CN109486928B

CN109486928B - 一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法

Info

Publication number: CN109486928B
Application number: CN201811622348.9A
Authority: CN
Inventors: 贾瑞宗; 郭安平; 朱芸; 魏卿
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109486928A

Abstract

本发明提供一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：在番木瓜杂交群体中筛选获得性别决定分子标记Sex79，根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物；采用该引物进行PCR扩增，检测，结果判定。本发明提供单一DNA分子标记Sex79，针对Sex79设计一对引物，直接利用该引物对即可进行番木瓜性别鉴定，并且可以在不提取DNA的情况下直接进行PCR然后电泳检测，还可以通过试纸条直接检测，操作简单，节省成本，快速高效。本发明还根据性别决定分子标记Sex79设计了LAMP检测引物，结合LAMP技术实现田间批量快速检测。

Description

一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法

技术领域

本发明涉及植物性别鉴定技术领域，特别涉及一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法。

背景技术

番木瓜是雌花雄花两性花异株的(trioecious)植物。通常番木瓜有三种性别的树：雌树(Female)、雄树(Male)和两性树(Hermaphrodite)。只有雌树和两性树才能结果，在传统耕作中，需要通过播种、开花后才能判定番木瓜性别，此过程耗费3-6个月的时间，限制了番木瓜的生产。

目前判断番木瓜性别的主要技术有：

(1)外部形态：番木瓜在苗期鉴定性别对其育种及栽培均有一定意义，但在幼苗形态上各种类型的株型几乎没有区别，难以实现苗期快速鉴定；

(2)生理生化差异：Jaiswal研究了番木瓜无性组织和生殖组织的酸性和碱性磷酸酶活力，发现雄株生殖组织的酸性和碱性磷酸酶活力高于雌株。此方法受到不同栽培条件、取样部位以及取样时间的影响，存在很高的假阳性率，且成本高，操作复杂；

(3)同工酶图谱：陈中海采用同工本酶技术研究番木瓜性别发现雌株、雄株和两性株过氧化物酶(PODD)、酯酶(ESTD)和多酚氧化酶(PPOD)同工酶谱上存在差异。此技术操作复杂，成本高，同时只能适用于成熟植株，不能对苗期进行性别鉴定；

(4)分子标记技术：番木瓜性别的分子水平研究一直是研究热点和难点。

(a)夏威夷大学的Deputy等获得了与番木瓜性别紧密连锁的3个RAPD标记，经测序合成引物转换为SCAR标记，并认为SCAR T12和SCARW11在两性株和雄株与间能够产生特异的PCR产物，而在雌株中却极少出现；SCAR T1在所有的株性间均有该PCR产物产生，因此利用T1、T12和W11这3对引物可以在苗期进行早期性别鉴定。但是，三个引物组合的鉴别过程繁多、复杂、价格高，不能直接应用商业生产。

(b)Eliana等利用RAPD技术发现引物BC210产生的标记BC210438可以检测供试材料的两性株类型。此技术存在假阳性，也不能直接用于农业生产。

(c)Parasnis用微卫星和微小卫星来作为番木瓜性别特异标记的研究，发现用GATAD 4探针鉴定了1个5Kb的特异带仅出现在雄株中,从染色体水平上提示了性别差异的遗传物质基础，但是操作成本非常昂贵，不适合农业生产。

(d)周应国用混合分离群体分析法寻找到了番木瓜两性基因M2的RAPD标记OPG071800和OPE061050，发现与M2基因紧密连锁，并且位于M2基因的两侧，其遗传距离分别为4.5cm和1.9cm，但是操作成本非常昂贵，不适合农业生产。

综上，本领域关于番木瓜性别早期鉴别技术已经开展了很多研究，基本上可以归位两类，一类是基于表型和生理生化特征因子，如外部形态、生理生化差异、同工酶图谱等。这一类技术基本能够对番木瓜性别进行鉴别，但是受到植物生长状态、不同管理措施、种植条件、采样部位、处理时间、重复性低等因素的制约，无法推广应用。第二类是基于DNA分子标记的鉴别方法，这一类方法克服了第一类技术的很多缺陷，能够从DNA水平上实现番木瓜性别的早期鉴定。这类方法通常利用RAPD、SSR、AFLP、微卫星等技术在大量的群体中筛选紧密连锁的分子标记。这类方法往往受限于群体的大小、群体的代表型以及技术本身的非特异性扩增导致的假阳性。现在在学术研究上最为常用的就是夏威夷学者发现的T1、T12和W11三个组合引物，但是三个引物组合的鉴别过程繁多、复杂、价格高、不能直接应用商业生产。

发明内容

鉴以此，本发明的主要目的是寻找单一DNA分子标记，并结合其他DNA检测方法，快速高通量的实现番木瓜早期(苗期)性别鉴定。

本发明的技术方案是：

一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

S1、获得DNA分子标记：在番木瓜杂交群体中筛选获得性别决定分子标记Sex79，所述性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

S2、设计引物：根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物；

S3、采用步骤S2所述的引物进行PCR扩增，检测，结果判定。

优选的，性别决定分子标记Sex79位于番木瓜雄性特异区。

优选的，步骤S2中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

优选的，步骤S3中，以番木瓜DNA为模板进行PCR扩增。

优选的，检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测，结果判定方法为：出现特异性条带的为雄性或两性，未出现特异性条带的为雌性。

优选的，检测方法为试纸检测，结果判定方法为：出现两条特异性条带的为雄性或两性，出现一条特异性条带的为雌性。

优选的，步骤S3中，不进行番木瓜DNA提取，直接将番木瓜叶片加入到PCR反应体系进行反应。

优选的，步骤S2中，所述引物用于LAMP检测，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：13所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供单一DNA分子标记Sex79，针对Sex79设计一对引物，直接利用该引物对即可进行番木瓜性别鉴定，并且可以在不提取DNA的情况下直接进行PCR然后电泳检测，还可以通过试纸条直接检测，操作简单，节省成本，快速高效。

本发明还根据性别决定分子标记Sex79设计LAMP检测引物，结合LAMP(环介导等温扩增反应)技术实现田间批量检测。

附图说明

图1：本发明实施例1的测试结果图，图中，M为DNA分子标记，圆环“◎”为两性番木瓜参考DNA；“♂”代表雄性番木瓜参考DNA，“♀”代表雌性番木瓜参考DNA；“F2”代表测试样品。

图2：本发明实施例2的测试结果图。

图3：本发明实施例3所得扩增曲线图。

图4：本发明实施例4的试纸检测结果图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

S1、获得DNA分子标记：通过AFLP方法在300多个番木瓜杂交群体中通过筛选获得性别决定分子标记Sex79，所述性别决定分子标记Sex79位于番木瓜雄性特异区，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

S2、设计引物：根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物，上游引物Sex79F:GAACAGACTAGCCAAGCA(SEQ ID NO:2)，下游引物Sex79R:AGAACCACTGACTCCACC(SEQID NO:2)；

S3、以番木瓜DNA为模板，采用步骤S2所述的引物进行PCR扩增，退火温度58℃，扩增时间30秒，35个循环，PCR结束后进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；

S4：结果判定：出现特异性条带的为雄性或两性，未出现特异性条带的为雌性。

本实施例中采用多个样品进行检测，验证引物的可靠性以及在Sex79的性别决定能力，结果见图1。结果显示，PCR扩增结果特异性好，雄性和两性株可以扩增出特异性条带，雌性株未扩增出特异性条带，本方法能够明显区别测试样品中的雌性和雄性、两性株。

实施例2

一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

S3、利用番木瓜叶片，不进行DNA提取，直接加入PCR反应体系进行PCR扩增，PCR结束后进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；

本实施例通过对5000多份测试样品进行验证，测试效果的准确率为98％。部分样品的电泳结果见图2。

实施例3

一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，包括以下步骤：

S2、设计引物：根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计LAMP检测引物，引物序列如下：

采用标准LAMP反应程序获得扩增曲线，结果见图3。结果显示，雄性和两性株菌可以得到S型曲线，雌性株未得到S型曲线。

实施例4

实施例4与实施例2的区别在于，通过FAM标记引物，Sex79FFam:FAM-GAACAGACTAGCCAAGCA；Sex79R:AGAACCACTGACTCCACCPCR。扩增后直接使用试纸条检测。结果判定方法为：出现两条特异性条带的为雄性或两性，出现一条特异性条带的为雌性。结果见图4。结果表明，通过试纸条检测，可以明显区分出雌性株和雄性株和两性株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 478

<212> DNA

<213> 番木瓜(Carica papaya)

<400> 1

gactgcgtac caattcacta ttggtgacca aatcttcctc aagatttttc cttacaagtg 60

aaaaacgtga tttaggaaaa ggtggaagtt gagccccaat tatatgggat ctttttggat 120

cgtggagctt gttggactta tggcgtactg ccttactcta ccccgagagt ttacgggtct 180

acatgatatt ttccatgtta caatgctgaa aaggtaccac ttgacccttc ttatattgtt 240

cctcacgatg agacccaagt gcaagctgat atgacatacg aagagctccc ttaaaaaatt 300

gttgattgga ctaacaatat tttgtgcaac aaaaggaacc ccatggtgaa agtgtagtgg 360

aaacaccaca ttctagaaaa gtttccaaac ctatattcat gacaaatttg gggacaaaat 420

attctaaggt agggagaatg taataccccg taaacatctt gcttactcag gactcatc 478

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaacagacta gccaagca 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaaccactg actccacc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaggtggaa gttgagcc 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttccactaca ctttcaccat g 21

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtagaccc gtaaactctc gggtggagct tgttggactt at 42

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaggtacca cttgaccctt ctggagctct tcgtatgtca tatc 44

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtagagtaa ggcagtacgc 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tattgttcct cacgatgaga cc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtggagcttg ttggacttat 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtagaccc gtaaactctc gg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggagctcttc gtatgtcata tc 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaggtacca cttgaccctt ct 22

Claims

1.一种快速早期鉴定番木瓜性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物用于LAMP检测，引物序列如SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：9所示；或根据性别决定分子标记Sex79的核苷酸序列设计引物用于PCR扩增，检测，引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

S3、结果判定；

进行LAMP检测时，结果判定方法为：扩增曲线为S型曲线时，判定为雄性或两性，未得到S型曲线时判定为雌性；

若进行PCR扩增后的检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测时，结果判定方法为：出现特异性条带的为雄性或两性，未出现特异性条带的为雌性；若进行PCR扩增后的检测方法为试纸检测时，结果判定方法为：出现两条特异性条带的为雄性或两性，出现一条特异性条带的为雌性。

2.根据权利要求1所述的快速早期鉴定番木瓜性别的方法，其特征在于，步骤S2中，以番木瓜DNA为模板进行PCR扩增。

3.根据权利要求1所述的快速早期鉴定番木瓜性别的方法，其特征在于，步骤S2中，不进行番木瓜DNA提取，直接将番木瓜叶片加入到PCR反应体系进行反应。