CN107447036B - 一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法 - Google Patents

一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法。ISSR标记引物UBC886在鉴别葫芦尖孢镰刀菌中的应用，UBC886的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该引物对不同菌株进行PCR扩增，仅葫芦尖孢镰刀菌能扩增出1800bp的特异性条带。本发明的方法用于特异性的检测葫芦尖孢镰刀菌。该方法耗时短，特异性强，可以快速的鉴别出葫芦尖孢镰刀菌，实现对葫芦砧木根腐病的早期诊断。

Description

一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法。
背景技术
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schi.)引起的农作物枯萎病是一种世界性分布的土传真菌病害，寄主范围广泛，可引起1000多种植物发病，造成严重减产，甚至绝收。尖孢镰刀菌种内致病菌株具有高度的寄主专化性，根据对不同寄主植物的专化性珂分为专化型，同一尖孢镰刀菌不同的专化型引起的发病程度完全不同，如尖孢镰刀菌西瓜专化型就不会浸染黄瓜，同样尖孢镰刀菌古巴专化型只会浸染香蕉而不会浸染花生作物。肖荣凤(肖荣凤，瓜类尖孢镰刀菌生理分化特性研究[D].福建农林大学，2007年)通过尖孢镰刀菌脂肪酸气相色谱典型的模式图谱及菌株脂肪酸峰值变化规律分析发现尖孢镰刀菌rDNA-ITS区序列难以区分菌株专化型。所供试的瓜类尖孢镰刀菌不同专化型菌株的ITS1和ITS2区间的同源性均为100％。
葫芦尖孢镰刀菌可以致葫芦砧木根腐病的发生，自2005年浙江省温岭市首次出现葫芦砧木根腐病，7.3hm2嫁接西瓜全部死亡(林燚等，浙江农业科学，2007，1:84-86)。随后，在河北、湖北等地嫁接西瓜田也发生了此类病害，致使西瓜产量和品质下降，造成经济损失。目前生产上对于尖孢镰刀菌引起的葫芦根腐病的鉴定与检测以实地观察植株的发病症状和免疫学检测为主。但是，以上鉴定方法要求经验性强，普通的工作人员不能进行准确判断，其次耗时长，达不到在侵染初期诊断的目的，不能满足生产需求。因此，对葫芦尖孢镰刀菌侵染初期进行检测和诊断，对防治葫芦根腐病害具有十分重要的指导意义。
随着生物技术的发展，分子检测技术如RFLP(张宝俊等，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2005，33：88-90)、RAPD(廖林凤等，植物病理学报，2009，39：353-361)以及SCAR(刘景梅等，植物病理学报，2006，36：28-34)等逐渐应用于病原菌检测。但是这些标记技术在使用中存在不足，如RFLP技术在检测中需要进行限制性内切酶切割，工作量大，耗时长，不适合大批量样品的检测分析。RAPD技术在分析中较易受到各种因素的影响，实验的稳定性和重复性较差。此外，基于菌株特异性引物也已成功建立了香蕉(李敏慧等，中国农业科学，2012,45:3971-3979)、甘蓝(张吉祥等，植物病理学报，2014,44:586-594)等枯萎病菌的分子鉴定技术。但是这种方法是在基因组测序的基础上实现的，不能满足一般实验室的需求。
ISSR(inter-simple sequence repeat)标记采用17～22个碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段。结合了RAPD和SSR的优点，具有操作简单、多态性丰富、重复性强、稳定性高等优点。已被广泛应用于品种鉴定、多样性分析、指纹图谱的构建等研究中。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供ISSR标记引物UBC886在鉴别葫芦尖孢镰刀菌中的应用。
本发明的另一目的是提供一种用于鉴别葫芦尖孢镰刀菌类型的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
ISSR标记引物UBC886在鉴别葫芦尖孢镰刀菌中的应用，所述ISSR标记引物UBC886的核苷酸序列为5’-vdvctc tct ctc tct ct-3’(SEQ ID NO.1)所示。
ISSR标记引物UBC886在制备鉴别葫芦尖孢镰刀菌的试剂中的应用，所述ISSR标记引物UBC886的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种用于鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取葫芦尖孢镰刀菌菌株基因组DNA；
(2)利用权利要求1中所述的ISSR标记引物UBC886对葫芦尖孢镰刀菌菌株基因组DNA进行PCR扩增；
(3)扩增产物进行凝胶电泳，能扩增出1800bp的特异性条带的为葫芦尖孢镰刀菌。
在步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系优选为：模板DNA 0.5-100ng、引物UBC8861.5μL、2xTaq PCRMaster Mix 12.5μL、Tag 0.5μL、无菌水补足25μL；PCR反应程序优选为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.0min，共35个循环，最后72℃总延伸7min，4℃保存。
一种葫芦尖孢镰刀菌的鉴别试剂，包含ISSR标记引物UBC886。
所述的鉴别试剂还优选包含2xTaq PCRMaster Mix、Tag及无菌水。
有益效果：
本发明的方法用于特异性的鉴别葫芦尖孢镰刀菌菌株，该方法耗时短，特异性强。根据1800bp特异性条带的有无鉴定不同类型的菌株，具有该条带的菌株为葫芦尖孢镰刀菌菌株，没有该条带的菌株为其他类型菌株。
利用UBC886引物可以特异性地鉴别出葫芦尖孢镰刀菌，具有良好的种间特异性和宿主专化性，有利于葫芦根腐病菌的早期诊断。
附图说明
图1UBC886引物在不同菌株中的扩增结果
图2UBC886引物对不同样品中葫芦尖孢镰刀菌的PCR扩增。1-14为葫芦尖孢镰刀菌；15-20为西瓜尖孢镰刀菌。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1葫芦尖孢镰刀菌特异性检测
1、真菌菌株DNA提取
选取葫芦尖孢镰刀菌、尖孢镰刀菌西瓜专化型、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、三线镰刀菌、轮枝镰刀菌、串珠镰刀菌、链格孢菌、蔓枯病菌、子囊菌、孢霉菌等11种不同菌株进行UBC886引物特异性检测。分别称取0.1g不同菌株的菌丝，液氮速冻后研磨，然后用真菌DNA提取试剂盒(omega)进行DNA的提取。提取到的DNA通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用分光光度法定量，-20℃保存备用。
2、PCR反应体系与扩增条件
PCR反应引物为5’-VDVCTC TCT CTC TCT CT-3’。采用该引物对菌株进行扩增。PCR反应体系为：模板DNA 0.5-100ng、引物1.0μL、2xTaq PCRMaster Mix 12.5μL、Tag 0.5μL、无菌水补足25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.0min，共35个循环，最后72℃总延伸7min，4℃保存。
3、结果分析
取5μL扩增产物用1％琼脂糖凝胶检测。如图1所示，UBC886引物在12个菌株中仅葫芦尖孢镰刀菌能扩增出1800bp的特异性条带，其余受试菌株均未扩增出该条带，检出率为100％。因此，应用该标记可以对葫芦尖孢镰刀菌进行特异性检测。
实施例2葫芦尖孢镰刀菌宿主专化型检测
1、尖孢镰刀菌菌株DNA提取
分别称取0.1g葫芦尖孢镰刀菌和西瓜尖孢镰刀菌菌丝，液氮速冻后研磨，然后用真菌DNA提取试剂盒(omega)进行DNA的提取。提取到的DNA通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用分光光度法定量，-20℃保存备用。
2、PCR反应体系与扩增条件
PCR反应引物为5’-VDVCTC TCT CTC TCT CT-3’。采用该引物对菌株进行扩增。PCR反应体系为：模板DNA 0.5-100ng、引物1.0μL、2xTaq PCRMaster Mix 12.5μL、Tag 0.5μL、无菌水补足25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.0min，共35个循环，最后72℃总延伸7min，4℃保存。
3、结果分析
取5μL扩增产物用1％琼脂糖凝胶检测。如图2所示，1-14为不同样品中分离出的葫芦尖孢镰刀菌菌株，15-20为不同样品中分离出的西瓜尖孢镰刀菌菌株。应用UBC886引物进行PCR扩增后，仅14个葫芦尖孢镰刀菌菌株能扩增出1800bp的特异性条带，而5个西瓜尖孢镰刀菌菌株均未扩增出该条带，对不同样品来源的葫芦尖孢镰刀菌检出率为100％。因此，应用该标记可以实现对不同样品来源的葫芦尖孢镰刀菌的特异性扩增。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
vdvctctctc tctctct 17

Claims (4)

1.ISSR标记引物UBC886在鉴别葫芦尖孢镰刀菌中的应用，所述ISSR标记引物UBC886的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.ISSR标记引物UBC886在制备鉴别葫芦尖孢镰刀菌的试剂中的应用，所述ISSR标记引物UBC886的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种用于鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）提取葫芦尖孢镰刀菌菌株基因组DNA；
（2）利用权利要求1中所述的ISSR标记引物UBC886对葫芦尖孢镰刀菌菌株基因组DNA进行PCR扩增；
（3）扩增产物进行凝胶电泳，能扩增出1800bp的特异性条带的为葫芦尖孢镰刀菌。
4.根据权利要求3所述的鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述PCR扩增的反应体系为：模板DNA 0.5-100 ng、引物UBC8861.5 μL、2xTaq PCRMaster Mix12.5μL、Tag 0.5μL、无菌水补足25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.0 min，共35个循环，最后72℃总延伸7 min，4℃保存。
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