CN108753938A - 羌活遗传信息的研究方法 - Google Patents

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CN108753938A CN201810473656.3A CN201810473656A CN108753938A CN 108753938 A CN108753938 A CN 108753938A CN 201810473656 A CN201810473656 A CN 201810473656A CN 108753938 A CN108753938 A CN 108753938A
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radix notopterygii
karyogene
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杨路存
周国英
李长斌
聂秀青
熊丰
肖元明
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

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Abstract

本发明公开了一种羌活遗传信息的研究方法，涉及分子遗传学技术领域。本发明将分子系统地理学运用于濒危药用植物羌活的保护中，采用叶绿体基因和核基因分析了濒危药用植物羌活的分子系统地理结构；结果显示，羌活核基因和叶绿体基因的遗传多样性都比较低，但是核基因和叶绿体基因所显示的遗传结构不同：核基因显示羌活的遗传分化较大(遗传变异主要出现在群体间)，而叶绿体基因显示羌活的遗传分化较小(遗传变异主要出现在群体内)。羌活的核基因和叶绿体基因都显示：羌活没有明显的系统地理结构。

Description

羌活遗传信息的研究方法
技术领域
本发明涉及分子遗传学技术领域，尤其涉及一种羌活遗传信息的研究方法。
背景技术
羌活，中药名。别名羌青、护羌使者、胡王使者、羌滑、退风使者、黑药，伞形科、羌活属植物，多年生草本，高60-120厘米，根茎粗壮，伸长呈竹节状。生于海拔2000-4200m的林缘、灌丛下、沟谷草丛中，或生于海拔1700-4500m的林缘及灌丛内；分布于中国的陕西、四川、甘肃、青海、西藏。栽培3-4年秋季倒苗后至早春萌芽前割除地上部分，挖取根茎。根颈部有枯萎叶鞘。茎直立，圆柱形，中空，有纵直细条纹，带紫色。其性温，解表散寒、祛寒湿，用于外感风寒、头痛无汗、寒湿痹、上肢风湿疼痛。
羌活作为一种濒危药用植物，对其遗传结构和群体历史情况还未有充分了解，而分析羌活的遗传结构和群体历史发展可为羌活保护工作提供重要科学依据。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种羌活分子系统的研究方法，主要目的是从分子系统地理学角度分析羌活遗传信息以为其保护工作提供理论依据。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种羌活遗传信息的研究方法，所述方法是基于分子系统地理学，对羌活的母性遗传的叶绿体基因和双性遗传的核基因进行分析，得到羌活的分子系统地理学信息。
作为优选，所述羌活的分子系统地理学信息为：所述羌活的核基因和叶绿体基因的遗传多样性均较低；
所述核基因和所述叶绿体基因显示的遗传结构不同：所述核基因显示羌活的遗传分化较大，遗传变异主要出现在群体间；所述叶绿体基因显示羌活的遗传分化较小，遗传变异主要出现在群体内；所述核基因和所述叶绿体基因均显示羌活无明显的系统地理结构。
作为优选，所述叶绿体基因和核基因的分析方法为：提取羌活基因组DNA并检测，利用通用引物进行PCR扩增，对扩增产物进行DNA测序，根据测序结果分析羌活核基因和叶绿体基因的遗传信息。
作为优选，所述DNA的提取和检测方法：依据改良的CTAB法从硅胶干燥的叶片中提取羌活总DNA；通过测定紫外光吸收值来确定羌活DNA浓度和纯度；利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查羌活DNA完整性。
作为优选，所述通用引物为：
ITS1上游引物：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3'；
ITS4下游引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；
rp120上游引物：5'-TTTGTTC-TACGTCTCCGAGC-3'；
rps12下游引物：5'-GTCGAG-GAACATGTACTAGG-3'。
作为优选，所述扩增产物为nrDNA ITS(利用引物ITS1和ITS4，现有引物)和cpDNArpl20-rps12(利用引物rpl20和rps12，现有引物)；所述PCR扩增的反应体系为：反应体系为25μL，内含25mmol·L-1MgCl2 2μL，2.5mmol·L-1dNTPs 2μL，10μmol·L-1引物各0.6μL，25ng模板，10×buffer 2.5μL和1U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。
作为优选，所述nrDNAITS的扩增程序为：95℃预变性3min；35个循环:95℃变性0.5min，51℃退火0.5min，72℃延伸0.5min；最后72℃延伸10min。
作为优选，所述cpDNA rpl20-rps12扩增程序为：95℃预变性3min；35个循环:95℃变性0.5min，52℃退火0.5min，72℃延伸0.5min：最后72℃延伸10min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次将分子系统地理学运用于濒危药用植物羌活的保护中，采用叶绿体基因和核基因分析了濒危药用植物羌活的分子系统地理结构；结果显示，羌活核基因和叶绿体基因的遗传多样性都比较低，但是核基因和叶绿体基因所显示的遗传结构不同：核基因显示羌活的遗传分化较大(遗传变异主要出现在群体间)，而叶绿体基因显示羌活的遗传分化较小(遗传变异主要出现在群体内)。羌活的核基因和叶绿体基因都显示：羌活没有明显的系统地理结构。本发明方法从分子系统地理学角度分析了羌活的遗传信息，为以后羌活保护工作提供了可靠的理论基础。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的羌活nrDNAITS片段32种单倍型地理分布图；
图2是本发明实施例1提供的羌活cpDANrpl20-rps12序列片段39种单倍型地分布图图；
图3是本发明实施例1提供的羌活nrDNAITS片段32种单倍型进行序列比对的变异位点图(序列顺序为5’-3’)；
图4是本发明实施例1提供的羌活cpDANrpl20-rps12序列片段39种单倍型进行序列比对的变异位点图(序列顺序为5’-3’)；
图5A是本发明实施例1提供的nrDNAITS片段单倍型谱系图；
图5B是本发明实施例1提供的cpDANrp120-rps12序列片段单倍型谱系图；
(图5A和图5B中圆的大小与单倍型的频率一致)。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
分子系统地理学主要探讨种群分化的历史，研究这些种群现有分布格局形成是因为曾经经历过的气候变化、地壳运动等历史事件的影响，逐渐经过迁移和扩散、集群、甚至灭绝等过程而形成的。分子系统地理学研究的核心是遗传谱系空间分布的历史特征，通过种群遗传结构的分析来探讨种内系统地理格局的形成机制、系统发育关系以及现有分布特征，并结合种群的地理分布状况来发现和验证与其相关的地质事件，追溯和揭示种群的进化历程。
实施例1
本实施例从不同区域采集31种羌活作为研究对象，对每一个羌活进行以下操作，并记录实验数据，具体如表1所示；
对羌活基因组DNA的提取与检测：依据改良的CTAB法从硅胶干燥的叶片中提取总DNA；通过测定紫外光吸收值来确定DNA浓度和纯度；利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查DNA完整性；
PCR扩增与DNA测序：采用通用引物(该引物为现有引物)
ITS1上游引物：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3'，如SEQ ID NO.1；
ITS4下游引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，如SEQ ID NO.2；；
rpl20上游引物：5'-TTTGTTC-TACGTCTCCGAGC-3'，如SEQ ID NO.3；；
rps12下游引物：5'-GTCGAG-GAACATGTACTAGG-3'，如SEQ ID NO.4；；
分别扩增nrDNAITS序列(ITS1：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')；
和cpDNA rp120-rps12序列(rpl20：5'-TTTGTTC-TACGTCTCCGAGC-3'
rps12：5'-GTCGAG-GAACATGTACTAGG-3')；
扩增反应在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪上进行；
反应体系：25μL，内含25mmol·L-1MgCl2 2μL、2.5mmol·L-1dNTPs 2μL、10μmol·L-1引物各0.6μL、25ng模板、10×buffer 2.5μL和1U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)；
nrDNA ITS扩增程序：95℃预变性3min；35个循环:95℃变性0.5min，51℃退火0.5min，72℃延伸0.5min；最后72℃延伸10min；
cpDNA rp120-rps12扩增程序：95℃预变性3min；35个循环:95℃变性0.5min，52℃退火0.5min，72℃延伸0.5min；最后72℃延伸10min；
将两种PCR扩增产物经电泳检测纯化后由上海美吉生物医药科技有限公司测序(由于样本数量较多，仅对序列结果进行实验分析，不列举具体序列)。
实验数据分析：
图1、图2、图3、图4、图5A和图5B所示，用Clustal X软件进行序列对位排列，并加以手工适当校正。在所有序列校对正确后，用DnaSP软件统计变异位点，单倍型(haplotype)类型和变异位点百分率，以及核苷酸多样性。选用Arlequin软件进行分子方差分析(ANOVA)，计算居群内、居群间的变异方差分布。用Network4.2.01软件构建单倍型之间的关系图，在处理中点突变和插入缺失都做相同比重处理，并且每个插入缺失都独立于其它插入缺失。
应用软件PERMUT(http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/software/)计算居群内平均遗传多样性(average gene diversity within populations,HS)，总的遗传多样性(total gene diversity,HT)以及居群遗传分化系数GST和NST。GST值的计算过程只使用了单倍型频率，而NST则把单倍型之间的差异也考虑在内，其中GST值的大小代表了居群间遗传分化程度，即居群间的遗传多样性占总遗传多样性的比例，可用公式GST＝(HT-HS)/HT计算。使用U-统计方法对GST和NST进行比较(1,000次重复的置换检验)以检验单倍型变异的地理分布模式，当NST明显大于GST时(P<0.05)，表明亲缘关系相近的单倍型常常“集中”分布在同一地区，并且存在明显的分子系统地理学结构。上述数据记录和分析见表2-1、表2-2和表3。
通过表1、表2和表3的各种实验数据和分析可知：羌活核基因和叶绿体基因的遗传多样性都比较低，但是核基因和叶绿体基因所显示的遗传结构不同：核基因显示羌活的遗传分化较大(遗传变异主要出现在群体间)，而叶绿体基因显示羌活的遗传分化较小(遗传变异主要出现在群体内)；羌活的核基因和叶绿体基因都显示：羌活没有明显的系统地理结构；根据单倍型分布图推测：羌活在冰期时幸存于“避难所”，在间冰期从避难所长距离迁移到适合的生境，形成目前这种分布格局。
表1.31个羌活居群的经度、纬度、海拔及样本数
表2-1.羌活31个居群的ITS单倍型分布及遗传多样性
表2-2.羌活31个居群的cpDNA单倍型分布及遗传多样性
表3.羌活群体遗传变异的分子方差分析(ANOVA)
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 中国科学院西北高原生物研究所
<120> 羌活遗传信息的研究方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaagtcgta acaaggtttc cgtagg 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgttctac gtctccgagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgaggaac atgtactagg 20

Claims (8)

1.羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述方法是基于分子系统地理学，对羌活的母性遗传的叶绿体基因和双性遗传的核基因进行分析，得到羌活的分子系统地理学信息。
2.如权利要求1所述的羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述羌活的分子系统地理学信息为：所述羌活的核基因和叶绿体基因的遗传多样性均较低；
所述核基因和所述叶绿体基因显示的遗传结构不同：所述核基因显示羌活的遗传分化较大，遗传变异主要出现在群体间；所述叶绿体基因显示羌活的遗传分化较小，遗传变异主要出现在群体内；所述核基因和所述叶绿体基因均显示羌活无明显的系统地理结构。
3.如权利要求1所述的羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述叶绿体基因和核基因的分析方法为：提取羌活基因组DNA并检测，利用通用引物进行PCR扩增，对扩增产物进行DNA测序，根据测序结果分析羌活核基因和叶绿体基因的遗传信息。
4.如权利要求3所述的羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述DNA的提取和检测方法：依据改良的CTAB法从硅胶干燥的叶片中提取羌活总DNA；通过测定紫外光吸收值来确定羌活DNA浓度和纯度；利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查羌活DNA完整性。
5.如权利要求3所述的羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述通用引物为：
ITS1上游引物：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3'；
ITS4下游引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；
rpl20上游引物：5'-TTTGTTC-TACGTCTCCGAGC-3'；
rps12下游引物：5'-GTCGAG-GAACATGTACTAGG-3'。
6.如权利要求3所述的羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：反应体系为25μL，内含25mmol·L-1MgCl2 2μL，2.5mmol·L-1dNTPs 2μL，10μmol·L-1引物各0.6μL，25ng模板，10×buffer 2.5μL和1U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。
7.如权利要求3所述的羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述nrDNA ITS的扩增程序为：95℃预变性3min；35个循环:95℃变性0.5min，51℃退火0.5min，72℃延伸0.5min；最后72℃延伸10min。
8.如权利要求3所述的羌活遗传信息的研究方法，其特征在于，所述cpDNArpl20-rps12扩增程序为：95℃预变性3min；35个循环:95℃变性0.5min，52℃退火0.5min，72℃延伸0.5min：最后72℃延伸10min。
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