CN112608985A - 快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物和方法，属于生物工程技术领域。本发明针对粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶设计了特异性引物对R1A1F/R1A1R，序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示，可以通过PCR技术实现对大曲、酒醅等样本中粟酒裂殖酵母的快速定性、定量检测；准确性高、有效性好、灵敏性高。本发明技术方案适用发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程的样品。

Description

快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物和方法
技术领域
本发明涉及快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物和方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
目前，中国大部分名优白酒都使用传统的大曲法酿造。大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过破碎、加水拌料、压成砖块状的曲醅后，在人工控制的温度、湿度下培养而成的。大曲中含有丰富的霉菌、酵母、细菌等微生物及它们产生的各种酶，是一种多菌种的混合粗酶制剂，其中，真菌的作用不容忽视。由于大曲中栖息着丰富的微生物，加曲不但使大量有益的酿酒微生物菌种直接转移到发酵酒醅，而且还给酒醅提供了以淀粉酶、蛋白酶为主的各种酶类，同时，大曲还给酒醅带来了数量可观的、多种多样的代谢产物，在赋予大曲酒更好的口味和香气方面起着重要作用。
粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是裂殖属的杆状酵母，被广泛应用于白酒酿造，是白酒酿造体系中的核心酵母，有较高的乙醇发酵能力，能够降低影响产品质量安全的氨基甲酸乙酯的浓度，是极具酿酒潜力的非酿酒酵母。筛选、鉴定和分析粟酒裂殖酵母，对改善白酒品质具有重要意义。现有的鉴定粟酒裂殖酵母的方法，主要利用菌株的理化性质或ITS4，这种鉴定方法存在周期长、费用高、成功率低等问题。
乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，简称ADH)是一类具有高度保守结构域的氧化还原酶，典型的乙醇脱氢酶是一种锌结合酶，其结构域中有一个锌结合结构域。该酶可充当二聚体，并依赖NAD(P)+辅助因子来可逆转化乙醇和乙醛。乙醇脱氢酶的基本功能是在无氧呼吸时，在糖酵解的最后一步反应中，将乙醛转化为乙醇。该反应可有效减轻无氧呼吸产生的代谢产物对细胞自身的毒害作用。除此以外，乙醇脱氢酶催化乙醛生成乙醇的过程也伴随着能量分子ATP的生成。在NADH生成NAD+的过程中会伴随生成一个H+，通过电子传递链，最终这个能量会转化为ATP中的高能磷酸键中储存的能量。当酿酒酵母在可发酵碳源如葡萄糖上生长时，乙醇醇脱氢酶被认为主要负责通过催化乙醛还原产生乙醇而从NADH中再生NAD+。此外，不同的酵母编码乙醇脱氢酶的基因序列是不同的。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有的鉴定粟酒裂殖酵母的方法，主要利用菌株的理化性质或ITS4，这种鉴定方法存在周期长、费用高、成功率低等问题。
[技术方案]
本发明提供用于鉴定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的引物，其序列如SEQ ID NO：2(引物R1A1F)、SEQ ID NO：3(引物R1A1R)所示。
本发明还提供应用所述引物鉴定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法，包括步骤：将待测样品制成菌悬液，将菌悬液稀释涂布获得单菌落，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列为引物进行菌落PCR，通过凝胶电泳观察PCR产物，如果电泳图谱上PCR产物在100-250bp之间有条带，则说明样品中含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，如果PCR产物不在100～250bp之间或者没有条带时，说明样品中没有粟酒裂殖酵母。
在一种实施方式中，所述样品含有菌体、基因组或宏基因组。可选地，所述样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，或者肠道、土壤、水体等环境样本；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。可选的，所述样品为发酵食品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品等。可选地，所述样品包括大曲或酒醅。
在一种实施方式中，还可以对100-250bp之间的PCR产物进行测序，并将测序结果与粟酒裂殖酵母的乙醇脱氢酶编码基因序列进行比对。
本发明还提供应用所述引物定量检测粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的方法，包括步骤：
(1)配置不同菌浓的、已知浓度的粟酒裂殖酵母菌悬液，分别提取菌悬液中的基因组；
(2)利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对基因组分别进行荧光定量PCR，以CT值为横坐标，以细胞数量或细胞数量的Lg值为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)提取待测样品中的基因组，利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对待测样品的基因组进行荧光定量PCR，将荧光定量PCR的CT值代入标准曲线，换算得到样品中的粟酒裂殖酵母的数量。
本发明提供区分粟酒裂殖酵母与库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拜尔结合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、白色假丝酵母(Candida humilis)、巴氏哈萨克斯坦酵母(Kazachstania barnettii)的方法，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列为引物，进行菌落PCR或分别以上述酵母的基因组为模板进行PCR，通过凝胶电泳观察PCR产物，如果电泳图谱上PCR产物在100-250bp之间有条带，则说明相应菌株是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
本发明提供用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的定性、定量的检测试剂盒，含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物，还包括DNA聚合酶及缓冲液。
使用所述试剂盒对粟酒裂殖酵母进行定性检测的方法，包括：将待测样品制成菌悬液，将菌悬液稀释涂布获得单菌落，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列为引物进行菌落PCR，通过凝胶电泳观察PCR产物，如果电泳图谱上PCR产物在100-250bp之间有条带，则说明样品中含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
使用所述试剂盒对粟酒裂殖酵母进行定性检测的方法，包括：(1)配置不同菌浓的、已知浓度的粟酒裂殖酵母菌悬液，分别提取菌悬液中的基因组；(2)利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对基因组分别进行荧光定量PCR，以CT值为横坐标，以细胞数量或细胞数量的Lg值为纵坐标，绘制标准曲线；(3)提取待测样品中的基因组，利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对待测样品的基因组进行荧光定量PCR，将荧光定量PCR的CT值代入标准曲线，换算得到样品中的粟酒裂殖酵母的数量。
所述样品含有菌体、基因组或宏基因组。可选地，所述样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，或者肠道、土壤、水体等环境样本；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。可选的，所述样品为发酵食品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品等。可选地，所述样品包括大曲或酒醅。
[有益效果]
本发明针对粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶NADP基因设计了特异性引物，可以通过PCR技术实现对大曲、酒醅等样本中粟酒裂殖酵母的快速定性和定量检测；准确性高、有效性好、灵敏性高。特别适用于发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程的样品中的粟酒裂殖酵母的鉴定及定量。
本发明利用特异性引物，能够将粟酒裂殖酵母与库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拜尔结合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、白色假丝酵母(Candida humilis)、巴氏哈萨克斯坦酵母(Kazachstania barnettii)进行区分，特异性引物只特异性扩增粟酒裂殖酵母的乙醇脱氢酶NADP，而不扩增另5种酵母的基因片段。
附图说明
图1：不同引物对的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，其中，1：为本发明使用的特异性引物ADH4F/ADH4R，2、3、4：参考类似方法设计的引物对2、3、4。
图2：不同酵母的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，其中，SP：粟酒裂殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，SC:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，PK：库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，ZB：拜尔结合酵母(Zygosaccharomyces bailii)，CH：白色假丝酵母(Candida humilis)，KB：巴氏哈萨克斯坦酵母(Kazachstaniabarnettii)，dd H2O：重蒸水。
图3：粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶基因的验证。
图4：不同株粟酒裂殖酵母的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，其中，P1：Schizosaccharomyces pombe NM_001023234、P2：Schizosaccharomyces pombeCU329672.1、P3：Schizosaccharomyces pombe NM_001023235.2、P4：Schizosaccharomycespombe NR_150068.1和P5：Schizosaccharomyces pombe AB001834。
图5：标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
YPD液体培养基：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。
YPD固体培养基：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。
实施例1：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)特异性引物的设计
特异性引物对的设计方法：
粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是白酒酿造体系中的核心酵母，通过京都基因与基因组百科全书代谢通路(KEGG Pathway)寻找粟酒裂殖酵母的特异性酶—粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶(Schizosaccharomyces pombe alcohol dehydrogenase NADP)，获取编码该特异性酶的966bp的核苷酸序列，序列如下：
atgtctgctgaacaaaagtatttcgaaaacgctcaaaacgttcatttcacacttgctgatggcagcaaaatccccggtttgggattgggtacctggagatcggagcccaatcaaactaaaaatgccgtaaagactgccttacaatatggctatcgccatattgatgcagcagccatctacggtaacgaggatgaagtaggtgatggcattaaagagagtggtgttcctcgcaaggacatttgggttacctcgaagctttggtgtaatgctcacgctcccgaggcagttcccaaggctttagagaagacattgaaagacttaaagttagactacttggatgaatatcttatccattggcctgtcagctttaagactggtgaggataaattccccaaagacaaggatggaaatctcatttacgagaaaaaccccattgaggaaacctggaaggcaatggagaagcttttggaaactggcaaggtacgtcacattggtctttccaacttcaacgatacaaacttggagcgtatcttaaaggttgccaaggttaagccagccgttcatcaaatggagcttcatcccttcttacctcaaactgaatttgtcgaaaagcataagaagcttggtatccacgtcaccgcctactcaccttttggcaatcaaaacaccatttacgaaagtaagattcccaagcttattgaacacgagaccattcaaaagattgccaagtctaaaggtgaaggtgtaactggagccactattgctgtttcttgggcaattacccgtggtacttctgtaattcccaaatccgttaatgaacaacgtatcaagtctaacttcaaatacattcctctcaccaaggaggatatggacgaaattaatagtatcggtattcgtgcccgttttaaccaagctacttttagcaatgaacctgtttttgccggcttggaagacggtcgtacttaa。
将该核苷酸序列通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)使用局序列排比检索工具(BLAST)进行比对，比对结果显示，该核苷酸序列仅与粟酒裂殖酵母基因组乙醇脱氢酶(Schizosaccharomyces pombe alcohol dehydrogenase NADP+，AKR1A1)序列具有100％的相似度，表明粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶(Schizosaccharomyces pombe alcoholdehydrogenase NADP+，AKR1A1)所对应的966bp的核苷酸序列是粟酒裂殖酵母的高度特异性序列。
利用NCBI Primer-BLAST工具，设定引物参数(Primer Parameters)；聚合酶链式反应(PCR)产物长度(PCR product size)80～300；设定引物对特异性验证参数(PrimerPair Specificity Checking Parameters)：数据库(Database)nr；其余参数按照默认设定；从所获得的对引物对中，利用DNAMAN软件挑选不能够自身成环(self-complementarity)的上游引物R1A1F-GCTGATGGCAGCAAAATCCC，和下游引物R1A1R-TTGCGAGGAACACCACTCTC。作为可能性目的引物对，PCR产物长度181bp(粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶编码基因的一部分)。以可能性目的引物对为上下游引物在NCBI中进行BLAST，比对结果只与粟酒裂殖酵母具有100％相似度，这表明所选引物对可能性目的引物对为适于此环境下的特异性引物对。
实施例2：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)特异性引物的筛选
首先，从酱香型白酒发酵过程中筛选核心酵母，称取10g酒醅样本于已灭菌的装有100mL无菌PBS缓冲液及3g玻璃珠的250mL的三角瓶中，然后置于30℃、200r/min摇床振荡混匀30min，静置5min获得菌悬液。将菌悬液进行稀释，取10-3、10-4和10-5三个稀释度的样品菌悬液涂布于YPD培养基平板中于30℃培养箱中培养72h，挑选挑取平板上的单菌落并编号，作为核心酵母类似菌株。
然后，使用酱香型白酒生产用的高粱浸出液制作斜面培养基，将筛选出的核心酵母类似菌株分离纯化后转移至试管斜面，于30℃培养，培养结束后于4℃下保存。
最后，提取基因组，并采用真核微生物通用正向引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和反向引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对基因组进行PCR扩增以鉴定菌株。PCR反应体系(50μL)：Taq DNAPolymerase(5U/μL)0.5μL，dNTP Mix(10mmol/L)1μL，上、下游引物(10μmol/L)各2μL，10×Taq Buffer(M g2+plus)5μL，基因组模板DNA10ng，超纯水补足至50μL。PCR反应条件：95℃3min；95℃15s，55℃30s，72℃45s，共30个循72℃10min。将PCR扩增得到的序列与NCBI网站系统中模式菌株的ITS扩增子序列进行对比，得到目标菌株的具体信息，从一众核心酵母中筛选获得粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
以粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶(Schizosaccharomyces pombe alcoholdehydrogenase NADP+，AKR1A1)所对应的966bp的核苷酸序列为目标，利用NCBI Primer-BLAST工具，设定引物参数(Primer Parameters)；聚合酶链式反应(PCR)产物长度(PCRproduct size)80～300；设定引物对特异性验证参数(Primer Pair SpecificityChecking Parameters)：数据库(Database)nr；其余参数按照默认设定；从所获得的对引物对中，利用DNAMAN软件挑选不能够自身成环(self-complementarity)的其它三对引物。以提取的粟酒裂殖酵母(SP)的基因组为模板，分别以上述四对引物(R1A1F/R1A1R、引物对2、引物对3、引物对4)，进行PCR扩增(PCR体系见表1)。反应参数：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，25个循环之后，72℃延伸30s，产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图1所示，其他的引物扩增效果显著不如实施例1的引物对R1A1F/R1A1R。
引物信息如下:
引物对2：
F1：GAACCCCGTATGAAGGTGGG
R1：TAGCTACCGACCATGACGGA
引物对3：
F1:：TACGGGGCCTCCAGATACTC
R1：GGCCACTCGGCGTAATCATA
引物对4：
F1：CGACCCAACGGGTATTTCCT
R1：CGGAACTCTCTCCTTTGGCG
表1 PCR验证体系
Reaction mixture Volume(μL)
Mixture 10
上游引物 1
下游引物 1
模板DNA 1
dd H<sub>2</sub>O 7
Total volume 20
实施例3：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)特异性引物对的验证
特异性引物对的验证：
以提取的粟酒裂殖酵母(SP)的基因组为模板，上述特异性引物R1A1F-GCTGATGGCAGCAAAATCCC，R1A1R-TTGCGAGGAACACCACTCTC作为引物，进行PCR。阴性对照分别为白酒酿造体系中的核心酵母酿酒酵母：库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii、PK)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae、SC)、拜尔结合酵母(Zygosaccharomycesbailii、ZB)、白色假丝酵母(Candida humilis、CH)、巴氏哈萨克斯坦酵母(Kazachstaniabarnettii、KB)以及重蒸水(dd H2O)。PCR体系和PCR条件同实施例2。PCR结束后，将产物进行凝胶电泳，并通过凝胶成像仪观察凝胶上的条带以确认引物的特异性情况，如图2所示，粟酒裂殖酵母在100～250bp附近有明显的目的条带，其余阴性对照没有条带，则表明所设计的特异性引物对具有对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的特异性。将粟酒裂殖酵母的PCR产物经过金唯智公司测定序列后，进行NCBI网站的blast验证，证实为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)上的乙醇脱氢酶基因(如图3所示)。
实施例4：引物对R1A1F/R1A1R的检测有效性、准确性实验
取粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的五株不同菌株Schizosaccharomyces pombe NM_001023234、Schizosaccharomyces pombe CU329672.1、Schizosaccharomyces pombe NM_001023235.2、Schizosaccharomyces pombe NR_150068.1和Schizosaccharomyces pombe AB001834，分别编号P1、P2、P3、P4和P5，分开提取上述5株粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)各自的基因组。使用上述特异性引物R1A1F-GCTGATGGCAGCAAAATCCC，R1A1R-TTGCGAGGAACACCACTCTC作为引物，对各基因组进行PCR，阴性对照为重蒸水(dd H2O)，然后电泳检测。结果发现：PCR产物均在100～250bp附近的范围内具有条带(如图4所示)，说明使用该引物确实能够扩增到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的乙醇脱氢酶基因，从而实现对样本中粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的快速鉴定。
实施例5：样本中乙醇脱氢酶基因的定量
实施例2获得的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)采用血球计数板法计数法查细胞数为9.9×107cells/mL，将其分别稀释到对应细胞数106、105、104、103、102、10cells/mL后，分别提取其基因组，以上述特异性引物R1A1F-GCTGATGGCAGCAAAATCCC，R1A1R-TTGCGAGGAACACCACTCTC为引物并通过StepOnePlus仪(购自赛默飞)进行荧光定量PCR(荧光定量PCR体系见表2)；以qPCR测得的CT值为横坐标，以稀释浓度对应的细胞数值为纵坐标，绘制标准曲线(标准曲线见图5)。
表2 qPCR验证体系
Figure BDA0002893914830000071
Figure BDA0002893914830000081
实施例6：样本中乙醇脱氢酶基因的定量的应用
称取10g大曲样本于已灭菌的装有100mL无菌PBS缓冲液及3g玻璃珠的250mL的三角瓶中，然后置于30℃、200r/min摇床振荡混匀30min，静置5min获得菌悬液。将菌悬液进行稀释，取10-3、10-4和10-5 3个稀释度的样品菌悬液涂布于YPD培养基平板中，于30℃培养箱中培养72h，挑选挑取平板上的单菌落并编号，使用特异性引物R1A1F-GCTGATGGCAGCAAAATCCC，R1A1R-TTGCGAGGAACACCACTCTC进行菌落PCR。实验结果显示，PCR产物在100～250bp之间有条带，说明大曲样本中含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。
利用“TIANGEN Plant Genomic DNAKit"试剂盒获取基因组，以所得基因组作为模板，以上述特异性引物R1A1F-GCTGATGGCAGCAAAATCCC，R1A1R-TTGCGAGGAACACCACTCTC为引物进行荧光定量PCR，PCR反应条件同实施例5，将获得的CT值代入图5标准曲线，最终得到大曲样本中酿酒酵母的含量为：106cells/g。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物和方法
<130> BAA201560A
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 粟酒裂殖酵母
<400> 1
atgtctgctg aacaaaagta tttcgaaaac gctcaaaacg ttcatttcac acttgctgat 60
ggcagcaaaa tccccggttt gggattgggt acctggagat cggagcccaa tcaaactaaa 120
aatgccgtaa agactgcctt acaatatggc tatcgccata ttgatgcagc agccatctac 180
ggtaacgagg atgaagtagg tgatggcatt aaagagagtg gtgttcctcg caaggacatt 240
tgggttacct cgaagctttg gtgtaatgct cacgctcccg aggcagttcc caaggcttta 300
gagaagacat tgaaagactt aaagttagac tacttggatg aatatcttat ccattggcct 360
gtcagcttta agactggtga ggataaattc cccaaagaca aggatggaaa tctcatttac 420
gagaaaaacc ccattgagga aacctggaag gcaatggaga agcttttgga aactggcaag 480
gtacgtcaca ttggtctttc caacttcaac gatacaaact tggagcgtat cttaaaggtt 540
gccaaggtta agccagccgt tcatcaaatg gagcttcatc ccttcttacc tcaaactgaa 600
tttgtcgaaa agcataagaa gcttggtatc cacgtcaccg cctactcacc ttttggcaat 660
caaaacacca tttacgaaag taagattccc aagcttattg aacacgagac cattcaaaag 720
attgccaagt ctaaaggtga aggtgtaact ggagccacta ttgctgtttc ttgggcaatt 780
acccgtggta cttctgtaat tcccaaatcc gttaatgaac aacgtatcaa gtctaacttc 840
aaatacattc ctctcaccaa ggaggatatg gacgaaatta atagtatcgg tattcgtgcc 900
cgttttaacc aagctacttt tagcaatgaa cctgtttttg ccggcttgga agacggtcgt 960
acttaa 966
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgatggca gcaaaatccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgcgaggaa caccactctc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaaccccgta tgaaggtggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagctaccga ccatgacgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tacggggcct ccagatactc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggccactcgg cgtaatcata 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgacccaacg ggtatttcct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggaactctc tcctttggcg 20

Claims (10)

1.鉴定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。
2.应用权利要求1所述引物鉴定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法，其特征在于，包括步骤：将待测样品制成菌悬液，将菌悬液稀释涂布获得单菌落，以SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3所示序列为引物进行菌落PCR，通过凝胶电泳观察PCR产物，如果电泳图谱上PCR产物在100-250bp之间有条带，则说明样品中含有粟酒裂殖酵母，如果PCR产物不在100～250bp之间或者没有条带时，说明样品中没有粟酒裂殖酵母。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，包括大曲或酒醅。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述样品中含有库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拜尔结合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、白色假丝酵母(Candida humilis)和巴氏哈萨克斯坦酵母(Kazachstania barnettii)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还对100-250bp之间的PCR产物进行测序，并将测序结果与粟酒裂殖酵母的乙醇脱氢酶编码基因序列进行比对。
6.应用权利要求1所述引物定量检测粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)配置不同菌浓的、已知浓度的粟酒裂殖酵母菌悬液，分别提取菌悬液中的基因组；
(2)利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对基因组分别进行荧光定量PCR，以CT值为横坐标，以细胞数量或细胞数量的Lg值为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)提取待测样品中的基因组，利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对待测样品的基因组进行荧光定量PCR，将荧光定量PCR的CT值代入标准曲线，换算得到样品中的粟酒裂殖酵母的数量。
7.区分粟酒裂殖酵母与库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拜尔结合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、白色假丝酵母(Candida humilis)、巴氏哈萨克斯坦酵母(Kazachstania barnettii)的方法，其特征在于，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列为引物，进行菌落PCR或分别以上述酵母的基因组为模板进行PCR，通过凝胶电泳观察PCR产物，如果电泳图谱上PCR产物在100-250bp之间有条带，则说明相应菌株是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
8.用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的定性、定量的检测试剂盒，其特征在于，含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物，还包括DNA聚合酶及缓冲液。
9.使用权利要求8所述试剂盒对粟酒裂殖酵母进行定性检测的方法，其特征在于，包括：将待测样品制成菌悬液，将菌悬液稀释涂布获得单菌落，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列为引物进行菌落PCR，通过凝胶电泳观察PCR产物，如果电泳图谱上PCR产物在100-250bp之间有条带，则说明样品中含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
10.使用权利要求8所述试剂盒对粟酒裂殖酵母进行定量检测的方法，其特征在于，包括：(1)配置不同菌浓的、已知浓度的粟酒裂殖酵母菌悬液，分别提取菌悬液中的基因组；(2)利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对基因组分别进行荧光定量PCR，以CT值为横坐标，以细胞数量或细胞数量的Lg值为纵坐标，绘制标准曲线；(3)提取待测样品中的基因组，利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物对待测样品的基因组进行荧光定量PCR，将荧光定量PCR的CT值代入标准曲线，换算得到样品中的粟酒裂殖酵母的数量。
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