CN110283926B - 一种玉米秸秆生物饲料发酵过程中菌群变化的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种玉米秸秆生物饲料中菌群变化的检测方法及其应用；具体检测方法为：首先对标准菌株进行复活培养，提取标准菌株的DNA，设计标准菌株的特异性引物序列；然后结合荧光定量PCR技术实现对玉米秸秆生物饲料发酵过程中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母快速、有效的定性、定量检测；本发明具有检测时间短、灵敏度高、特异性好、重复性好等优点，可以检测同属不同种的菌以及不同菌种但菌落形态和长势相近的菌类，还可以检测生物饲料中目标菌全体菌的菌落，包括活菌和死菌，实时监测生物饲料发酵过程中菌群的变化，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种玉米秸秆生物饲料发酵过程中菌群变化的检测方法及其应用。
背景技术
玉米秸秆是重要的农业副产品，含有丰富的营养和可利用的化学成分，玉米秸秆生物饲料作为一种绿色、环保型的饲料，已经成为当今动物营养研究的热点。
玉米秸秆生物饲料制作过程中，需要厌氧益生菌和需氧益生菌的共同作用。植物乳杆菌是一种存在于面包、奶油及一些蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能经由胃定植于肠道，能够更好地促进营养物质的吸收，同时也有一定的免疫调节作用；嗜酸乳杆菌具有调节肠道菌群、提高免疫力、降低产毒微生物的活性等功能；枯草芽孢杆菌具有不易致死的芽孢，可以耐受高温、高压，而且枯草芽孢杆菌菌体自身合成的多种酶(脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶等)在消化道中与动物体内的消化酶类可以一同发挥作用，提高动物的消化水平；地衣芽孢杆菌属厚壁菌门，是一种常见的革兰氏阳性细菌，它有调整菌群失调的能力，可以产生抗菌活性物质，从而抑制致病菌的生长繁殖；酿酒酵母可以为动物提供丰富的菌体蛋白，对动物肠道发育、肠道的菌群平衡具有良好的促进作用；热带假丝酵母生长速度较快，环境适应能力较强，还可以用来生产单细胞蛋白。
菌群的定量检测主要包括传统平板法和分子生物学方法两大类。传统平板法是微生物鉴定的基本方法，但存在耗时长、培养要求高、影响因素多、同属不同种的菌株之间形态特征相似，不好分辨等问题；而分子生物学技术具有检测时间短、灵敏度高、可以检测同属不同种的益生菌等优势；但是目前关于荧光定量PCR法定量检测菌群数量的报道，基本是检测动物或人肠道内的一些菌或者是发酵制品中的菌群，对微生物发酵饲料中菌群的变化研究较少；此外，对于微生物发酵饲料方面的研究多集中在饲料营养成分的改变和应用效果等方面，对发酵饲料中使用的多菌种之间的相互作用以及发酵过程中菌群动态变化规律方面的研究鲜有报道，在一定范围内制约了微生物发酵饲料的研究进展。
为快速定量监控玉米秸秆发酵过程中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母数量的动态变化，有必要建立一种快速、简便、准确的菌量检测方法。
发明内容
为了克服传统平板法定量检测菌群数量的缺点和不足，本发明目的在于提供一种玉米秸秆生物饲料菌群变化的检测技术及应用，该方法能在分子水平上检测出玉米秸秆生物饲料中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母的菌量，并能很好地对不同发酵时期的饲料样品进行定量分析，具有高效、特异性强、灵敏度高、可检测玉米秸秆生物饲料中同属不同种的益生菌等优点。
为了实现以上目的，本发明的具体步骤如下：
步骤一：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、热带假丝酵母、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌六种标准菌株进行复活培养；
步骤二：分别对步骤一复活培养后的六种标准菌株进行DNA的提取，获得六种标准菌株的DNA；
步骤三：分别设计六种标准菌株的特异性引物序列；
步骤四：以步骤二中提取的六种标准菌株DNA为模板，对应步骤三设计的特异性引物序列，分别对六种标准菌株进行普通PCR反应，获得PCR扩增产物；
步骤五：制作六种标准菌株的标准曲线，以步骤四得到的六种标准菌株PCR扩增产物经切胶、回收后所得的DNA片段进行稀释，稀释为1×10-7～1×10-2拷贝/μL，作为标准品，测定标准品的OD260/280值及DNA浓度，以标准品为模板进行SYBR Green为荧光染料的荧光定量PCR反应，反应完毕后，记录荧光定量PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Ct值)；然后将标准品的DNA浓度换算成质粒DNA拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值纵坐标，生成标准曲线。
步骤六：将六种标准菌株加入玉米秸秆中进行发酵，发酵后得到玉米秸秆生物饲料；然后提取玉米秸秆生物饲料中的DNA；以提取的DNA为模板，利用步骤三设计的不同菌株的特异性引物序列进行荧光定量PCR反应，反应结束后，得到Ct值，带入步骤五的标准曲线，分别计算玉米秸秆生物饲料样品中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母的数量。
优选的，步骤二中所述标准菌株DNA的提取方法为：将活化后的菌液进行离心，得到菌泥；称取1-2g菌泥，放入研钵中，加入液氮充分研磨，转移至离心管中并加入100μL的溶菌酶(浓度为50mg/mL)，混匀后37℃水浴30-60min，再加入6mL的DNA抽提缓冲液(抽提缓冲液包括100mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA，100mM Na3PO4，1.5mol/L NaCl，置于37℃摇床以225r/min摇30min，室温10000rpm离心5min，收集上清液转移至新的离心管中，再加入1.5mL浓度为10％的SDS，65℃水浴1.5-2h，每隔15-20min颠倒混匀一次，室温10000rpm离心5min，取上清液再次转移至新的离心管中，然后加入与上清液等体积氯仿和异戊醇的混合液(氯仿和异戊醇体积比为24:1)，10000rpm离心5-8min，弃上清液，再加入75％乙醇洗涤，10000rpm离心2min，弃上清液，得到沉淀物于超净工作台静置，待乙醇完全挥发，加入50-100μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀物，提取得到DNA；如存放备用，置于-20℃冷冻保存。
优选的，步骤三中所述六种标准菌株的特异性引物的序列如下：
枯草芽孢杆菌上游引物：5’-AAAATCCGCGCGTATCGTTG-3’
枯草芽孢杆菌下游引物：5’-CTCGGCCTGATTCGTATGCT-3’
扩增片段大小：520bp；
地衣芽孢杆菌上游引物：5’-GCCGGCTTCATGGGTTCCG-3’
地衣芽孢杆菌下游引物：5’-GCGTCGGTGCTTCTGTTG-3’
扩增片段大小：507bp；
植物乳杆菌上游引物：5’-CAGCACTAGATACCGCCCTG-3’
植物乳杆菌下游引物：5’-ATGTAGTGCCACGGTCGTTT-3’
扩增片段大小：211bp；
嗜酸乳杆菌上游引物：5’-AGACACGGCCCAAACTCC-3’
嗜酸乳杆菌下游引物：5’-GACAACGCTTGCCACCTA-3’
扩增片段大小：231bp；
酿酒酵母上游引物：5’-GCGATAACGAACGAGACCCTAA-3’
酿酒酵母下游引物：5’-CCAGCACGACGGAGTTTCACAAGAT-3’
扩增片段大小：225bp；
热带假丝酵母上游引物：5’-AAGAATTTAACGTGGAAACTTA-3’
热带假丝酵母下游引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
扩增片段大小：149bp。
优选的，步骤五中所述换算计算公式为：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)。
优选的，步骤五中所述荧光定量PCR反应的试剂盒为TaKaRa的SYBR Green PremixEx Taq试剂盒，试剂盒包括SYBR Green Premix Ex Taq和ROX Reference Dye；
所述荧光定量PCR反应的体系包含SYBR Green Premix Ex Taq10μL，ROXReference Dye0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，标准品2μL，去离子水补足至总体积为20μL；
所述荧光定量PCR反应条件为：先经过95℃预变性30s，之后扩增95℃5s，60℃31s，共40个循环。
优选的，步骤六中所述六种标准菌株的接种量均为玉米秸秆重量的0.1％～10％；所述玉米秸秆的含水量为30％～55％，发酵时间为0～30天。
优选的，步骤六中所述荧光定量PCR反应的试剂盒为TaKaRa的SYBR Green PremixEx Taq试剂盒，试剂盒包括SYBR Green Premix Ex Taq和ROX Reference Dye；
所述荧光定量PCR反应的体系包含SYBR Green Premix Ex Taq10μL，ROXReference Dye 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，玉米秸秆生物饲料DNA 2μL，去离子水补足至总体积为20μL；
所述荧光定量PCR反应条件为：先经过95℃预变性30s，之后扩增95℃5s，60℃31s，共40个循环。
本发明的有益效果是：
1、本发明应用荧光定量PCR方法检测玉米秸秆生物饲料中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母数量，检测时间短、灵敏度高、重复性号、特异性好，为以后在不同原料的生物饲料发酵过程中菌群变化的研究提供方法参考。
2、本发明中荧光定量PCR法可以检测同属不同种的菌以及不同菌种但长势及菌落相似的菌类。
3、本发明中荧光定量PCR法可以检测生物饲料中目标菌全体菌的菌落，包括活菌和死菌；死菌即使没有了活力，但死菌在生长过程中也积累了很多营养物质，在动物体内也会发挥一定的作用。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母的琼脂糖凝胶电泳验证图；
其中，M为DNA Marker，从上到下依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp，1、2号泳道为枯草芽孢杆菌；3、4号泳道为地衣芽孢杆菌；5、6号泳道为植物乳杆菌；7、8号泳道为嗜酸乳杆菌；9、10号泳道为酿酒酵母；11、12号泳道为热带假丝酵母；最后一个泳道为阴性对照。
图2为六种菌株做引物交叉后的引物特异性验证图；其中，(a)为枯草芽孢杆菌特异性验证图，(b)为地衣芽孢杆菌特异性验证图，(c)为植物乳杆菌特异性验证图，(d)为嗜酸乳杆菌特异性验证图，(e)酿酒酵母特异性验证图，(f)热带假丝酵母特异性验证图。
图3为六种菌株的标准曲线图；其中，(a)为枯草芽孢杆菌标准曲线图，(b)为地衣芽孢杆菌标准曲线图，(c)为植物乳杆菌标准曲线图，(d)为嗜酸乳杆菌标准曲线图，(e)为酿酒酵母标准曲线图，(f)为热带假丝酵母标准曲线图。
图4为荧光定量PCR法与平板法定量测定玉米秸秆生物饲料在不同天数的枯草芽孢杆菌数量的比较图。
图5为荧光定量PCR法与平板法定量测定玉米秸秆生物饲料在不同天数的植物乳杆菌数量的比较图。
图6为荧光定量PCR法与平板法定量测定玉米秸秆生物饲料在不同天数的酿酒酵母数量的比较图。
图7为荧光定量PCR法测玉米秸秆生物饲料中六种菌的变化规律图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件进行。
实施例中涉及的试剂和材料均为常规市售可得；实施例中的六种标准菌株具体为枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1086、地衣芽孢杆菌CGMCC1.813、酿酒酵母CGMCC2.1527、热带假丝酵母CGMCC2.637、植物乳杆菌CGMCC1.557、嗜酸乳杆菌CGMCC1.2467，均购自中国普通微生物菌种保藏中心。
实施例1：
(1)标准菌株的复活：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母、热带假丝酵母的菌液分别接种到新鲜液体LB培养基中，30℃恒温扩培，待测定OD600＝0.8时，菌体恢复活力，即得到活化后的菌液；
(2)标准菌株DNA的提取：将活化后的菌液进行离心，得到菌泥；称取1g菌泥放入研钵中，加入液氮充分研磨，转移至离心管中并加入100μL溶菌酶(浓度为50mg/mL)，混匀后37℃水浴30min，再加入6mL DNA抽提缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA，100mMNa3PO4，1.5mol/L NaCl)，置于37℃摇床以225r/min摇30min，室温10000rpm离心5min，收集上清液；向离心管中加入1.5mL浓度为10％的SDS，65℃水浴2h，每隔20min颠倒混匀一次，室温10000rpm离心5min，取上清液，加入与上清液等体积氯仿和异戊醇的混合液(氯仿和异戊醇体积比为24:1)，10000rpm离心5min，弃上清液，再加入75％乙醇洗涤，10000rpm离心2min，弃上清液，得到沉淀物于超净工作台静置，待乙醇完全挥发，加入75μL TE Buffer(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀物，提取得到DNA；
(3)设计枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母的特异性引物序列，特异性引物序列如下:
枯草芽孢杆菌上游引物：5’-AAAATCCGCGCGTATCGTTG-3’
枯草芽孢杆菌下游引物：5’-CTCGGCCTGATTCGTATGCT-3’
扩增片段大小：520bp；
地衣芽孢杆菌上游引物：5’-GCCGGCTTCATGGGTTCCG-3’
地衣芽孢杆菌下游引物：5’-GCGTCGGTGCTTCTGTTG-3’
扩增片段大小：507bp；
植物乳杆菌上游引物：5’-CAGCACTAGATACCGCCCTG-3’
植物乳杆菌下游引物：5’-ATGTAGTGCCACGGTCGTTT-3’
扩增片段大小：211bp；
嗜酸乳杆菌上游引物：5’-AGACACGGCCCAAACTCC-3’
嗜酸乳杆菌下游引物：5’-GACAACGCTTGCCACCTA-3’
扩增片段大小：231bp；
酿酒酵母上游引物：5’-GCGATAACGAACGAGACCCTAA-3’
酿酒酵母下游引物：5’-CCAGCACGACGGAGTTTCACAAGAT-3’
扩增片段大小：225bp；
热带假丝酵母上游引物：5’-AAGAATTTAACGTGGAAACTTA-3’
热带假丝酵母下游引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
扩增片段大小：149bp；
(4)以步骤(2)提取的DNA为模板，利用上述六种特异性引物序列进行普通PCR反应，获得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，六种菌PCR扩增产物的目的条带如图1所示；引物的特异性检测结果如图2所示，图(a)中枯草芽孢杆菌在520bp处有特异性扩增，而其他菌在该区无特异性扩增；图(b)中地衣芽孢杆菌分别在507bp处有特异性扩增，而其他菌在该区无特异性扩增；图(c)中植物乳杆菌在211bp处有特异性扩增，而其他菌在该区无特异性扩增；图(d)中嗜酸乳杆菌在231bp处有特异性扩增，而其他菌在该区无特异性扩增；图(e)中酿酒酵母在225bp处有特异性扩增，而其他菌在该区无特异性扩增；图(f)中热带假丝酵母在149bp处有特异性扩增，而其他菌在该区无特异性扩增。
(5)标准曲线的制作：
以步骤(4)得到的六种标准菌株PCR扩增产物经切胶、回收后所得的DNA片段做10倍系列稀释，使之成为1×10-7～1×10-2拷贝/μL，作为标准品，测其OD260/280值及DNA浓度，进行SYBR Green为荧光染料的实时定量PCR反应；所述荧光定量PCR反应的试剂盒为TaKaRa的SYBR Green Premix Ex Taq试剂盒，试剂盒包括SYBR Green Premix Ex Taq和ROXReference Dye；
荧光定量PCR反应的体系包含SYBR Green Premix Ex Taq10μL，ROX ReferenceDye0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，标准品模板2μL，去离子水补足至总体积为20μL；
荧光定量PCR反应条件为：先经过95℃预变性30s，之后扩增95℃5s，60℃31s，共40个循环；
然后，将标准品的DNA浓度换算成质粒DNA拷贝数，计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；反应完毕后，由系统软件自动分析得到Ct值；以拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，生成标准曲线；结果如图3所示，所述枯草芽孢杆菌的标准曲线拟合方程为：y1＝-3.3699x+35.2728；所述地衣芽孢杆菌的标准曲线拟合方程为：y2＝-3.3376x+41.9429；所述植物乳杆菌的标准曲线拟合方程为：y3＝-3.3078x+42.112；所述嗜酸乳杆菌的标准曲线拟合方程为：y4＝-3.3776x+39.1564；所述酿酒酵母的标准曲线拟合方程为：y5＝-3.3836x+39.9963，所述热带假丝酵母的标准曲线拟合方程为：y6＝-3.3644x+42.6568；
(6)先将标准菌株加入到100g玉米秸秆中进行发酵，发酵后得到玉米秸秆生物饲料；标准菌株的接种量为玉米秸秆重量的5％；玉米秸秆的含水量为40％；提取玉米秸秆生物饲料样品中的DNA，方法同步骤(2)，区别是将菌泥替换为玉米秸秆生物饲料；以玉米秸秆生物饲料样品的DNA为模板，利用步骤(3)设计的特异性引物序列进行荧光定量PCR反应，荧光定量PCR反应的试剂盒为TaKaRa的SYBR Green Premix Ex Taq试剂盒，试剂盒包括SYBRGreen Premix Ex Taq和ROX Reference Dye；
荧光定量PCR反应的反应体系为20μL，包含SYBR Green Premix Ex Taq10μL，ROXReference Dye 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，玉米秸秆生物饲料DNA模板2μL，去离子水补足至20μL；
荧光定量PCR反应的条件为：先经过95℃预变性30s，之后扩增95℃5s，60℃31s，共40个循环；
采用7300型荧光定量PCR仪进行扩增与分析，在PCR反应过程中，所形成的DNA会和荧光染料结合，两者结合后形成的荧光信号可被检测到，反应结束后，得到Ct值，带入步骤(5)的标准曲线，分别计算玉米秸秆生物饲料样品中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母的数量。
实施例2：
玉米秸秆生物饲料发酵过程中菌群数量变化的分析：将玉米秸秆生物饲料中提取的DNA按实施例1中的步骤(6)的方法进行荧光定量PCR反应；然后设立两组对照，其中一组将DNA替换为水，另一组将DNA替换为标准品；每个样品做3个平行，以保证实验数据的有效性和可重复性，并根据标准曲线计算发酵样品中枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的拷贝数，得到三种菌的数量；结果如图4、5、6所示。通过检测结果可知荧光定量PCR测定的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的数量分别在第3、5、5天达到最大值，呈现先快速增加然后缓慢下降，最后趋于平缓的趋势；比较了平板法和荧光定量PCR法，总体来说，荧光定量PCR测得的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的数量普遍大于平板法测得的菌量，但两种方法测得的结果有相似的变化规律，而且荧光定量PCR法测得的三个平行结果的方差要小于平板法的三个平行结果的方差，所以荧光定量PCR方法的精确度更高，荧光定量PCR省去了平板法需要恒温培养数小时的步骤，更省时省力，说明荧光定量PCR可以用来替代传统平板法定量测定玉米秸秆生物饲料中的菌量。
实施例3：
称取100g玉米秸秆为原料，原料含水量为40％，添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母进行共同发酵，菌种添加量均为原料含量的5％，探讨需氧菌与厌氧菌在发酵过程中菌群的变化规律；具体步骤为：先添加需氧菌(枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌和热带假丝酵母)发酵12h后再添加厌氧菌(植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌)，然后立即封包，进行厌氧发酵，每个样品均设3个重复；结果如图7所示，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母都在发酵第3天达到峰值，分别为2.75×106CFU/g和5.49×106CFU/g；植物乳杆菌在第5天出现峰值，为6.76×107CFU/g；地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和热带假丝酵母发酵初期都在缓慢增长，分别于第5天、第15天和第15天达到峰值，分别6.17×106CFU/g、1.55×107CFU/g和9.55×106CFU/g，发酵20天后趋势平稳；在发酵初期，随着厌氧环境的增强，更有助于厌氧益生菌的发酵，厌氧益生菌产生的酸使得饲料中的pH降低，当pH降低到一定水平时，厌氧益生菌本身也会受到抑制，从而导致发酵后期厌氧益生菌的菌量有下降的趋势；荧光定量PCR技术可以快速准确定量玉米秸秆生物饲料发酵过程中的不同种类的菌的数量，并且试验重复性好，为以后检测不同种类的菌株奠定了实验基础，为玉米秸秆生物饲料中菌群变化的相关研究提供了一种有效检测手段，同时也可以了解加入玉米秸秆中发酵的菌群之间是否存在协同作用，以及菌群的数量在发酵多久后达到峰值，因此为优化玉米秸秆生物饲料的发酵工艺提供指导意义。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (7)
1.一种玉米秸秆生物饲料发酵过程中菌群变化的检测方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤一：选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、热带假丝酵母、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌六种标准菌株进行复活培养；
步骤二：分别对步骤一复活培养后的六种标准菌株进行DNA的提取，获得六种标准菌株的DNA；
所述标准菌株DNA的提取方法为：将活化后的菌液进行离心，得到菌泥；称取1-2g菌泥，放入研钵中，加入液氮充分研磨，转移至离心管中并加入100μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，混匀后于37℃水浴30-60min，再加入6mL的DNA抽提缓冲液；所述DNA抽提缓冲液包括100mMTris-HCl pH 8.0、10mM EDTA、100mM Na3PO4和1.5mol/L NaCl；置于37℃摇床以225r/min摇30min，然后于室温10000rpm离心5min，收集上清液转移至新的离心管中，再加入1.5mL浓度为10％的SDS，65℃水浴1.5-2h，每隔15-20min颠倒混匀一次，室温10000rpm离心5min，取上清液再次转移至新的离心管中，然后加入与上清液等体积氯仿和异戊醇的混合液，其中氯仿和异戊醇体积比为24:1；经10000rpm离心5-8min后弃上清液，再加入75％乙醇进行洗涤，经10000rpm离心2min后弃上清液，得到沉淀物于超净工作台静置，待乙醇完全挥发，加入50-100μL的TE缓冲液溶解沉淀物，提取得到DNA；
步骤三：分别设计六种标准菌株的特异性引物序列；
所述六种标准菌株的特异性引物的序列如下：
枯草芽孢杆菌上游引物：5’-AAAATCCGCGCGTATCGTTG-3’
枯草芽孢杆菌下游引物：5’-CTCGGCCTGATTCGTATGCT-3’
扩增片段大小：520bp；
地衣芽孢杆菌上游引物：5’-GCCGGCTTCATGGGTTCCG-3’
地衣芽孢杆菌下游引物：5’-GCGTCGGTGCTTCTGTTG-3’
扩增片段大小：507bp；
植物乳杆菌上游引物：5’-CAGCACTAGATACCGCCCTG-3’
植物乳杆菌下游引物：5’-ATGTAGTGCCACGGTCGTTT-3’
扩增片段大小：211bp；
嗜酸乳杆菌上游引物：5’-AGACACGGCCCAAACTCC-3’
嗜酸乳杆菌下游引物：5’-GACAACGCTTGCCACCTA-3’
扩增片段大小：231bp；
酿酒酵母上游引物：5’-GCGATAACGAACGAGACCCTAA-3’
酿酒酵母下游引物：5’-CCAGCACGACGGAGTTTCACAAGAT-3’
扩增片段大小：225bp；
热带假丝酵母上游引物：5’-AAGAATTTAACGTGGAAACTTA-3’
热带假丝酵母下游引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
扩增片段大小：149bp;
步骤四：以步骤二中提取的六种标准菌株DNA为模板，对应步骤三设计的特异性引物序列，分别对六种标准菌株进行普通PCR反应，获得PCR扩增产物；
步骤五：制作六种标准菌株的标准曲线，以步骤四得到的六种标准菌株PCR扩增产物经切胶、回收后所得的DNA片段进行稀释，稀释为1×10-7～1×10-2拷贝/μL，作为标准品，测其OD260/280值及DNA浓度，进行荧光定量PCR反应，反应完毕后，得到Ct值；然后将标准品的DNA浓度换算成DNA拷贝数，以拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，生成标准曲线；
步骤六：将六种标准菌株加入玉米秸秆中进行发酵，发酵后得到玉米秸秆生物饲料；然后提取玉米秸秆生物饲料中的DNA；以提取的DNA为模板，利用步骤三设计的不同菌株的特异性引物序列进行荧光定量PCR反应，反应结束后，得到Ct值，带入步骤五的标准曲线，分别计算玉米秸秆生物饲料样品中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和热带假丝酵母的数量。
2.根据权利要求1所述的一种玉米秸秆生物饲料中菌群变化的检测方法，其特征在于，步骤五中所述换算计算公式为：拷贝数＝DNA浓度×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；其中DNA浓度单位为ng/μL。
3.根据权利要求1所述的一种玉米秸秆生物饲料中菌群变化的检测方法，其特征在于，步骤五和步骤六中所述荧光定量PCR反应的试剂盒为TaKaRa的SYBR Green Premix Ex Taq试剂盒，试剂盒包括SYBR Green Premix Ex Taq和ROX Reference Dye；
所述荧光定量PCR反应条件为：先经过95℃预变性30s，之后扩增95℃5s，60℃31s，共40个循环。
4.根据权利要求1所述的一种玉米秸秆生物饲料中菌群变化的检测方法，其特征在于，步骤五中所述荧光定量PCR反应的体系包含SYBR Green Premix Ex Taq10μL，ROXReference Dye 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，标准品2μL，去离子水补足至总体积为20μL。
5.根据权利要求1所述的一种玉米秸秆生物饲料中菌群变化的检测方法，其特征在于，步骤六中所述荧光定量PCR反应的体系包含SYBR Green Premix Ex Taq10μL，ROXReference Dye 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，玉米秸秆生物饲料DNA 2μL，去离子水补足至总体积为20μL。
6.根据权利要求1所述的一种玉米秸秆生物饲料中菌群变化的检测方法，其特征在于，步骤六中所述六种标准菌株的接种量均为玉米秸秆重量的0.1％～10％；所述玉米秸秆的含水量为30～55％，发酵时间为0～30d。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的方法应用于生物饲料发酵过程中菌群变化的监测。
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