CN105441543B - 一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用，引物序列如Fon‑1；Fon‑2；SIX1‑F；SIX1‑R；SIX6‑F1；SIX6‑R1所示。本发明适用于植物组织和土壤样品中西瓜枯萎病生理小种的快速可靠检测和鉴定，对于农业生产中西瓜枯萎生理小种引起的病害防治具有重要的实用价值。

Description

一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用。

背景技术

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的维管束系统病害。病菌通过土壤、种子传播，在离开寄主的情况下，能存活5-6年，厚垣孢子可存活10年以上。它的发生极为普遍，对西瓜产量和品质构成了严重的威胁，是国内外西瓜生产上最严重的病害之一，已成为制约西瓜生产的主要障碍。培育优质抗病西瓜新品种是有效控制西瓜枯萎病的主要方法，但由于西瓜遗传基础狭窄，可供选育的抗病品种抗源单一，效率不高，加之尖孢镰刀菌西瓜专化型的有生理小种分化，致病性变异较大，极难防治。必须针对不同生理小种筛选合适的抗病品种。准确、快速地鉴定西瓜枯萎病菌生理小种，对于一个地区西瓜枯萎病综合防治和筛选合适有效的抗源具有重要意义。

国际上公认的西瓜枯萎病菌有4个生理小种，即生理小种0号、1号、2号和3号，其中2号生理小种的侵染性最强。生理小种3于2010年在美国鉴定分离，但在中国尚未见报道证实。由于尖孢镰刀菌不能通过形态区分专化型，传统上对西瓜枯萎病菌生理小种鉴定主要是采用接种鉴别寄主，根据寄主抗、感病反应结果鉴定小种，接种鉴定方法费时费力，容易受气候、经验等因素影响，准确率低，鉴别效果不稳定。所以急需开发快速准确的分子鉴定方法。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对我国现有的西瓜枯萎病病原，尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.niveum race 0，race1，race1)，提供一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用。本发明适用于植物组织和土壤样品中西瓜枯萎病生理小种的快速可靠检测和鉴定，对于农业生产中西瓜枯萎生理小种引起的病害防治具有重要的实用价值。

技术方案：一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物，引物序列如下所示：

尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性引物序列为：

Fon-1：5′CGATTAGCGAAGACATTCACAAGACT 3′；

Fon-2：5′ACGGTCAAGAAGATGCAGGGTAAAGGT 3′；

Six1蛋白编码基因特异性引物序列为：

SIX1-F：5′GTATCCCTCCGGATTTTGAGC 3′；

SIX1-R：5′AATAGAGCCTGCAAAGCATG 3′；

Six6蛋白编码基因特异性引物序列为：

SIX6-F1：5′CTCTCCTGAACCATCAACTT 3′；

SIX6-R1：5′CAAGACCAGGTGTAGGCATT3′。

一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的试剂盒，该试剂盒含有上述三对引物。

所述试剂盒检测尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的方法，包括以下步骤：

(1)提取尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种菌株DNA；采用商用DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Mini kit,Qiagen,Valencia,CA,USA)提取病菌菌丝DNA，加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀DNA(含20μg/mL RNase)，-20℃保存备用。

(2)以尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种总DNA为模板，以试剂盒所含引物进行三对特异性引物扩增和三重PCR扩增反应；

(3)将扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，当扩增产物为三条核酸条带，分别为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性核酸条带(174bp)，Six1、Six6蛋白编码基因核酸条带(463bp和793bp)即表明样本为尖孢镰刀菌西瓜专化型0号生理小种；当产物呈现两条扩增核酸条带，分别为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性核酸条带(174bp)和Six6蛋白编码基因核酸条带(793bp)即表明样本为尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种，当扩增产物只有一条核酸条带，为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性核酸条带(174bp)即表明样本为尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种(图1)。所以可以根据表1条带组合特征区分鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种。

步骤(2)所述三重PCR扩增反应的体系和条件为：

PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸5min；12℃保温。

表1引物组合反应特征对应生理小种的区分

有益效果：1、特异性强：本发明检测方法通过西瓜枯萎特异性引物结合Six1、Six6蛋白编码基因特异性引物检测尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种。尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种标准菌株及尖瓜类其他常见病菌的验证，所检测的阴性对照株均无阳性结果出来，结果具有很强的特异性；

2、准确性高：同时引物组合中的尖孢镰刀菌西瓜专化型特异引物可作为内参照同时检测DNA的质量，避免了假阴性的出现；兼顾三个生理小种，同时检测无遗漏。能够同时检测出尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种。

3、操作简便快速：本发明所用系列特异性引物组合，对尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种检测多重PCR一个反应体系完成、PCR扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，一般整个检测过程在数小时内完成。

附图说明

图1为三组引物对尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种特异性PCR扩增产物电泳图；图1中M：DNA Marker；1：尖孢镰刀菌西瓜专化型0号生理小种；2,尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种；3,尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种；

图2为三种蛋白编码基因特异性引物检测尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种特异性PCR扩增产物电泳图；其中A为Six1蛋白编码基因特异性引物检测尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种特异性PCR扩增产物电泳图；B为Six6蛋白编码基因特异性引物检测尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种特异性PCR扩增产物电泳图；C为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性引物检测尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种特异性PCR扩增产物电泳图；图2中M：DNA Marker；1：尖孢镰刀菌西瓜专化型0号生理小种；2,尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种；3,尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种；4,腐皮镰刀菌；5,尖孢镰刀菌甜瓜专化型；6，甜瓜蔓枯病菌；7，侧雄腐霉菌；8，蕃茄叶霉病菌；9，尖孢镰刀菌葫芦专化型；10，西瓜炭疽病菌；11，甜瓜链格孢菌；12，轮枝尖孢镰刀菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限制。

实施例1

尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种总DNA为模板，为检测对象，各引物序列具体如下：

1、引物组合选择：

提供三对检测引物组合,见表2所示：

表2西瓜枯萎病病原菌是0号、1号和2号生理小种特异性检测引物组合序列

2、DNA提取，采用商用DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Mini kit,Qiagen,Valencia,CA,USA)尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种菌株DNA，加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀DNA(含20μg/mL RNase)，-20℃保存备用。

3、以尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种总DNA为模板，三组引物进行三重PCR扩增反应；

三重PCR扩增的体系如表3所示：

表3三重PCR检测的反应体系(25μL)

超纯水	8μL
		2×Taq Master Mix(Dye Plus)	12.5μL
Fon-1(10mM)	0.5μL
		Fon-2(10mM)	0.5μL
SIX1-F(10mM)	0.5μL
		SIX1-R(10mM)	0.5μL
SIX6-F1(10mM)	0.5μL
		SIX6-R1(10mM)	0.5μL
Taq Polymerase(5U/μL)	0.5μL
		目标检测DNA	1μL
总体积	25μL

4、电泳检测：

取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察。

5、结果分析

当扩增产物为三条核酸条带，分别为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性核酸条带(174bp)，Six1、Six6蛋白编码基因核酸条带(463bp和793bp)即表明样本为尖孢镰刀菌西瓜专化型0号生理小种；当产物呈现两条扩增核酸条带，分别为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性核酸条带(174bp)和Six6蛋白编码基因核酸条带(793bp)即表明样本为尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种，当扩增产物只有一条核酸条带，为尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性核酸条带(174bp)即表明样本为尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种(图1)。所以可以根据表1条带组合特征区分鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种。

实施例2：

三组检测引物组合检测尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的特异性

为了验证三组检测引物组合对尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的特异性，本发明以3株经鉴定的尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种0号、1号和2号生理小种及对照其他西瓜病原菌共12个菌株的基因组DNA为模板，分别以对0号、1号和2号生理小种及尖镰孢特异性的引物组合进行PCR检测，扩增体系参照表3。扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如附图2A～C所示，在附图2中：DNA Marker；1：尖孢镰刀菌西瓜专化型0号生理小种；2,尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种；3,尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种；4,腐皮镰刀菌；5,尖孢镰刀菌甜瓜专化型；6，甜瓜蔓枯病菌；7，侧雄腐霉菌；8，蕃茄叶霉病菌；9，尖孢镰刀菌葫芦专化型；10，西瓜炭疽病菌；11，甜瓜链格孢菌；12，轮枝尖孢镰刀菌。尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性引物为(Fon-1/Fon-1)、Six1蛋白编码基因特异性引物(SIX1-F/SIX1-R)以及Six6蛋白编码基因特异性引物(SIX6-F1/SIX6-R1)能分别扩增出特异性的条带，大小分别为174bp、463bp、793bp，而外围菌株则没有扩增产物。

本实施例实验结果说明所筛选出的引物具有优异的特异性，能分别鉴定出病原菌的生理小种。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgattagcga agacattcac aagact 26

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acggtcaaga agatgcaggg taaaggt 27

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtatccctcc ggattttgag c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatagagcct gcaaagcatg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctcctgaa ccatcaactt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caagaccagg tgtaggcatt 20

Claims (4)

1.一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物组，其特征在于引物序列如下所示：

Fon-1：5′CGATTAGCGAAGACATTCACAAGACT 3′；

Fon-2：5′ACGGTCAAGAAGATGCAGGGTAAAGGT 3′；

SIX1-F：5′GTATCCCTCCGGATTTTGAGC 3′；

SIX1-R：5′AATAGAGCCTGCAAAGCATG 3′；

SIX6-F1：5′CTCTCCTGAACCATCAACTT 3′；

SIX6-R1：5′CAAGACCAGGTGTAGGCATT3′。

2.一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物组。

3.权利要求2所述试剂盒检测尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种菌株DNA；

(2)以尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种总DNA为模板，以试剂盒所含引物组进行三对特异性引物扩增和三重PCR扩增反应；

(3)将扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)所述三重PCR扩增反应的体系和条件为：

PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸5min；12℃保温。