增indel2或indel6的引物，以DNA为模板，进行PCR扩增产物，对扩增产物测序后实现快速鉴定绣球菌SP‑A菌株。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种广叶绣球菌SP-A菌株鉴定的indel分子标记及应用。
背景技术
绣球菌Sparassis Fr.，又叫做绣球菇，是非褶孔菌目、绣球菌科、绣球菌属。子实体中等至大形，肉质，由一个粗壮的柄上发出许多分枝，枝端形成无数曲折的瓣片，形似巨大的绣球而得名。
绣球菌是一类极具开发潜力的食药用菌，具有抗菌、抗肿瘤、增加免疫力、抗炎症等生理生化活性。绣球菌属已经发现的种有13个，其中，实用工厂化栽培的仅有两种。而目前国内的主栽品种，仅有福建省农业科学院林衍铨研究院团队选育的‘闽绣1号’，可用的栽培资源非常有限。为了促进绣球菌产业的可持续健康发展，福建省农业科学研究院食用菌研究所在广泛搜集野生资源的基础上，通过多年的选育及栽培试验，选育出绣球菌新品种‘SP-A’，该品种菌丝体白色、较浓密，稍有爬壁现象，气生菌丝长势较旺盛，不分泌色素，柔软有弹性。与目前主栽品种‘闽绣1号’相比，绣球菌‘SP-A’产量相差不大，但栽培周期更短，适合各地工厂化栽培。
传统的的食用菌分类鉴定主要依据子实体的形态学特征，包括担孢子的大小和子实体真皮菌丝的形态特征。但子实体的许多形态学特征往往随生长条件的不同而发生变化，同时许多鉴别性特征又经常是几个种所共有，这就给传统的分类学带来了很大困难，仅仅依据形态学特征进行菌种鉴定不是十分可靠。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记的建立与成熟，成为食用菌分类鉴定和溯源的主要手段，依据食用菌基因序列的特异性，能够进行属间、种间、亚种间乃至菌株之间的区分。分子生物学技术能够克服传统食用菌分类鉴定方法难以实现菌株鉴定的技术障碍。因此，为了绣球菌SP-A菌株后续育种以及工厂化栽培的需求，亟需准确的绣球菌SP-A菌株的鉴定方法。
发明内容
本发明为了克服现有技术中绣球菌SP-A菌株鉴定难的问题，提供了用于广叶绣球菌SP-A菌株鉴定的引物组合物、特异序列及其鉴定方法。
本发明的技术方案如下：
本发明的目的之一在于提供一种与广叶绣球菌SP-A菌株相关的indel分子标记，所述分子标记分别为indel2或indel6；所述indel2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述indel6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之二在于将所述indel2的核苷酸序列SEQ ID NO.1或所述indel6的核苷酸序列SEQ ID NO.2用于广叶绣球菌SP-A菌株的鉴定。
本发明的目的之三在于提供一种广叶绣球菌SP-A菌株的鉴定方法，包括如下步骤：
S1、提取待鉴定的菌株样品的DNA；
S2、采用针对如权利要求1所述的indel分子标记的设计的引物对进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
S3、取部分PCR扩增产物上样于含荧染料的1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR扩增产物，确定相应位点的片段大小和信号值；
S4、对PCR扩增产物进行测序，在扩增产物中出现155bp的SEQ ID NO.1所示序列或者出现258bp的SEQ ID NO.2所示序列，则判定为绣球菌SP-A菌株。
进一步的，所述S2中引物对的核苷酸序列具体为：
引物对1：indel2-F：5’-ATCCACGGAGTGCCATGGTC-3’；
indel2-R：5’-TCGAGAGAAGAATATTGCCGCGC-3’；
引物对2：indel6-F：5’-CCGATGCTGAGACGAACGAGAC-3’；
indel6-R：5’-ACTAGTCCTCACATGGTTAACCTGC-3’。
进一步的，所述S2中PCR扩增体系为：10μL 2×HieffGold PCR MasterMix；2μL DNA模板；上下游引物各0.3μL；加ddH2O补至20μL。
进一步的，所述S2中PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明较过去的传统的食用菌分类鉴定方法而言，利用设计的引物组合物对绣球菌SP-A菌株DNA进行扩增，引物特异性良好，扩增的条带单一且明亮，引物组合物的设计为快速鉴定绣球菌SP-A菌株提供了重要工具，且检点更为准确高效，利用本发明的引物组合物、特异序列及鉴定方法，有利于正确进行绣球菌菌株的区分鉴定，这对绣球菌SP-A菌株的后续育种及工厂化栽培相关研究的展开至关重要。
附图说明
图1为本发明中PCR扩增跑胶结果；
其中，M：DL2000 marker；A：待鉴定的菌株；A0：SP-A菌株保藏的原始菌株；C：福建省认定品种‘闽绣1号’菌株；
图2为本发明中PCR产物测序结果比对示意图；
其中，SP-A代表待鉴定的菌株；SP-A0代表SP-A菌株保藏的原始菌株；SP-C代表福建省认定品种‘闽绣1号’。
具体实施方式
下面结合实施例对发明进行进一步的说明，实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
一种与广叶绣球菌SP-A菌株相关的indel分子标记，所述分子标记分别为indel2或indel6；所述indel2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述indel6的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
实施例2
本实施例采用的样品中，SP-A代表待鉴定的菌株；SP-A0代表SP-A菌株保藏的原始菌株；SP-A0代表福建省认定品种‘闽绣1号’，为对照菌株；
一种广叶绣球菌SP-A菌株的鉴定方法，包括如下步骤：
S1、提取绣球菌菌株的DNA；本实施例中分别提取待鉴定的菌株、SP-A菌株保藏的原始菌株、福建省认定品种‘闽绣1号’绣球菌菌株的DNA；
利用CTAB法提取菌株样品的基因组DNA：
(1)研磨：离心收集菌体，液氮研磨成粉末，转入2.0mL离心管；
(2)在离心管中加600μL 2*CTAB，10μLβ-巯基乙醇；
(3)混匀后，65℃水浴30min，期间每隔5min颠倒混匀；
(4)加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀；
(5)10000rpm/min、20℃离心10min，取上清液；
(6)可重复4、5步骤一遍；
(7)加入上清液0.7倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min以上；
(8)10000rpm/min、4℃离心10min，弃上清液；
(9)70％酒精清洗2次，沉淀脱落，可离心固定；
(10)通风厨风干，加水溶解DNA；
S2、采用针对分子标记indel2或indel6的设计的引物对进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
其中，引物对的核苷酸序列具体为：
引物对1：indel2-F：5’-ATCCACGGAGTGCCATGGTC-3’；
indel2-R：5’-TCGAGAGAAGAATATTGCCGCGC-3’；
引物对2：indel6-F：5’-CCGATGCTGAGACGAACGAGAC-3’；
indel6-R：5’-ACTAGTCCTCACATGGTTAACCTGC-3’；
其中，PCR扩增体系为：10μL 2×HieffGold PCR Master Mix；2μL DNA模板；上下游引物各0.3μL；加ddH2O补至20μL；
PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min；
在本实施例中利用引物对1对待鉴定的菌株、SP-A菌株保藏的原始菌株、福建省认定品种‘闽绣1号’绣球菌菌株的DNA进行PCR扩增，得到的扩增产物进行测序，获得的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；利用引物对6对待鉴定的菌株、SP-A菌株保藏的原始菌株、福建省认定品种‘闽绣1号’绣球菌菌株的DNA进行PCR扩增，得到的扩增产物进行测序，获得的序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；
S3、取部分PCR扩增产物上样于含荧染料的1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR扩增产物，确定相应位点的片段大小和信号值，如图1所示，扩增产物条带清晰可辨，可用于菌株的鉴定；
S4、对PCR扩增产物进行测序，与保藏的原始SP-A菌株在indel2和indel6处扩增的片段进行比对；
如图2所示，待鉴定的菌株与其保藏的原始菌株SP-A0在indel2和indel6扩增的片段处无差异，在扩增产物中出现插入indel2处出现155bp的如SEQ ID NO.1所示序列，插入indel6处出现258bp的如SEQ ID NO.2所示序列；
此外，待鉴定的菌株与对照菌株SP-C在插入位点indel2和indel6存在较大差异，为不同的菌株；
由此证明，待鉴定的菌株为绣球菌SP-A菌株。
提供上述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1. 一种与广叶绣球菌SP-A菌株相关的indel分子标记，其特征在于，所述分子标记分别为indel2或indel6；所述indel2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述indel6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的indel分子标记在鉴定广叶绣球菌SP-A菌株中的应用。
3.一种广叶绣球菌SP-A菌株的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取待鉴定的菌株样品的DNA；
S2、采用针如权利要求1所述的indel分子标记的设计的引物对进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
S3、取部分PCR扩增产物上样于含荧染料的1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR扩增产物，确定相应位点的片段大小和信号值；
S4、对PCR扩增产物进行测序，在扩增产物中出现155bp的SEQ ID NO.1所示序列或者出现258bp的SEQ ID NO.2所示序列，则判定为绣球菌SP-A菌株。
4.如权利要求3所述的一种广叶绣球菌SP-A菌株的鉴定方法，其特征在于：所述S2中引物对的核苷酸序列具体为：
引物对1：indel2-F：5’-ATCCACGGAGTGCCATGGTC-3’；
indel2-R：5’-TCGAGAGAAGAATATTGCCGCGC-3’；
引物对2：indel6-F：5’-CCGATGCTGAGACGAACGAGAC-3’；
indel6-R：5’-ACTAGTCCTCACATGGTTAACCTGC-3’。
5. 如权利要求3所述的一种广叶绣球菌SP-A菌株的鉴定方法，其特征在于：所述S2中PCR扩增体系为：10 µL 2×Hieff Canace®Gold PCR Master Mix；2 µL DNA模板；上下游引物各0.3 µL；加ddH2O补至20 µL。
6. 如权利要求3所述的一种广叶绣球菌SP-A菌株的鉴定方法，其特征在于：所述S2中PCR扩增程序为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸5 min。
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| CN117487671B (zh) * | 2023-12-29 | 2024-03-22 | 云南菌视界生物科技有限公司 | 一种适宜工厂化栽培的金黄色绣球菌菌株及其栽培方法 |
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Citations (3)
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| JP2016129518A (ja) * | 2016-04-04 | 2016-07-21 | 郁郎 中村 | 真核生物種の同定方法 |
| CN109837335A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-04 | 福建省农业科学院食用菌研究所（福建省蘑菇菌种研究推广站） | 一种联合ATAC-seq和RNA-seq筛选食药用菌功能基因的方法 |
| CN114058733A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-02-18 | 贵州省土壤肥料研究所(贵州省生态农业工程技术研究中心)(贵州省农业资源与环境研究所) | 用于鉴定白色肺形侧耳黔侧02的分子标记及特异性引物对 |
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2022
- 2022-12-09 CN CN202211587279.9A patent/CN116042896B/zh active Active
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Non-Patent Citations (3)
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| De Novo Sequencing of a Sparassis latifolia Genome and Its Associated Comparative Analyses;Donglai Xiao等;《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》;20181231;第28卷;第1857170页 * |
| 基于ITS序列和BOX-PCR鉴定广叶绣球菌菌株;杨驰;林衍铨;马璐;江晓凌;应正河;;中国食用菌;20160915(第05期);第40-42页 * |
| 基因组测序分析广叶绣球菌SP-A 菌株的遗传差异;杨驰等;《菌物学报》;20211222;第40卷(第12期);第3246-3255页 * |
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