CN113789400B - 用于评估赭曲霉毒素a污染风险的pcr检测用引物对组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于评估赭曲霉毒素a污染风险的pcr检测用引物对组合、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，公开了一种用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合、试剂盒及检测方法。所述PCR检测用引物对组合含有特异性针对真菌内部转录间隔区序列ITS的ITS引物对和特异性针对赭曲霉毒素A卤化酶基因OTAhal的OTAhal引物对。试剂盒含有上述的ITS引物对和OTAhal引物对。检测方法包括以下步骤：提取待检测样品的总DNA作为模板DNA；利用所述ITS引物对和所述OTAhal引物对，分别对所述模板DNA进行PCR扩增；对各扩增产物进行检测，从而对所述待检测样品中产赭曲霉毒素A真菌的存在与否进行分析。该引物对组合的检测覆盖范围广、特异性强且灵敏度高，从而可实现对赭曲霉毒素A污染风险的高效准确评估。

Description

用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合、试 剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合、试剂盒及检测方法。具体而言，本发明涉及特异性地针对真菌通用分子标识序列、产赭曲霉毒素A生化合成过程中的关键基因OTAhal的用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
真菌是农业和食品行业中的主要微生物污染源之一，普遍存在于食品的生产、加工、包装、贮藏和运输等环节。真菌毒素则是真菌污染后所产生的次级代谢产物，具有强毒性、致癌性、神经毒性和免疫抑制作用，会对人类和动物的健康造成了严重的威胁。目前已被发现的真菌毒素大概有 400多种，全球约25％的农作物受到真菌毒素污染的影响，与食品和农产品相关的真菌毒素主要包括赭曲霉毒素(Ochratoxin)、伏马菌素 (Fumonisins)、黄曲霉毒素(Aflatoxins)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone) 和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol)等。赭曲霉毒素是全球公认在食品和动物饲料中最常见的污染物之一，根据其特征官能团的不同，可以分为赭曲霉毒素A、B、C和D，赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素家族中毒性最强的成员，不仅可抑制人类胚胎干细胞的吸附、存活和增殖，还能够诱导细胞的程序性死亡和氧化压力，被国际癌症机构(IARC)列为“2B”类致癌物。由于其理化性质稳定，不易被降解破坏，在很多食品，例如谷物、咖啡、葡萄酒、干果、坚果和肉制品等食物中都有被检出，为此世界很多国家都出台了对食品中OTA含量的限量标准。目前国内外对OTA的防控研究主要集中于OTA的定性和定量检测，采用的检测方法主要包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相-质谱法 (HPLC-MS/MS)、酶联免疫法(ELISA)和核酸适配体法(SELEX)等，但是上述方法不仅操作繁琐、耗时费力、灵敏度低，而且只能靶向于OTA 本身，无法在食品或者农作物被污染前进行有效预警，从而避免造成经济损失。因此，亟需一种快速、高效的产赭曲霉毒素A真菌鉴定方法来保障食品的质量与安全。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的赭曲霉毒素A的检测操作繁琐、耗时费力、灵敏度低，无法在食品或者农作物被污染前进行有效预警等问题，提供一种用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合、试剂盒及检测方法，该引物对组合的检测覆盖范围广、特异性强且灵敏度高，从而可实现对赭曲霉毒素A污染风险的高效准确评估。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种用于评估赭曲霉毒素A 污染风险的PCR检测用引物对组合，所述PCR检测用引物对组合含有特异性针对真菌内部转录间隔区序列ITS的ITS引物对和特异性针对赭曲霉毒素 A卤化酶基因OTAhal的OTAhal引物对；其中，
所述ITS引物对的序列为：
上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGG-3’；
下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
所述OTAhal引物对的序列为：
上游引物Hal-F：5’-GCYGGYATCRCCAGCACCAAGT-3’；
下游引物Hal-R：5’-ATRAACCASACCCAGCCGCTG-3’；
所述序列中Y为C或T，R为A或G，S为C或G。
本发明第二方面提供一种试剂盒，含有上述的用于评估赭曲霉毒素A 污染风险的PCR检测用引物对组合。
优选地，该试剂盒包括PCR检测工作液，所述PCR检测工作液含有T3 super PCRMix和所述PCR检测用引物对组合中的一组引物对。
优选地，所述PCR检测工作液中所述引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为1.5-5μM。
本发明第三方面提供一种利用上述的PCR检测用引物对组合评估赭曲霉毒素A污染风险的方法，该方法包括以下步骤：
S1、提取待检测样品的总DNA作为模板DNA；
S2、利用所述ITS引物对和所述OTAhal引物对，分别对所述模板DNA 进行PCR扩增；
S3、对各扩增产物进行检测，从而对所述待检测样品中产赭曲霉毒素 A真菌的存在与否进行分析。
优选地，步骤S1中所述待检测样品为食品、药品、动物组织样品或者人体组织样品。
优选地，步骤S2中所述PCR扩增的反应体系为：以总体积为25μL 计，加入含有模板DNA的溶液1μL、浓度分别为37.5-125μM的上游引物溶液和下游引物溶液各1μL、T3 superPCR Mix 22μL。
优选地，步骤S2中所述PCR扩增的反应条件为：90-100℃预变性 1-8min；90-100℃变性10-40s、55-65℃退火20-40s、65-75℃延伸45-100s，共进行20-40个循环；65-75℃延伸3-12min。
优选地，步骤S3中对各扩增产物进行检测采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
本发明第四方面提供上述的PCR检测用引物对组合、上述的试剂盒或者上述的方法在评估赭曲霉毒素A污染风险中的应用。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合，可以有效检测出产赭曲霉毒素A的真菌，不仅检测方法简单、效率高，而且检测覆盖范围广、特异性强且灵敏度高；本发明提供的使用PCR 检测用引物对组合评估赭曲霉毒素A污染风险的方法，可以在较短的时间内高通量地检测出产赭曲霉毒素A真菌，具备操作较简单、设备要求低等优势，以能够迅速对潜在的赭曲霉毒素A污染作出适当地干预，保障食品、药品的质量安全和人体的健康安全。
附图说明
图1是本发明中实施例3中ITS引物对和OTAhal引物对对供试菌株总 DNA的PCR扩增图谱，图1A为ITS引物对的PCR扩增图谱，图1B为OTAhal 引物对的PCR扩增图谱；
图2是PCR扩增的灵敏度检测图谱，图2A为OTAhal引物对对不同浓度的赭曲霉菌总DNA模板的PCR扩增图谱，图2B为OTAhal引物对混合总DNA模板的PCR扩增图谱。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种用于评估赭曲霉毒素A(简称OTA)污染风险的PCR检测用引物对组合，所述PCR检测用引物对组合含有特异性针对真菌内部转录间隔区序列ITS的ITS引物对和特异性针对赭曲霉毒素A卤化酶基因OTAhal的OTAhal引物对；其中，
所述ITS引物对的序列为：
上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGG-3’(SEQ ID NO:1)；
下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO:2)；
所述OTAhal引物对的序列为：
上游引物Hal-F：5’-GCYGGYATCRCCAGCACCAAGT-3’(SEQ ID NO:3)；
下游引物Hal-R：5’-ATRAACCASACCCAGCCGCTG-3’(SEQ ID NO:4)；
所述序列中Y为C或T，R为A或G，S为C或G。
具体地，所述OTAhal引物对中，
上游引物Hal-F可以为：5’-GCCGGTATCACCAGCACCAAGT-3’，
也可以为：5’-GCTGGYATCGCCAGCACCAAGT-3’，
又或者为：5’-GCCGGYATCGCCAGCACCAAGT-3’，
还可以为：5’-GCTGGYATCACCAGCACCAAGT-3’；
下游引物Hal-R可以为：5’-ATGAACCACACCCAGCCGCTG-3’；
也可以为：5’-ATGAACCAGACCCAGCCGCTG-3’；
又或者为：5’-ATAAACCACACCCAGCCGCTG-3’；
还可以为：5’-ATAAACCAGACCCAGCCGCTG-3’。
根据本发明，通过PCR检测用引物对组合检测产赭曲霉毒素A真菌是否存在，以实现评估赭曲霉毒素A的污染风险，所述产赭曲霉毒素A真菌优选为赭曲霉菌(Aspergillusochraceus)。在不增加实验步骤的前提下，为了进一步提高评估赭曲霉毒素A污染风险的准确性，还可以在赭曲霉毒素A生物合成途径的其它关键编码基因上设计特异性引物，比如PKS、NRPS 和bZIP区域，通过多重引物PCR的方法来实现更高的准确度。
本发明第二方面提供一种试剂盒，含有上述的用于评估赭曲霉毒素A 污染风险的PCR检测用引物对组合。
根据本发明，该试剂盒可以设置有含有上述的用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合的PCR检测工作液，一般情况下，PCR检测工作液可以根据PCR扩增的需要，还含有DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、缓冲液中的至少一者。
示例性地，所述PCR检测工作液含有T3 super PCR Mix和所述PCR检测用引物对组合中的一组引物对。根据本发明，试剂盒中ITS引物对和 OTAhal引物对分别设置独立的PCR检测工作液，即ITS引物对的PCR检测工作液内含有ITS引物对和T3 super PCR Mix，OTAhal引物对的PCR检测工作液内含有OTAhal引物对和T3 super PCR Mix。T3 super PCR Mix中含有PCR扩增所需要的DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等，一般情况下，T3 super PCR Mix中DNA聚合酶的浓度为0.5-2.5U，dNTP的浓度为200-250M，Mg2+的浓度为1-4mM。
优选情况下，所述PCR检测工作液中所述引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为1.5-5μM。具体地，可以将ITS引物对或OTAhal引物对的上游引物和下游引物分别利用TE缓冲液配置成浓度为37.5-125μM的溶液，再与T3 super PCR Mix以体积比1:1:22进行混合得到相应的PCR检测工作液。
根据本发明，以25μL体系的PCR最终反应溶液为例，含有模板DNA 的溶液1μl、PCR检测工作液24μl，其中，PCR检测工作液由上游引物(浓度为37.5-125μM)、下游引物(浓度为37.5-125μM)和T3 super PCR Mix 以体积比1：1：22混合得到。含有模板DNA的溶液中模板DNA的浓度优选为浓度为10pg/μL-100ng/μL。
本发明第三方面提供一种利用上述的PCR检测用引物对组合评估赭曲霉毒素A污染风险的方法，该方法包括以下步骤：
S1、提取待检测样品的总DNA作为模板DNA；
S2、利用所述ITS引物对和所述OTAhal引物对，分别对所述模板DNA 进行PCR扩增；
S3、对各扩增产物进行检测，从而对所述待检测样品中产赭曲霉毒素 A真菌的存在与否进行分析。
根据本发明，在提取待检测样品的总DNA之前，可根据待检测样品的种类对待检测样品进行粉碎等处理。为获得PCR检测的模板DNA，可利用可商购的DNA提取试剂盒获取待检测样品中的总DNA；或者，也可通过水煮裂解法获取待检测样品中的总DNA。
根据本发明，步骤S1中所述待检测样品可以为食品、药品、动物组织样品或者人体组织样品。
根据本发明，步骤S2中所述PCR扩增的反应体系为：以总体积为25μL 计，加入含有模板DNA的溶液1μL、浓度分别为37.5-125μM的上游引物溶液和下游引物溶液各1μL、T3super PCR Mix 22μL。
根据本发明，步骤S2中所述PCR扩增的反应条件为：90-100℃预变性 1-8min；90-100℃变性10-40s、55-65℃退火20-40s、65-75℃延伸45-100s，共进行20-40个循环；65-75℃延伸3-12min。
优选情况下，利用所述OTAhal引物对进行所述PCR扩增的反应条件为： 98℃预变性2min；98℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min，共进行30 个循环；72℃延伸5min。利用所述ITS引物对进行所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s；共进行25个循环；72℃延伸10min。
根据本发明，步骤S3中对各扩增产物进行检测采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。待检测样品的总DNA经ITS引物对进行PCR扩增，能扩增出ITS 目标条带，则证明DNA提取良好；待检测样品的总DNA经OTAhal引物对进行PCR扩增，能扩增出一条约为251bp的条带，则证明该待检测样品中存在产赭曲霉毒素A真菌，即存在赭曲霉毒素A污染风险。
本发明第四方面提供上述的PCR检测用引物对组合、上述的试剂盒或者上述的方法在评估赭曲霉毒素A污染风险中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，赭曲霉菌(Aspergillus ochraceus)、黄曲霉菌(Aspergillusflavus)、土壤伊萨酵母(Issatchenkia terricola)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，来源于上海保藏生物技术中心(SHBCC)，生长于马铃薯葡萄糖水培养基(PDA)；串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)来源于北京生物保藏中心(CGMCC)生长于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)；冠突散囊菌 (Aspergillus cristatus)为本实验室前期从茯砖茶中分离得到菌株，生长于 40％蔗糖麦芽浸膏培养基(M40Y)。
总DNA提取试剂盒购于杭州博日科技有限公司，T3 super PCR Mix、琼脂糖，DNAMarkerd等PCR试剂购于北京擎科生物科技有限公司；多功能PCR仪购于德国耶拿分析仪器股份公司，凝胶电泳槽购于北京君意东方电泳设备有限公司，凝胶成像系统购于伯乐生命医学产品有限公司。
实施例1、引物设计及筛选
从NCBI(http:www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中搜索有关赭曲霉毒素生物合成的研究，绘制赭曲霉毒素的生物合成途径，NRPS下游由OTAhal编码的卤化酶可以催化赭曲霉毒素B的氯原子加成，被证明是形成毒性更大的赭曲霉毒素A(OTA)的关键步骤，而赭曲霉毒素A可被进一步酯化或羟基化后形成其它赭曲霉毒素衍生物C和D。
Aspergillus steynii 3.53、Aspergillus westerdijkiae CECT 2948、Aspergillus carbonarius 350、Aspergillus niger 3.39、Penicillu nordicump CBS110.769为5株产赭曲霉毒素A的不同种真菌，赭曲霉毒素A的产量及各自卤化酶基因的表达量相关性均被实验验证，其卤化酶(OTAhal)的核酸序列的Gen Bank登入号分别为MG701897、MG701896、MG701890、 MG701892和MG701895。Leptoxyphium fumago和Caldariomyces fumago为 2株含有卤化酶基因不产赭曲霉毒素A的真菌，其卤化酶的核酸序列的Gen Bank登入号分别为AJ300448.1和KM575843.1。
通过系统进化树构建软件(MEGA软件)对不同的Hal编码基因进行多重比对分析，找出卤化酶(OTAhal)结构域特异的一段序列区域，在该区域进行兼并引物设计，只对产赭曲霉毒素A的菌株扩增出条带，得到OTAhal 引物对，
上游引物Hal-F为5’-GCYGGYATCRCCAGCACCAAGT-3’(SEQ ID NO:3)，
下游引物Hal-R为5’-ATRAACCASACCCAGCCGCTG-3’(SEQ ID NO:4)，
其中Y为C或T，R为A或G，S为C或G；
并与ITS PCR检测用引物对进行组合，ITS引物对的序列为
上游引物ITS1：5’-TCCGTA G GTGAACCTGCGGG-3’(SEQ ID NO:1)，
下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO:2)。
实施例2
针对所述ITS引物对和所述OTAhal引物对分别进行PCR扩增的反应体系及反应条件进行优化，确定了最佳的反应体系及反应条件。
所述ITS引物对和所述OTAhal引物对的最佳PCR反应体系为(以25μL 的PCR最终反应溶液计)：
含有模板DNA的溶液 1μl；
PCR检测工作液 24μl；
其中，PCR检测工作液由上游引物(浓度为100μM)、下游引物(浓度为100μM)和T3super PCR Mix以体积比1：1：22混合得到。
所述OTAhal引物对的最佳PCR反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min，共进行30个循环；72℃延伸5min。
所述ITS引物对的最佳PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性 30s；56℃退火30s；72℃延伸90s；共进行25个循环；72℃延伸10min。
实施例3 PCR扩增检测中各引物对检测特异性的比较
S1、将赭曲霉菌(A.ochraceus)、黄曲霉菌(A.flavus)、土壤伊萨酵母(I.terricola)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、串珠镰孢菌(F.moniliforme)和冠突散囊菌(A.cristatus)进行活化后，分别接种在各自对应的培养基中，在温度为28℃、转速为220r/min的摇床内培养2-3d。待菌株生长好后用50ml 离心管收集，4℃、5000r/min离心收集菌丝体，用蒸馏水清洗除去菌丝表面的培养基，将菌丝加液氮研磨成细粉，采用BioFlux试剂盒进行总DNA的提取，提取流程参考说明书。
S2、分别以赭曲霉菌(A.ochraceus)、黄曲霉菌(A.flavus)、土壤伊萨酵母(I.terricola)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、串珠镰孢菌(F.moniliforme) 和冠突散囊菌(A.cristatus)的总DNA作为模板DNA；以浓度为10ng/μL 的模板DNA溶液1μL、浓度为100μM的引物ITS1溶液1μL、浓度为100μM 的引物ITS4溶液1μL和T3 super PCR Mix 22μL形成PCR反应体系，进行 PCR扩增；以浓度为10ng/μL的模板DNA溶液1μL、浓度为100μM的引物Hal-F溶液1μL、浓度为100μM的引物Hal-R溶液1μL和T3 super PCR Mix 22μL形成PCR反应体系，进行PCR扩增；
OTAhal引物对的PCR扩增反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s； 60℃退火30s；72℃延伸1min，共进行30个循环；72℃延伸5min；
ITS引物对的PCR扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s； 56℃退火30s；72℃延伸90s；共进行25个循环；72℃延伸10min；S3、PCR 扩增反应产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪成像并观察结果，如图1所示。
由图1A可知，赭曲霉菌(A.ochraceus)、黄曲霉菌(A.flavus)、土壤伊萨酵母(I.terricola)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、串珠镰孢菌(F.moniliforme) 和冠突散囊菌(A.cristatus)均能扩增出ITS目标条带，证明DNA提取良好且均为对应菌株。
图1B中OTA-P代表产生赭曲霉毒素A的菌株，OTA-NP代表不产生赭曲霉毒素A的菌株，图1B所示的结果表明，只有赭曲霉菌(A.ochraceus) 能扩增出一条约为251bp的条带，其它菌株未扩增出该大小的条带，证明 OTAhal引物对针对产赭曲霉菌A真菌(赭曲霉菌)的检出具有特异性和有效性。黄曲霉菌(A.flavus)和串珠镰刀菌(F.moniliforme)也扩增出一些非特异性条带，可能是由于OTAhal引物对本身为兼并引物(大小分别为 22bp和21bp)，且黄曲霉菌(A.flavus)和串珠镰刀菌(F.moniliforme)的总基因组太大的原因，可以通过延长兼并引物片段或者缩短延伸时间来克服；食品中常见的冠突散囊菌(A.cristatus)、土壤伊萨酵母(I.terricola) 和酿酒酵母(S.cerevisiae)未扩增出任何条带。
实施例4 PCR扩增检测的灵敏度
分别以实施例2中步骤S1获得的赭曲霉菌(A.ochraceus)的总DNA 作为模板DNA；
以浓度为1ng/μL、0.1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL的模板 DNA溶液1μL、浓度为100μM的引物Hal-F溶液1μL、浓度为100μM的引物Hal-R溶液1μL和T3 super PCR Mix22μL形成PCR反应体系，进行PCR 扩增；PCR扩增反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s；60℃退火30s； 72℃延伸1min，共进行30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增反应产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪成像并观察结果，如图2A所示。图2A结果表明，对于赭曲霉菌的纯基因组DNA 条件下，当DNA浓度高于10pg/μL时，以OTAhal引物对进行PCR扩增，可以检测到目标条带，因此该方法的检出限为10pg/μL。
模板DNA溶液中含有实施例2中步骤S1获得的赭曲霉菌(A. ochraceus)、黄曲霉菌(A.flavus)、土壤伊萨酵母(I.terricola)、酿酒酵母 (S.cerevisiae)、串珠镰孢菌(F.moniliforme)和冠突散囊菌(A.cristatus) 六个菌株的总DNA，浓度分别为1ng/μL，以模板DNA溶液1μL、浓度为 100μM的引物Hal-R溶液1μL和T3 super PCR Mix 22μL形成PCR反应体系，进行PCR扩增；PCR扩增反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min，共进行30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增反应产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪成像并观察结果，如图2B所示。图2B的结果表明，当不同菌株基因组DNA与 1ng/μL赭曲霉菌纯基因组DNA混合时，以OTAhal引物对进行PCR扩增，能够检测到目标条带，因此，该方法可以在多种菌干扰的条件下，保持对产赭曲霉毒素A真菌的检测具有高灵敏度，可以在较短的时间内高通量的检测出产赭曲霉毒素A真菌，迅速对潜在的赭曲霉毒素A污染风险做出评估和适当地干预，具备推广到实际生产的潜力。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 长沙市口腔医院
<120> 用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合、试剂盒及检测方法
<130> 2021.07.05
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gcyggyatcr ccagcaccaa gt 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atraaccasa cccagccgct g 21

Claims (9)

1.一种用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合，其特征在于，所述PCR检测用引物对组合含有特异性针对真菌内部转录间隔区序列ITS的ITS引物对和特异性针对赭曲霉毒素A卤化酶基因OTAhal的OTAhal引物对；其中，
所述ITS引物对的序列为：
上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGG-3’；
下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
所述OTAhal引物对的序列为：
上游引物Hal-F：5’-GCYGGYATCRCCAGCACCAAGT-3’；
下游引物Hal-R：5’-ATRAACCASACCCAGCCGCTG-3’；
所述序列中Y为C或T，R为A或G，S为C或G。
2.一种试剂盒，其特征在于，含有根据权利要求1所述的用于评估赭曲霉毒素A污染风险的PCR检测用引物对组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括PCR检测工作液，所述PCR检测工作液含有T3 super PCR Mix和所述PCR检测用引物对组合中的一组引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR检测工作液中所述引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为1.5-5μM。
5.一种利用权利要求1所述的PCR检测用引物对组合评估食品或药品中赭曲霉毒素A污染风险的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、提取待检测样品的总DNA作为模板DNA；
S2、利用所述ITS引物对和所述OTAhal引物对，分别对所述模板DNA进行PCR扩增；
S3、对各扩增产物进行检测，从而对所述待检测样品中产赭曲霉毒素A真菌的存在与否进行分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述PCR扩增的反应体系为：以总体积为25μL计，加入含有模板DNA的溶液1μL、浓度分别为37.5-125μM的上游引物溶液和下游引物溶液各1μL、T3 super PCR Mix 22μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述PCR扩增的反应条件为：90-100℃预变性1-8min；90-100℃变性10-40s、55-65℃退火20-40s、65-75℃延伸45-100s，共进行20-40个循环；65-75℃延伸3-12min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3中对各扩增产物进行检测采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
9.权利要求1所述的PCR检测用引物对组合、权利要求2至4中任意一项所述的试剂盒或者权利要求5至8中任意一项所述的方法在评估食品或药品中赭曲霉毒素A污染风险中的应用。
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