CN114134249B - 用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重pcr引物组合和多重pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重pcr引物组合和多重pcr试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法。该多重PCR引物组合包括：用于特异性扩增杂色曲霉素A脱氢酶基因ver‑1的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物及具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；用于特异性扩增杂色曲霉素B基因verB的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物及具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物；用于特异性扩增真菌ITS序列的引物对。本发明的多重PCR引物组合特异性强、灵敏度高，相互之间不存在干扰。

Description

用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR 试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类主要由曲霉属真菌产生的有毒二次代谢产物，具有极高的致病性和致癌性，黄曲霉和寄生曲霉是常见的黄曲霉素产毒真菌。产黄曲霉毒素的真菌通常在收获、加工、贮藏及运输多环节污染食品及中药材，严重威胁人类健康。
目前对于黄曲霉素的检测主要是通过高效液相色谱法柱后衍生法，该方法能够较为准确的检测黄曲霉素的含量，却存在操作复杂、需要样品量高等缺点。
对黄曲霉素产毒真菌的源头鉴定也是控制黄曲霉素产生的有效手段。一旦食品或中药材被黄曲霉素产毒真菌污染，即存在风险，对源头的准确鉴定是防控黄曲霉素污染的关键。
目前对黄曲霉素产毒真菌的鉴定方法主要是基于菌株形态、生理特征、抗原特异性等特征进行分类鉴别，通常需要经过纯化培养、形态观察、生理生化鉴定等过程，存在检测周期长、操作程序繁琐、专业知识要求高、鉴别水平不够准确等缺点。
近年来，分子生物学手段越来越多的被应用于食源性致病菌的鉴定中。各种PCR技术对于多种真菌的鉴定和检出具有高灵敏度、高特异性、时间周期短等优势。其中，多重PCR是指在同一反应体系中加入两对或两对以上特异引物，对多个模板DNA或者同一个模板DNA的不同区域扩增多个目的片段的反应体系，其具有高效、快速、高通量等优点，目前已经广泛应用于各种真菌和细菌的源头鉴定中，应用效果显著。
但在运用多重PCR进行真菌的源头鉴定时，由于多对引物之间存在竞争性扩增，体系容易出现假阴性、非特异性扩增、灵敏度低等缺点，较单重PCR更难以出现预期结果；因此对引物特异性要求较高。
发明内容
本发明的发明目的是提供快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合，包括：
①用于特异性扩增杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物，以及具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；
②用于特异性扩增杂色曲霉素B基因verB的引物对，该引物对包括具有如SEQ IDNo.3所示核苷酸序列的上游引物，以及具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物；
③用于特异性扩增真菌ITS序列的引物对。
本发明针对杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1、杂色曲霉素B基因verB和真菌ITS序列设计了多重PCR引物，各引物对特异性强、灵敏度高，相互之间不存在干扰。
作为优选，上述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合包括：
①用于特异性扩增杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1的引物对，该引物对包括：
上游引物；5′-GTGACCCCAGAAGTATGAAC-3′；
下游引物：5′-GGGAACCCAACAAGACGC-3′；
②用于特异性扩增杂色曲霉素B基因verB的引物对，该引物对包括：
上游引物；5′-GGGACAAGGTTCTAGTGAAG-3′；
下游引物：5′-CGATGACGGCAGTAAGGT-3′；
③用于特异性扩增真菌ITS序列的引物对。
作为优选，在上述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合中，用于特异性扩增真菌ITS序列的引物对包括：
上游引物；5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′；
上游引物；5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
本发明中，所述的黄曲霉素产毒菌包括黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和米曲霉(Aspergillus oryzae)中的至少一种。本发明的多重PCR引物组合对各种黄曲霉素产毒菌覆盖全面，检出率高。
基于此，本发明还提供了用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR试剂盒，该试剂盒中即含有上述的快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合。
在上述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR试剂盒中，50μL的多重PCR反应体系中含有：5μM的引物各3-5μL，2.5mmol/L的dNTPs 3-7μL，2.5mmol/L的Mg2+3-5μL，DNA模板浓度不小于1ng/μL，余量为去离子水。
作为进一步优选，在上述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR试剂盒中，50μL的多重PCR反应体系中含有：5μM的引物各3μL，2.5mmol/L的dNTPs5μL，2.5mmol/L的Mg2+4μL，DNA模板浓度10ng/μL，余量为去离子水。
在上述的多重PCR反应体系下，对黄曲霉素产毒菌的检测特异性更强、灵敏度更高。
本发明还提供了一种快速检测黄曲霉素产毒菌的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测样品的总DNA，作为模板DNA；
(2)采用上述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR试剂盒对所述的模板DNA进行多重PCR扩增；
(3)对扩增产物进行检测，并根据检测结果判断待测样品中是否含有黄曲霉素产毒菌。
具体地，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳验证，若泳道内出现了三条条带，则可以将对应的待测样品判断为含有黄曲霉素产毒菌。
作为优选，在上述的快速检测黄曲霉素产毒菌的方法的步骤(2)中，所述的多重PCR扩增的退火温度为54-60℃；作为进一步优选，在上述的快速检测黄曲霉素产毒菌的方法的步骤(2)中，所述的多重PCR扩增的退火温度为56℃。试验表明，在54-60℃的退火温度下，多重PCR条带明显，退火温度低于54℃时条带亮度较弱。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明针对杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1、杂色曲霉素B基因verB和真菌ITS序列设计了多重PCR引物，各引物对特异性强、灵敏度高，相互之间不存在干扰；引物组合对各种黄曲霉素产毒菌覆盖全面，检出率高。
附图说明
图1为11株试验菌株的总DNA凝胶电泳图；
其中，G表示构巢曲霉(A.nidμLans)AS 3.3916，He表示黑曲霉(A.niger)CMCC(F)98003，Q表示青霉(PenicilliμM expansμM)AS 3.3875，L表示链格孢霉(Alternariaalternata)AS 3.4255，Mo表示毛霉(Mucor)AS 3.3447，Y表示烟曲霉(A.fμMigatus)AS3.3572，Ho表示红曲霉(Monascus sp.)AS 3.782，Z表示杂色曲霉(A.versicolor)AS3.3886，T表示土曲霉(A.terreus)AS 3.3935，J表示寄生曲霉(A.parasiticus)AS 3.124，H表示黄曲霉(Aspergillus flavus)AS 3.3554，H2和H3均为黄曲霉，J2为寄生曲霉，Mi表示米曲霉(A.oryzae)ASS.384；Marker表示标准，Marker中的条带长度由低到高分别是100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，下同；
图2为不同退火温度对多重PCR反应结果的影响；
图3为不同模板DNA浓度对多重PCR反应结果的影响；
图4为不同引物用量对多重PCR反应结果的影响；
图5为不同Mg2+用量对多重PCR反应结果的影响；
图6为不同dNTPs用量对多重PCR反应结果的影响；
图7为多重PCR反应体系的正交优化结果；
图8为优化的多重PCR反应体系对各试验菌株的检测结果；
图9优化的多重PCR反应体系对黄曲霉毒素灵敏度的检测结果；
图10为仅用扩增基因ver-1的引物对和扩增基因verB的引物对对各试验菌株的检测结果；
图11为仅用扩增基因ver-1的引物对和扩增基因ITS的引物对对各试验菌株的检测结果；
图12为仅用扩增基因verB的引物对和扩增基因ITS的引物对对各试验菌株的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
本发明实施例中，使用到的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、萨氏培养基(SDB)均购自杭州水露生物科技有限公司；dNTP、Taq酶、DNA Maker及真菌基因组DNA提取试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司；MJ-150-II霉菌培养箱，HZQ-X300C恒温振荡器及DK-8D三孔电热恒温水槽均购自上海一恒科学仪器有限公司；凝胶成像仪购自北京勤翔生物技术有限公司；NanoDrop one超微量分光光度计购自美国ThermoFisher公司；PCR仪购自美国伯乐。
实施例1
1、引物合成
分别针对杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1(黄曲霉ver-1基因的Genbank登录号为AY510451.1、寄生曲霉ver-1基因的Genbank登录号为M91369.1、米曲霉ver-1基因的Genbank登录号为AB007804.1)、杂色曲霉素B基因verB(黄曲霉verB基因的Genbank登录号为AF106960.1、寄生曲霉verB基因的Genbank登录号为AF106958.1、米曲霉verB基因的Genbank登录号为AB076804.1)和真菌ITS序列设计多重PCR引物，并委托生工生物工程(上海)有限公司合成，各引物的核苷酸序列见表1。
表1多重PCR引物组合及靶基因
2、真菌培养及模板DNA提取
试验菌株包括黄曲霉(Aspergillus flavus)AS 3.3554(H)、寄生曲霉(A.parasiticus)AS 3.124(J)、米曲霉(A.oryzae)ASS.384(Mi)、土曲霉(A.terreus)AS3.3935(T)、杂色曲霉(A.versicolor)AS 3.3886(Z)、红曲霉(Monascus sp.)AS 3.782(Ho)、烟曲霉(A.fumigatus)AS 3.3572(Y)、毛霉(Mucor)AS 3.3447(Mo)、链格孢霉(Alternaria alternata)AS 3.4255(L)、青霉(Penicillium expansum)AS 3.3875(Q)、黑曲霉(A.niger)CMCC(F)98003(He)和构巢曲霉(A.nidulans)AS 3.3916(G)，以上菌株购自购自杭州水露生物科技有限公司；另外包括分离鉴定菌株黄曲霉H2，黄曲霉H3，寄生曲霉J2；其中黄曲霉、寄生曲霉、米曲霉为已知的产毒菌株，本实施例利用上述试验菌株对多重PCR引物组合的检测特异性进行验证。
具体地，将各菌株接种于PDA平板培养基上，25-28℃培养3-5天，挑取少量相应菌株的菌丝体分别接种于SDB液体培养基中，28℃、150r/min培养2-3天；离心收集菌体，采用Ezu-柱式真菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，并通过1％琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测260/280处的DNA浓度和纯度。检测结果见图1。
从图1可以看出，提取的总DNA质量均较高，且紫外分光光度计下测定各菌株的260/280均在1.7-2.0之间，可满足后续PCR要求。
3、PCR扩增
(1)单因素优化
将退火温度、模板DNA浓度、引物用量、Mg2+用量、dNTP用量作为变量，分别进行单因素试验，每确定一个单因素水平就作为后续研究的条件。50μL多重PCR反应体系中各因素与水平见表2，每个因素各试验了5个水平。
表2ITS-PCR体系优化因素与水平
PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，50-58℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳验证。
①退火温度优化
以黄曲霉DNA为模板，不同退火温度对多重PCR扩增影响见图2。结果表明，54℃至60℃时，多重PCR条带明显，52℃时条带稍弱。结合现实情况，确定最佳退火温度为56℃。
②模板DNA用量优化
以黄曲霉DNA为模板进行PCR反应，不同模板DNA用量对多重PCR扩增的影响见图3。结果表明，当DNA浓度为1ng/μL时，条带极弱，当DNA浓度高于10ng/μL时，多重PCR体系呈现稳定的条带；因此模板DNA浓度应不低于1ng/μL。
③引物用量优化
不同引物用量对多重PCR扩增的影响见图4。由图4可见，当引物用量达到4μL时，出现较为明显的多重条带，引物用量达到5μL时，条带略显明显。
④Mg2+用量优化
不同Mg2+用量对多重PCR扩增的影响见图5。由图5可见，Mg2+用量对PCR体系的影响较大，2μL时仅出现微弱的条带，3μL时多重条带最亮，4μL及5μL时条带亮度渐弱。
⑤dNTPs用量优化
不同dNTPs用量对多重PCR扩增的影响见图6。由图6可见，2μL开始出现微弱条带，3和4μL条带较为明亮，5μL时条带开始变弱。
(2)多重PCR反应体系正交优化
通过单因素试验结果，确定了模板DNA用量，引物用量，Mg2+用量，dNTPs用量的适宜范围，采用4因素3水平的正交试验方法(表3)，根据L9(3)4正交表，进行正交试验。正交实验表和正交结果见表4和图7。
表3正交试验因素与水平表
表4多重PCR反应体系正交试验表
由图7可见，试验号1、6、8初次试验无条带，重复操作后仅6号无条带，其余均有条带；试验号2、3、4、5、7、9均出现较为明亮的多重条带，其中2号条带更为明亮，重复试验后，结果一致。结合单因素试验和正交试验，最终确定最优PCR体系为，50μL体系中含有：引物(5μM)3μL，dNTPs(2.5mmol/L)5μL，Mg2+(2.5mmol/L)4μL，DNA浓度10ng/μL，退火温度56℃。
(3)多重PCR反应
以从各试验菌株中提取的总DNA作为模板，按照上述优化的多重PCR反应体系进行多重PCR反应，结果见图8。可以看出，黄曲霉、寄生曲霉、米曲霉出现明亮的三条带，其他不产生黄曲霉素的真菌均未同时出现三条条带。
将各菌株不同长度的PCR片段进行切胶后，进行回收及纯化，由上海生工生物工程有限公司上海测序部进行双向测序。所得序列用Conting Express校对拼接，去除低质量序列及引物区；用DNAman软件进行序列处理，并与NCBI核酸数据库中的黄曲霉、寄生曲霉、米曲霉的ver-1和verB基因序列进行比对验证，相似度均在99％以上，比对结果表明PCR片段即为目标条带。
上述试验结果表明本发明的引物组合对黄曲霉素产毒菌覆盖全面，能够100％检出黄曲霉素产毒菌。
(4)多重PCR灵敏度试验
将从试验菌株中提取的黄曲霉总DNA按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行梯度稀释，以稀释后的黄曲霉DNA作为模板，按照上述优化的多重PCR反应体系进行多重PCR反应，观察本发明的引物组合对黄曲霉素产毒菌的灵敏度，结果见图9。可以看出10-1～10-4稀释度均出现条带，说明本发明的引物组合对黄曲霉素产毒菌有较高的灵敏度，最低检出限为1.0×10-3ng/μL。
对比例1
本对比例的多重PCR引物组合不包含三组引物对，而是将三组引物对两两组合，而后采用与实施例1相同的反应体系和反应程序进行多重PCR反应，结果见图10、图11和图12所示。
结果表明，仅采用两对引物对进行多重PCR反应时，容易出现假阴性结果；将ITS通用序列与产生黄曲霉毒素的主要调控基因的扩增引物结合运用，构建产毒菌株的多重PCR体系，效果更佳。
序列表
<110> 丽水市中医院
<120> 用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法
<150> 2021111515209
<151> 2021-09-29
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 1
gtgaccccag aagtatgaac 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 2
gggaacccaa caagacgc 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 3
gggacaaggt tctagtgaag 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 4
cgatgacggc agtaaggt 18
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 5
agaagtcgta acaaggtttc cgtagg 26
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 6
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (5)

1.用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合，其特征在于，由以下三组引物对组成：
①用于特异性扩增杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1的引物对：
上游引物：5′-GTGACCCCAGAAGTATGAAC-3′；
下游引物：5′-GGGAACCCAACAAGACGC-3′；
②用于特异性扩增杂色曲霉素B基因verB的引物对：
上游引物：5′-GGGACAAGGTTCTAGTGAAG-3′；
下游引物：5′-CGATGACGGCAGTAAGGT-3′；
③用于特异性扩增真菌ITS序列的引物对：
上游引物：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′；
下游引物：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
2.如权利要求1所述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合，其特征在于，所述的黄曲霉素产毒菌包括黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）和米曲霉（Aspergillus oryzae）中的至少一种。
3.用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1-2中任意一项所述的快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合。
4.如权利要求3所述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR试剂盒，其特征在于，50μL的多重PCR反应体系中含有：5μM的引物对各3-5 μL，2.5mmol/L的dNTPs 3-7μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3-5μL，DNA模板浓度不小于1 ng/μL，余量为去离子水。
5.如权利要求4所述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR试剂盒，其特征在于，50μL的多重PCR反应体系中含有：5μM的引物对各3μL，2.5mmol/L的dNTPs 5μL，2.5mmol/L的Mg2+ 4μL，DNA模板浓度10ng/μL，余量为去离子水。
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