CN112980980B

CN112980980B - 一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用

Info

Publication number: CN112980980B
Application number: CN202110440735.6A
Authority: CN
Inventors: 陆震鸣; 许正宏; 孙佳; 柴丽娟; 张晓娟; 史劲松
Original assignee: Jiangsu Hengshun Vinegar Industry Co ltd; Jiangnan University
Current assignee: Jiangsu Hengshun Vinegar Industry Co ltd; Jiangnan University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN112980980A

Abstract

本发明公开了一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用，属于生物工程领域。为了提高定量金山醋酸乳杆菌含量的准确性、稳定性和可靠性，节省定量的时间。本发明提供了一对特异性强，有效性好，准确性高的金山醋酸乳杆菌的分子标记和特异性定量金山醋酸乳杆菌的试剂盒，并构建了一种用于醋醅、酒醅、食醋样品中金山醋酸乳杆菌的快速鉴定、准确定量的实时荧光定量PCR方法，有助于在酿造生产过程或酿造产品中对该细菌的特异性定量和定性监测。

Description

一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用

技术领域

本发明涉及一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

金山乳杆菌(Lactobacillus jinshani)是从传统食醋醋酸发酵过程醋醅中分离获得的乳酸菌新物种，细胞为革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性和氧化酶阴性，杆状，无运动性和无芽孢形成，能够在20℃-40℃(最适35℃)，pH 3.0-5.0(最适4.0)，0％-5％氯化钠浓度(最适0％)，有氧/厌氧/微需氧条件下生长，产生D-乳酸和L-乳酸。随后，科研人员以乳酸菌科和明串珠菌科的全基因组序列为基础，通过评估其核心基因组系统发育、平均氨基酸特性、生理标准等将乳杆菌属(Lactobacillus)重新划分为25个新属，系统发育分析表明金山乳杆菌形成了一个单独的谱系，被重新命名为金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillusjinshanensis)，为醋酸乳杆菌属(Acetilactobacillus)的模式种，且为目前的唯一种。

根据已有研究报道，金山醋酸乳杆菌可在传统食醋、白酒发酵过程大量存在，属于酿造功能微生物。常规扩增子测序技术可以解析样本的物种组成和其相对丰度信息，对微生态研究具有重要的促进作用，但是微生物的相对丰度往往忽视了不同样本之间微生物量存在的差异，而绝对定量分析则是计量样本每种微生物的16S基因拷贝数或者数目，更能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异，因此在酿造微生物群落中对金山醋酸乳杆菌进行特异性定量分析将有助于酿造生产过程的监测与优化。

对醋醅中微生物定量检测的方法，一般采用选择培养基的筛选和纯培养分离计数的方法，但是，该方法受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力。普通的菌体应用CFU法即平板计数法，将样品稀释后直接涂布于平板上，然后对平板上的菌落进行计数。但是将厌氧培养4天的金山醋酸乳杆菌菌液稀释涂布平板对其进行计数，期望平板计数的数量与菌液浓度呈线性关系，但结果是两者线性关系极差，并不是稀释倍数越高，菌落数越少，是不适合使用平板计数法对其进行定量的，由于金山醋酸乳杆菌为从传统食醋酿造过程筛选得到的新物种，目前对于其在固体平板上生长的规律未可知，且其培养条件较特殊。

发明内容

本发明的目的是特异性的定量和定性检测金山醋酸乳杆菌，既提高检测金山醋酸乳杆菌含量的准确性、稳定性和可靠性，又节省定量的时间，解决传统微生物特异性检测的不足。本发明提供了一种SEQ ID NO：16所示的分子标记作为鉴定金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)的标志物的应用。

在一种实施方式中，SEQ ID NO：16所示的分子标记作为特异性定量金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)标志物的应用。

本发明还提供了一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO：1～2所示的引物对，所述引物对可以扩增SEQ ID NO：16所示的分子标记。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括SYBR Green Master Mix、标准品DNA和ddH₂O。

在一种实施方式中，所述标准品DNA是含有SEQ ID NO：16所示的分子标记的质粒。

本发明还提供了一种特异性定量金山醋酸乳杆菌的方法，所述方法的具体步骤如下：

(1)提取待检测样本中微生物的总DNA；

(2)利用AJ_F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和AJ_R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的引物对，然后以步骤(1)所述的总DNA为模板进行荧光定量PCR反应，根据公式copies/ml＝6.02×10⁽²³⁾×DNA浓度/MW和MW＝碱基数×DNA浓度确定金山醋酸乳杆菌的含量，其中copies/ml代表金山醋酸乳杆菌的含量。

在一种实施方式中，步骤(2)所述荧光定量PCR反应的反应体系为：AJ_F 1μL、AJ_R1μL、SYBR Green Master Mix 12.5μL，待检测样本中微生物的总DNA 1μL，ddH₂O 4.5μL。所述待检测样本中微生物的总DNA的浓度为50ng/μL-100ng/μL。

在一种实施方式中，步骤(2)所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，53℃退火10s，72℃延伸5s，35个循环。

本发明还提供了特异性定量金山醋酸乳杆菌的试剂盒或上述特异性定量金山醋酸乳杆菌的方法在对发酵产品中金山醋酸乳杆菌定量方面的应用。

在一种实施方式中，所述发酵产品包括但不限于醋醅、酒醅和食醋。

有益效果：本发明提供的了一种作为定性和定量金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)的SEQ ID NO.16所示的分子标记，可以快速和精准在待检测的样本中金山醋酸乳杆菌的含量，有助于在酿造生产过程或酿造产品中对该细菌的特异性定量监测，同时可以特异性检测金山醋酸乳杆菌。

附图说明

图1为引物特异性评价，其中，1是Acetobacter pasteurianus，2是Gluconacetobacter intermedius，3是Komagataeibacter europaeus，4是Lactobacillusacetotolerans，5是Lactobacillus.helveticus，6是Levilactobacillus brevis，7是Limosilactobacillus reuteri，8是Limosilactobacillus pontis，9是Limosilactobacillus panis、10是Limosilactobacillus fermentum，11是Limosilactobacillus timonensis，12是Lactobacillus buchneri，14是Acetilactobacillus jinshanensis，13是ddH₂O，M是2000bp marker；

图2为引物有效性评价，其中，1-18是Day1-Day18；19是ddH₂O；20是Ac.jinshanensis；M是2000bp marker；

图3为RT-qPCR熔解曲线与标准曲线，其中，A是熔解曲线，横坐标是温度，纵坐标是表示荧光强度的变化值；B是标准曲线，横坐标是每个反应管内荧光值达到阈值时的循环数Cq值，纵坐标是标准品浓度的对数；

图4为不同样本中与镇江香醋醋酸发酵过程金山醋酸乳杆菌含量，其中(A)是不同样本中金山醋酸乳杆菌含量，SC是四川，SD是山东，JS是江苏，SV是储存食醋，CP是醋醅，JP是酒醅，横坐标是不同的样本，左边的纵坐标是是固体样本中金山醋酸乳杆菌含量，右边纵坐标是液体样本中金山醋酸乳杆菌含量；(B)镇江香醋醋酸发酵过程金山醋酸乳杆菌含量，横坐标是时间，纵坐标是镇江香醋醋酸发酵过程金山醋酸乳杆菌含量；

图5为infB-F/R、mutL-F/R、tuf-F/R和dnaK-F/R对模式菌株进行PCR扩增结果，其中，1是Acetobacter pasteurianus，2是Gluconacetobacter intermedius，3是Komagataeibacter europaeus，4是Lactobacillus acetotolerans，5是Lactobacillus.helveticus，6是Levilactobacillus brevis，7是Limosilactobacillusreuteri，8是Limosilactobacillus pontis，9是Limosilactobacillus panis、10是Limosilactobacillus fermentum，11是Limosilactobacillus timonensis，12是Lactobacillus buchneri，13是Acetilactobacillus jinshanensis，M是marker。

具体实施方式

样品的采集：

醋醅样品：取样自江苏某食醋生产企业，发酵时间1-18天；四川某食醋生产企业，发酵时间为第12天、第18天；山东某食醋生产企业，发酵时间为第17天、第35天。

食醋样品：部分储罐食醋样品。

酒醅样品：取样自江苏某白酒生产企业，发酵时间为第10天、第70天；四川某浓香型白酒生产企业，发酵时间为第1天。采集窖泥样品，样品采集后如不能及时提取DNA应立即放入-80℃冰箱保存。

细菌基因组DNA提取：采用细菌基因组提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取标准菌株基因组DNA；醋醅、酒醅、食醋样品中微生物基因组DNA提取采用CTAB法。提取的DNA样品适当稀释后采用NanoDrop 2000确定DNA浓度，以A260/A280评价DNA纯度。

实施例1.鉴定金山醋酸乳杆菌

一、引物的设计：根据金山醋酸乳杆菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基(编码pheS基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)为模板序列设计特异性引物：AJ_F：5'-CACCGGCACCTAACATTTCG-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，AJ_R：5'-ACCATGGCCGACTTAAAGG-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。扩增片段长度199bp，GC含量55％，Tm值59℃，不存在互补序列。

二、引物的特异性：根据金山醋酸乳杆菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基(编码pheS基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)为模板序列设计特异性引物：AJ_F：5'-CACCGGCACCTAACATTTCG-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，AJ_R：5'-ACCATGGCCGACTTAAAGG-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。扩增片段长度199bp，GC含量55％，Tm值59℃，不存在互补序列。

以金山醋酸乳杆菌基因组作为阳性对照，醋醅中常见的12种细菌：耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)，罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，桥粘液乳杆菌(Limosilactobacillus pontis)，面包粘液乳杆菌(Limosilactobacilluspanis)，发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)，提蒙粘液乳杆菌(Limosilactobacillus timonensis)，布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，巴斯德醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius)，欧洲驹形杆菌(Komagataeibacter europaeus)，基因组作为阴性对照，不加样品作为空白对照进行PCR。经Nano Drop 2000测定DNA浓度后将其统一稀释为50ng/μL用作PCR的模板。

反应体系：上下游引物各1μL，Taq-酶12.5μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 9.5μL。

反应条件：95℃5min；95℃1min，53℃30s，72℃90s，35个循环。

利用引物AJ_F和AJ_R对12种不同的乳杆菌和醋杆菌分别进行PCR，电泳结果显示在泳道14上条带单一且长度在200bp左右，非金山醋酸乳杆菌属的菌株(泳道1-13)均无目的条带(结果如图1所示)，表明引物AJ_F和AJ_R的特异性较好。经测序，PCR产物的序列长度199bp，与Genebank中登录序列(CP034726.1)同源性为100％。

三、引物有效性：使用引物AJ_F和AJ_R对醋酸发酵过程醋醅基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2。1-18天醋醅样品均有条带显示，说明该引物可用于醋酸发酵过程醋醅中金山醋酸乳杆菌的检测。

实施例2.特异性定量金山醋酸乳杆菌

以醋醅、酒醅、食醋样品(醋或酒的酿造过程)每个样本的细菌总DNA为模板，使用含有目的片段的单拷贝克隆质粒(制备方法：利用SEQ ID NO:1所示特异性引物AJ_F和SEQID NO:2所示的AJ_R对金山醋酸乳杆菌进行PCR得到特异性目的片段(核苷酸序列如SEQ IDNO:16所示)，再将目的片段与pMD19-T Vector连接，获得重组质粒，再将重组质粒转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取成功转化的转化子进行扩大培养，获得质粒。)作为标准品，测定标准品浓度，并对其进行10倍稀释，设置10个梯度，以不同浓度标准品作为模板进行RT-qPCR。

反应体系：引物AJ_F和AJ_R各1μL，SYBR Green Master Mix 12.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 4.5μL，反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，53℃退火10s，72℃延伸5s，35个循环；以每个反应管内荧光值达到阈值时的循环数Cq值作为横轴，标准品浓度的对数作为纵轴，绘制定量标准曲线，扩增完成后绘制熔解曲线，RT-qPCR熔解曲线与标准曲线，对于金山醋酸乳杆菌的RT-qPCR方法。

引物灵敏度：检测拷贝数在2.24lg(copies/μL)-10.24lg(copies/μL)范围时，金山醋酸乳杆菌Real-time PCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。获得的标准曲线斜率为-0.2994，截距为12.5770，线性R²为0.9996，根据公式E＝10(-1/k)-1(k-标准曲线的斜率)，算得Real-time PCR的扩增效率为99.31％。另外金山醋酸乳杆菌Real-time PCR熔解曲线，在78℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。

如图3所示，按照公式计算金山醋酸乳杆菌的含量：copies/ml＝6.02×10⁽²³⁾×DNA浓度/MW，MW＝扩增产物的碱基数×DNA浓度。

对不同发酵时间醋醅、酒醅中金山醋酸乳杆菌的含量进行测定，阴性对照为无菌水，根据标准曲线计算金山醋酸乳杆菌在白酒酿造过程、食醋酿造过程、食醋中的含量，结果如图4所示，图4中的(A)中SC、SD、JS分别代表四川、山东和江苏，CP和JP分别代表醋醅和酒醅，SV代表食醋样品，d代表天数，图(B)代表一整个酿醋过程。根据特异性引物AJ_F和AJ_R对上述样品中金山醋酸乳杆菌的含量进行测定，根据标准曲线计算出的金山醋酸乳杆菌在白酒酿造过程、食醋酿造过程、食醋中的金山醋酸乳杆菌的含量，(A)中的数据为：发酵第12天的四川某食醋醋醅中金山醋酸乳杆菌含量为5.6±0.14lg(copies/g干醅)，发酵第18天的四川某食醋醋醅中金山醋酸乳杆菌含量为7.17±0.18lg(copies/g干醅)，发酵第17天的山东某食醋醋醅中金山醋酸乳杆菌含量为4.55±0.12lg(copies/g干醅)，发酵第35天的山东某食醋醋醅中金山醋酸乳杆菌含量为6.26±0.16lg(copies/g干醅)，发酵第10天的江苏某白酒酿造过程酒醅中金山醋酸乳杆菌含量为8.65±0.22lg(copies/g干醅)，发酵第70天的江苏某白酒酿造过程酒醅中金山醋酸乳杆菌含量为9.11±0.18lg(copies/g干醅)；此外，在某储罐食醋中也检测到2.49±0.06lg(copies/μL)和3.29±0.13lg(copies/μL)的金山醋酸乳杆菌，说明的就是各样品中含有金山醋酸乳杆菌的拷贝数。

图4中的(B)的数据如表1所示：

表1镇江香醋醋酸发酵过程金山醋酸乳杆菌含量结果

时间(天)	含量(lg(copies/g干醅))	时间(天)	含量(lg(copies/g干醅))
				1	5.57±0.11	10	8.92±0.20
2	5.50±0.05	11	8.73±0.10
				3	5.57±0.17	12	8.97±0.23
4	5.74±0.13	13	8.56±0.09
				5	6.30±0.04	14	8.63±0.05
6	6.35±0.07	15	8.74±0.18
				7	7.02±0.15	16	8.81±0.22
8	7.86±0.21	17	8.40±0.17
				9	8.72±0.09	18	8.40±0.17

表1和图4中的(B)说明金山醋酸乳杆菌在酿醋过程呈现逐渐上升而又趋于平稳的变化。

实施例3.特异性定量金山醋酸乳杆菌的试剂盒的制备

试剂盒成分：SEQ ID NO：1～2所示的引物对、SYBR Green Master Mix、标准品DNA(含有SEQ ID NO:16的质粒)和ddH₂O。

试剂盒的使用方法：以待检测的样本DNA为模板，利用上述试剂盒进行荧光定量PCR反应，对检测的结果进行分析。按照公式计算金山醋酸乳杆菌的含量：copies/ml＝6.02×10⁽²³⁾×DNA浓度/MW，MW＝扩增产物的碱基数×DNA浓度，计算待检测样品中金山醋酸乳杆菌的含量。

对比例1.

通过Genbank比对分析，选取与其它乳酸菌相似度最低的4种基因(infB核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示、mutL核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示、tuf核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示、dnaK核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示和pheS)序列作为模板序列用于设计引物基因序列。利用NCBI Primer-BLAST工具设定引物参数：PCR产物长度80-300bp；设定引物对特异性验证参数(Primer Pair Specificity Checking Parameters)：数据库(Database)：nr；其余参数按照默认设定；通过primer 5.0软件和DNAMAN软件分析，从所获得的引物对中挑选不能够自身成环、无引物二聚体的序列。infB-F/R、mutL-F/R、tuf-F/R和dnaK-F/R序列如表2所示。

表2引物序列

以金山醋酸乳杆菌基因组作为阳性对照，醋醅中常见的12种细菌(Acetobacterpasteurianus，Gluconacetobacter intermedius，Komagataeibacter europaeus，Lactobacillus acetotolerans，L.helveticus，Levilactobacillus brevis，Limosilactobacillus reuteri，Limosilactobacillus pontis，Limosilactobacilluspanis、Limosilactobacillus fermentum，Limosilactobacillus timonensis，Lactobacillus buchneri)基因组作为阴性对照，不加样品作为空白对照进行PCR。经NanoDrop 2000测定DNA浓度后将其统一稀释为50ng/μL用作PCR的模板。

反应条件：95℃5min；95℃1min，53℃30s，72℃90s，35个循环。

通过琼脂糖凝胶电泳判断各引物的特异性，结果如图5所示，InfB-F/R、mutL-F/R、tuf-F/R和dnaK-F/R均能扩增两种及以上的菌株，并且在对模式生物(1.Acetobacterpasteurianus、2.Gluconacetobacter intermedius、3.Komagataeibacter europaeus、4.Lactobacillus acetotolerans、5.L.helveticus、6.Levilactobacillus brevis、7.Limosilactobacillus reuteri、8.Limosilactobacillus pontis、9.Limosilactobacillus panis、10.Limosilactobacillus fermentum、11.Limosilactobacillus timonensis、12.Lactobacillus buchneri、13.Acetilactobacillus jinshanensis)进行PCR扩增均出现非特异性扩增。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的分子标记和试剂盒以及应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caccggcacc taacatttcg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

accatggccg acttaaagg 19

<210> 3

<211> 1047

<212> DNA

<213> Acetilactobacillus jinshanensis

<400> 3

atgtcgctta aggatcaatt aacccaatta agagacaagg gcttgtctga aatcaaacaa 60

gctactgatt taaagacctt gaaccagaag attagagttc agcttctggg taaaaagggt 120

ccgatcgtca agacgttacg tggaattggt aaattaccag ttagtcaacg cccgatcgtt 180

ggtaagtatg ctaaccaagt taaaggtcag ttattccgca gcttaaaaaa gcgtaatcta 240

gaattagcca aggctaagtt gaatgatgaa ctaaaggctg aaaagattga cgttacgtta 300

ccaggtaaac cggttaaagc tggtcatccg catttaattc aggttgttat ggatcatatc 360

tgtgatcttt tcatcggcat gggctacgaa gtcttaaacg gtaacgaagt tgaaactgat 420

gaatacaact ttgaacgaat gaatttacct aaacatcatc cagctcgtga tatgcaagct 480

actttctaca ttacaccgga taagaacttg ttattacgaa ctcagacttc tgggatgcaa 540

gctcgaactt tagaaaaaca tgacttttct aaaggtccgt taaagatgat ttcaccagga 600

gttgttttcc gtcgtgataa cgatgatgca acccattctc atcagttcca tcagatggaa 660

ggcctagtcg ttggtaagca cgttaccatg gccgacttaa agggaacctt agaatttttg 720

attcataaga tgttcggtaa cgaatttgat attcgtcttc gtccaagtta ctttccgttt 780

actgatccat cggttgaagt tgatatgact tgctttaatt gtggtggtaa aggctgttca 840

gtatgtaaag gtaccggttg gatcgaaatg ttaggtgccg gtgtcgttca ccctaacgtt 900

ttaaagaatg ctggtttaga tccgcacaag ttaaatggct ttgctttcgg tttagggatc 960

gatcgttttg ccatgttaaa gtacggtgtc gatgacattc gtgactttta cttaaacgac 1020

atgcgtttct tatcacagtt cgattaa 1047

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cccgttgctt ccgtcttagt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

accagcttct ggaacgctac 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aatacgccag ctcggttgaa t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgctaccga tgacctgctg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gcaccagaag aacagcaacg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tttgtggcat cggaccatca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gaagccgttg ctttaggtgc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tatcagcggc ggttgagaag 20

<210> 12

<211> 2188

<212> DNA

<213> Acetilactobacillus jinshanensis

<400> 12

atgggtaaaa aacgcgttta cacattagct cgtgaacttc atatgagtag taaacagctg 60

attactaagg caaataagaa agggattcat atcaagaatc atatggcaac ccttgattct 120

aaacaagaat ctcaagtccg acatgctgtt aaagcaagcc gaaattctaa gcccgctaat 180

aatcacaaat caaataatca tcacggtaat aatcgcaata atcaacatcg agtcaataat 240

cacaaatcga acgtaaataa atccaatcag cattcccata atggtaataa tcacaataac 300

aatcataaat cgaatgcttc taaatttgtt catcgtccga agagctactc gaaccaaaat 360

ggtaataaca attatcaccg tcataacaat aagaagcgtc gtcgatggaa ccgtcgacat 420

aaccgtaaca acaaccgtta cagcactaat cagcgaattc gtcagattca taagcataat 480

catgccccaa gacgaaaagc tcgtccgtta ccgaagactt tgtactacac ggtagggatg 540

aacgctcagg atattggtaa gattttacac cgtgctcctg ctgaaatcgt caaaaaatta 600

attgatttag ggattatggt taaccagaat aaatctctgg gtaaggatac cattgaattg 660

ttagctgttg cttaccatat caaggctaaa gaaaagaaac aggttaacat ttctgatatc 720

gataagatgt tcaagaaaga aatcaataac aagaaacacc ttgttcctcg tccaccagta 780

attaccatca tgggtcatgt tgatcatggt aagactacgt tattagatta ccttcgtcat 840

tctcatgtgg ctgcacatga agctggtggt attacccagg acattggtgc ttaccagatt 900

aaagaaaaag gtaagaccat tacgttctta gatactccag gtcatgctgc attctcagca 960

tgaagccatc gaccatgcta aggctgctaa gaccccaatt atcgttgcga ttaacaagat 1020

cgataaacca ggtgctaacc cgaagaaggt tactaaccag ttaactcgat acggcctaat 1080

ccctgaaaaa tggggtggta ataccatctt cgttaatatc tccgctaagt taggtactaa 1140

cgttaaagaa ttactggaca tgattattct taaggctgaa gtcatggaat taaaggctaa 1200

ccctaagcaa aatgccgccg gttctgttat tgaatcaaag ctagataagg gtaaaggtcc 1260

cgttgcttcc gtcttagttc aagaaggaac catgcacatc gaagatccaa tcgtagttgg 1320

cgatacgttc ggtcgagttc gtaccatgac taacgaaaat ggtaagcctt tgaagtctgc 1380

tggtccgtcc actccagttg aaattactgg attgagtagc gttccagaag ctggtgatcg 1440

tttcgttgtc tttgaccacg aaaaggatgc ccgtgctgct ggtgaacagc gtgctgaaca 1500

agctcagatg gaacgtcgta agcaggataa tactgttact ttgagtaact tattcagtac 1560

catgaagaag aacgatatga agaaagttaa cttgatcatc aaagccgatg ttcaaggttc 1620

cgttgaagcc attgactcaa gtttgaaaga tattaaagtc aagggggttc tagtaagtat 1680

cgtccattcc ggtgttggtg caatcaacga aagtgatgtt accttagctc aagctactaa 1740

tgcaatcgta ttaggattta atgttcgacc tacaccgcag gctaagattc aggctgaaaa 1800

ctataaagtt gatattcgac tttatgacgt tatctatgat ttaatcgatg aagttaaatc 1860

agctatgaaa ggtaagttag ctcctaagta taaagaagtt gttaccggag atgctgacgt 1920

ccgtcaactt tataaagctt ctgccgttgg tacgattgcc ggttgtatgg taacgaaagg 1980

ttacattggc aacggtaccc gaattcactt aatccgtgat aacaaagttg tttacactgg 2040

taagttagca agcttgaagc gttttaagaa tgatgctaaa gaagttaagc aaggctttga 2100

atgtggtatg acgatcgaag actataacga cattaaagtc ggtgatgtaa tcgaagctta 2160

taccatgaaa gccattccaa gaaagtaa 2188

<210> 13

<211> 1860

<212> DNA

<213> Acetilactobacillus jinshanensis

<400> 13

atggctaaaa tccataaatt gtcaccaacg ttatcgaatc aaatttctgc tggtgaagtt 60

gttgaacgac cgtcatccgt agattaaagt aactgatgat ggcatcggga ttgaacctga 120

cgatgttaaa actgcgttta tgcgacacgc caccagtaaa gtgatttatt tcaggtcgat 180

acgttaggtt ttcgaggtga agccttaccc agtatcgctt cagttgcgga tgttgatctg 240

aagacttcga ccggtggcga aggaactgag attcgaatta acggtggtaa attaatcggg 300

attcagccgg cagaagcacg acgtggaacg attattaccg ttaatgatct gttctttaat 360

acgccagctc ggttgaagta catgaaatca ccggcaacgg aactatctcg aattaccgat 420

gtgattgaca ggctagcact tggtcatcca aagattgctt tttcgttaat tcataatcat 480

catgagatgt taaggactgc cggtcgtggc aacctccagc aggtcatcgg tagcatttac 540

gggattaaca aggttaaaaa gatgttagct gttaaagcgc ataacaatga ctttaaactc 600

tggggttacg tcagtttacc tgaattaact cgagccagcc gtaattacat tacaatcatt 660

ttaaatggtc gttatatcaa aaatcgagcg attgctgacg ccgttattaa aggttacgga 720

tcgaaactaa tggttcgtcg ttatccaatc gcggtgatca acattcaaat ggacccgatt 780

ttagtggatc caaatgttca cccgtcaaag acgaccgtta gggttagcaa agaaccatcg 840

ttatgtcatt taataacgac gatgattatg aaccgactgt ctcaccagaa tttaattccg 900

aacgttatgc accgtgaata ttcggttcaa ccggagcaac cacactacga tgttcaccaa 960

attaatttgg atgttaatca agcttcggtt cattatcata agcagccggg taataatgaa 1020

atcaatcata atgttgctaa tgacacgtcg gttaagccca ttattattaa gagcaaggct 1080

gatttaaaat cagaacgggt tcgttcactt atcagtaaat atcgtaagga tcctattggg 1140

aagccctttg gcaaggaaac gcctaagagt atgaacgtaa actacgtgca tcgttccgaa 1200

tcaccaagtt tgcttcaaac taaatccgca gagcgatttc cgaaattgag gtacattggc 1260

cagatgcacg gttcatattt actgtgcgaa gccagtgatg gcttatacat tgttgatcag 1320

catgccgctc aggaacgggt taactatgaa tatttccggc aaaagattgg tcaagtttca 1380

aatgatgaac aggatttgtt agttccaatc gttttgagct attctaattc tgacgtgtta 1440

aaaattaagc agcatcttga cgtcttgcag agcgttggga ttaaattaga accgtttggt 1500

gcggacagct tcatcgttca tcagcacccc acctggttcc gacctggaca ggaacgatca 1560

acaattgagg aaatgattga ttgggtcctt aaaaatggta aaatttcaat tgcgaagttt 1620

cgagctaaga ccgcaatcat gatgagctgt aaacgggcaa tcaaggctaa tcattatttg 1680

aaccgggatc aggccatcag tttacttaat caccttagcc aagctgaaga tccgtttaac 1740

tgtccgcacg gtcgaccgac gttagttcat ttctcgaatt atgatatgca aaagatgttt 1800

aaacgggtgc aggatccgca tcattccgga ctctggaagc aatatcagtg gaaaaagtaa 1860

<210> 14

<211> 1191

<212> DNA

<213> Acetilactobacillus jinshanensis

<400> 14

atggcagtaa aacagtatat ccgtaaaaag ccacatgtaa atattggtac gattggccat 60

attgatcatg gtaaaacaac attaacttca gccattacta aagtcttatc tgaacagggc 120

ttagctaagg atgaagatta caagcaaatt gataaagcac cagaagaaca gcaacgtggt 180

atcacgatta acaacgccca cttagaatat cagacgcctt accgtgacta tgcccatgtt 240

gatgcccctg gacatgccga ttacatcaag aacatgatca ccggtgccgc tcagatggat 300

gccgccatct tagttgttgc cgctgatgat ggtccgatgc cacaaactcg tgaacatatc 360

ctgttagcac gtcagactgg tgttaagtac atcgttgtct tcatcaacaa agtcgacaaa 420

gttaaagata aagaattaat cgacttagtt gaaatggaaa ctcgtgactt attatccgaa 480

taccattacg aaggtaaaga tgttccagtt gtacgtggtt cagctttgaa agcattacag 540

ggtgataaga aggctcagga acaagttaag aagttaatgg aaatcattga tgaatacgtt 600

cctactccaa ctcgtgctta caacaagcca ttcttaatgc caatcgaaga tgtattcacc 660

atcactggtc gtggtaccgt tgttactggt cgtatctctc gtggtactat caagatccaa 720

gatcctgtac agattgttgg tttaactaaa cagaagactg atactgtatg tactggttta 780

cagacattcc gtaagaactt ggatgtcggt gaagccggtg ataacgttgg tatcttactc 840

cgtggtgtta agcgtacagg cgttgttcgt ggccaagtat tatctaaacc taataccgtt 900

gacgttcaca ctaagttcag tgcccacgtt tatgtattaa ccaagaaaga aggaggacgt 960

catagtccat tctttactgg ttaccagcca caattctact tctacaccag tgatgtaact 1020

ggtaaggtta ccttaccaaa aggtactaag atggtaatgc ctggtgataa tgtaagttca 1080

ttagatgttg aattacagaa gccagttgcc atggaaccta agacccgctt cactttccgt 1140

gaaggtggcc ataccattgg tgccggagtt gttactaagt tattaaacta a 1191

<210> 15

<211> 1866

<212> DNA

<213> Acetilactobacillus jinshanensis

<400> 15

atggcagtaa gtaacaagat tattggtatc gatttaggta ctactaattc tgcagttgcc 60

gttttagaag gcaaagaacc taagattatt actaatcctg atggcggtcg taccacacct 120

tcagttgttg catttaagaa tggtactcat caagttggtg atgttgctaa gcgtcagatg 180

attactaatc caaacacggt tgcatcaatt aagcgtcaca tgggtgaccc taattaccgt 240

gttcatgttg gtagcaaatc atatactcct cagcagattt ccgctatgat tttaggatac 300

atcaaagact tcgctgaaaa gtacattggt gctacggtta acaaagccgt catcactgtc 360

ccagcatact ttgatgatgc tcagcgtcag gccactaaag atgctggtaa gatcgctggt 420

ttagatgtta agcgtattat caacgaacca accgctgctt ccttagctta tggcttaaat 480

aagaagcagg accaaaagat tttggtctat gacttaggtg gtggtacttt tgatgtctcc 540

gtacttcagt taggtgacgg agtattccag gtactatcta ctaatggtga tacccactta 600

ggtggtgatg actttgatca ccgcatcatg aagtggttaa tcgaaggctt caagagtgct 660

cataatgttg acttatccaa agataagatg gcattacaac gtttaaagga cgcttctgaa 720

aaagctaaga aagccttatc aagtgaatca gaaactgaaa tcagcttacc attcatcgct 780

tctggtaaga ctggtccgtt acacttacag gcaaccttaa cccgtactaa gttcaacgaa 840

ttaacttctg acttagttga caagactaag attccattcc agaaagcatt aaaggatgct 900

cacttatcag tttctgacat cgaccacgtt atcttaaatg gtggctctac tcgtattcct 960

gctgttcaac aagctgttaa gcagtggagc ggtaaggaac ctgaccattc cattaaccca 1020

gatgaagccg ttgctttagg tgccgctatt caaggtggtg ttctaactgg taacgttaaa 1080

gacgttgttc ttttagatgt tactccactg tccttaggta ttgaaaccat gggtggtgta 1140

ttcactaagt taatcgatcg taacacgacc attccaacat ctaagaccaa ggtcttctca 1200

accgccgctg ataatcagac tggtgttgac attcacgtat tacaaggtga acgtccaatg 1260

gccgctgatg ataagagctt aggtcaattc cagttaacta acattccacc ggcaccacgt 1320

ggtgttccgc agatcgccgt cacttttgat atcgataaga acggtatcgt caacgtatcc 1380

gctaaggata aaggtactgg taagagtcaa aacattacca tcaagaatgc taatggctta 1440

tccgatgctg aaattaagaa gatgcgtaac gaagctaaag aaaacgaagc ttccgataag 1500

aagcgtaaag ctcaggttga cttaaagaac agtgttgacc agttaatctt ccagactgat 1560

aagaccaaga aagaagttaa gggtaaggta tcccaagact taatcgacaa ggccaacgca 1620

gccgaagatg acttaaagaa agctcgtaag tctggtaacg ttgatgacat gaagtccaag 1680

aagaccgcat taactaaggc tttacaaaac ttagatgttc agttatacaa gcataagggt 1740

ggtgctgcaa aaggcggctc taatgctaac ggcaataatg gatctaataa taacaacaac 1800

ggtaacggtg gtaatggtaa gaccgttaac ggaaacttcc ataccgttca taacaacaac 1860

aaataa 1866

<210> 16

<211> 160

<212> DNA

<213> Acetilactobacillus jinshanensis

<400> 16

gaaccttaga atttttgatt cataagatgt tcggtaacga atttgatatt cgtcttcgtc 60

caagttactt tccgtttact gatccatcgg ttgaagttga tatgacttgc tttaattgtg 120

gtggtaaagg ctgttcagta tgtaaaggta ccggttggat 160

Claims

1.SEQ ID NO：16所示的分子标记作为鉴定金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillusjinshanensis)的标志物的应用。

2.SEQ ID NO：16所示的分子标记作为特异性定量金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)标志物的应用。

3.一种用于特异性定量金山醋酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQID NO：1～2所示的引物对，所述引物对可以扩增SEQ ID NO：16所示的分子标记。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括SYBR Green MasterMix、标准品DNA和ddH₂O。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品DNA是含有SEQ ID NO：16所示的分子标记的质粒。

6.一种特异性定量金山醋酸乳杆菌的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

(1)提取待检测样本中微生物的总DNA；

(2)利用SEQ ID NO：1～2所示的引物对，以步骤(1)获得的总DNA为模板进行荧光定量PCR反应，根据公式公式一和公式二确定金山醋酸乳杆菌的含量，其中copies/ml代表金山醋酸乳杆菌的含量：

公式一：copies/ml＝6.02×10⁽²³⁾×DNA浓度/MW

公式二：MW＝扩增产物碱基数×DNA浓度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述荧光定量PCR反应的反应体系为：引物各1μL、SYBR Green Master Mix 12.5μL，待检测样本中微生物的总DNA 1μL，ddH₂O4.5μL；所述待检测样本中微生物的总DNA的浓度为50ng/μL-100ng/μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，53℃退火10s，72℃延伸5s，35个循环。

9.权利要求3-5任一所述的试剂盒在对发酵产品中金山醋酸乳杆菌定量方面的应用。

10.权利要求6-8任一所述的方法在对发酵产品中金山醋酸乳杆菌定量方面的应用。