CN112314782A - 一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及发酵膨化颗粒饲料 - Google Patents

一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及发酵膨化颗粒饲料 Download PDF

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Abstract

本发明涉及发酵饲料技术领域，具体公开了一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及发酵膨化颗粒饲料。该复合微生物制剂由自我筛选并保藏的保藏编号为CGMCC NO.20405的枯草芽孢杆菌B1菌株、自我筛选并保藏的保藏编号为CGMCC NO.14458的唾液乳杆菌LS菌株、以及从保藏中心购买的保藏编号为CGMCC NO.2.388的酿酒酵母菌J1菌株的三种菌液复合配比组成；该复合微生物制剂用于制备发酵膨化颗粒饲料。该发酵膨化颗粒饲料，采用了先将饲料加工制粒，再用复合微生物制剂进行复合发酵，发酵后无需再次加工制粒的制备工艺，既避免了活菌失活，也减少加工过程中营养物质的损失。具有代谢产物好、营养价值足、活菌含量高、投喂效果好等特点。

Description

一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及发酵膨化颗粒饲料
技术领域
本发明属于发酵饲料技术领域，具体涉及一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及发酵膨化颗粒饲料。
背景技术
益生菌(Probiotic)通常指有利于动物健康的一类能够在机体肠道内生存的活细菌。随着“无抗”时代的到来，益生菌的使用越来越广泛，益生菌在宿主肠道内能合成分泌一些动物机体所需要的氨基酸和维生素等营养物质，同时还能分泌一些蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，促进动物对饲料的消化吸收，提高饲料利用率，降低饲料系数；还能提高机体免疫力，维持肠道菌群结构平衡。其中芽孢杆菌 (Bacillus sp.)、乳酸菌(lactobacillus)以及酵母菌(saccharomyce)是水产养殖中应用较为广泛的几种微生态菌种，对水生动物的生长发育等有着积极作用。益生菌的使用多种多样，目前在水产养殖上主要用作发酵饲料、微生态制剂和饲料添加剂等方面。
发酵饲料指的是在人工控制的条件下，饲料中的微生物通过自身的生长、繁殖和代谢过程，将饲料中的某些抗营养因子分解或转化并且使饲料中的养分更容易被动物消化吸收。随着饲料原料成本的提高，高价的饲料抑制了水产行业的发展，而发酵饲料有望成为打破这种僵局的利器。目前发酵饲料的主要形式是先获得发酵豆粕，然后把发酵豆粕作为饲料原料，加入到发酵饲料中，再通过饲料生产加工工艺生产出成品饲料。这种发酵饲料中的益生活菌，会在饲料生产加工过程中失活，发酵产物中的部分营养物质也会有所损失，大大降低益生菌的益生效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有发酵饲料中所含的益生菌在饲料生产加工过程中容易失活，益生效果差等缺陷与不足，提供一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及其发酵膨化颗粒饲料。本发明采用自我筛选并保藏的枯草芽孢杆菌、唾液乳杆菌以及外购所得到的酿酒酵母，经复合配比成为用于发酵膨化颗粒饲料的复合微生物制剂；本发明所公开的发酵膨化颗粒饲料，是先将饲料加工制粒，再用上述复合微生物制剂进行复合发酵，发酵后无需再次加工制粒，既避免了活菌失活，也减少加工过程中营养物质的损失，保证发酵后的颗粒饲料不经过高温高压等一系列加工手段，充分保留其活性物质，如活菌等，并100％保留其丰富的代谢产物。
在此基础上设计三因素四水平的正交表(L16)来确定用于发酵的复合微生物中三株菌所占的比例和接种量，并通过测定发酵后的饲料的营养成分等来确定最佳发酵比例。
本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。
首先，本发明公开了一种用于发酵饲料的复合微生物制剂。
该复合微生物制剂，由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1菌株、唾液乳 杆菌(Lactobacillus salivarius)LS菌株、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)J1菌株三种菌株复合配比组成；所述的枯草芽孢杆菌B1菌株，于2020 年7月20日保种于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地 址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.20405；所述唾液乳杆 菌LS菌株，于2017年7月25日保种于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.14458；所述酿酒酵母菌J1菌株，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.2.388。
进一步地，所述复合微生物制剂的活菌含量为：每毫升复合微生物制剂中含枯草芽孢杆菌B1菌液0.5-3.3×108cfu、唾液乳杆菌LS菌液0.6-3.7×108cfu、酿酒酵母菌J1菌液1.2-7.2×108cfu。即：所述的复合微生物制剂由活菌浓度5× 108cfu/ml的枯草芽孢杆菌B1菌液1-4体积份、活菌浓度5.6×108cfu/ml的唾液乳杆菌LS菌液1-4体积份、活菌浓度10.8×108cfu/ml的酿酒酵母菌J1菌液1-4体积份混配而成。
更进一步地，每毫升复合微生物制剂中含枯草芽孢杆菌B1菌液1.4×108cfu、唾液乳杆菌LS菌液2.4×108cfu、酿酒酵母菌J1菌液3.1×108cfu。即：所述复合微生物制剂由活菌浓度5×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌B1菌液2体积份、活菌浓度 5.6×108cfu/ml的唾液乳杆菌LS菌液3体积份、活菌浓度10.8×108cfu/ml的酿酒酵母菌J1菌液2体积份混配而成。
进一步地，所述的唾液乳杆菌LS菌株，由健康草鱼的肠道内容物经菌种分离筛选而得，经DNA测序，其基因序列组成如SEQ ID NO.1所示；该唾液乳杆菌是从健康草鱼的肠道内容物中通过选择性培养基进行菌种分离筛选经筛选而得到，消化酶产生能力强、产酸能力也较强。
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌B1菌株，由健康白蚁肠道经菌种分离筛选而得，经DNA测序，其基因序列组成如SEQ ID NO.2所示。该枯草芽孢杆菌是从白蚁肠道中通过各种选择性培养基分离而得，该枯草芽孢杆菌能够产生漆酶、纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶，能降解木质素，能显著抑制病菌生长。
进一步地，所述的复合微生物制剂用于制备发酵膨化颗粒饲料。
其次，本发明还公开了一种应用上述复合微生物制剂制备的发酵膨化颗粒饲料。
所述的发酵膨化颗粒饲料包含以下制备步骤：S1、按照基础饲料配方配制基础饲料；S2、将基础饲料加工制粒成为膨化颗粒饲料；S3、在膨化颗粒饲料中配入复合微生物制剂进行微生物发酵成为发酵膨化颗粒饲料；S4、检验包装。
由于该发酵膨化颗粒饲料是先将饲料加工制粒，再用上述复合微生物制剂进行复合发酵，发酵后无需再次加工制粒，既避免了活菌失活，也减少加工过程中营养物质的损失。保证发酵后的颗粒饲料不经过高温高压等一系列加工手段，充分保留其活性物质，如活菌等，并100％保留其丰富的代谢产物。
进一步地，步骤S1所述的基础饲料配方以质量份数计：鱼粉30-60份、豆粕 15-20份、小麦10-20份、动物用鸡肉粉10-20份、大豆油1-2份、磷酸二氢钙1-2 份、预混料1-2份、质量含量50％的氯化胆碱0.5-1份、玉米蛋白粉1-2份。
更进一步地，所述的预混料，由维生素和矿物元素组成，折合在每kg饲料中的添加量为：VA 5000-6000IU，VD 1500-2000IU，VE 80-100mg，VK 5-10mg， VB1 15-20mg，VB2 15-20mg，烟酸20-30mg，VB6 10-15mg，泛酸25-30mg，叶酸0.1-0.2mg，VB12 0.01-0.03mg，生物素0.1-0.2mg，VC 100-150mg，肌醇100-120mg，Zn 40-50mg，Fe 100-150mg，Mn 20-30mg，I0.2-0.4mg，Co 0.1-0.2mg，Se 0.05-0.1mg，Mg 30-50mg。
进一步地，步骤S2所述膨化颗粒饲料的粒径为0.8-1.5mm。
进一步地，步骤S3所述复合微生物制剂的菌液配比为：由活菌浓度5× 108cfu/ml的枯草芽孢杆菌B1菌液1-4体积份、活菌浓度5.6×108cfu/ml的唾液乳杆菌LS菌液1-4体积份、活菌浓度10.8×108cfu/ml的酿酒酵母菌J1菌液1-4体积份混配而成。
更进一步地，步骤S3所述复合微生物制剂的菌液配比优选为：由活菌浓度5 ×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌B1菌液2体积份、活菌浓度5.6×108cfu/ml的唾液乳杆菌LS菌液3体积份、活菌浓度10.8×108cfu/ml的酿酒酵母菌J1菌液2体积份混配而成。
进一步地，步骤S3所述复合微生物制剂的加入量为：每公斤颗粒饲料加入复合微生物制剂30-120毫升。
进一步地，所述的发酵膨化颗粒饲料用于水产、家畜、家禽的养殖。
本发明所制得的发酵膨化颗粒饲料，因采用先将饲料加工制粒，再用复合微生物制剂进行复合发酵，发酵后无需再次加工制粒的制备工艺，既避免了活菌失活，也减少加工过程中营养物质的损失。使饲料中富含有益菌及其代谢物，并能降低饲料中的粗纤维、粗灰分含量，提高饲料的粗蛋白含量，饲料利用率更高，且发酵饲料pH下降，产生发酵香味，适口性好，投喂效果好，完全能够满足水产、家畜、家禽养殖的营养需求。
有益效果：
(1)本发明所公开的复合微生物制剂，由自我分离筛选并保藏的唾液乳杆菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母菌等三种微生物菌液科学混配而成。其中唾液乳杆菌是从健康草鱼的肠道内容物中通过选择性培养基进行菌种分离筛选经筛选而得到，消化酶产生能力强、产酸能力也较强；枯草芽孢杆菌是从健康白蚁肠道肠道经分离筛选而得到，能够产生漆酶、纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶，能降解木质素，能显著抑制病菌生长；酿酒酵母菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，对淀粉、粗纤维、蛋白质等有机高分子降解能力强。将该复合微生物制剂用于发酵饲料,实现了饲料粗纤维的有效降解、将饲料中的大分子蛋白转化为小分子蛋白、增加了饲料转化率、提高了饲料适口性等目的。
(2)本发明公开的发酵膨化颗粒饲料，是先将饲料加工制粒，再用含有唾液乳杆菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母菌科学混配而成的复合微生物制剂，进行复合发酵，发酵后无需再次加工制粒，既避免了活菌失活，也减少加工过程中营养物质的损失，保证发酵后的颗粒饲料不经过高温高压等一系列加工手段，充分保留其活性物质，如活菌等，并100％保留其丰富的代谢产物。具有代谢产物好、营养价值足、活菌含量高等特点。
(3)本发明所制得的发酵膨化颗粒饲料，富含有益菌及其代谢物，并能降低饲料中的粗纤维、粗灰分含量，提高饲料的粗蛋白含量，饲料利用率更高，且发酵饲料pH下降，产生发酵香味，适口性好，应用于水产(如黄鳝养殖)、家畜、家禽养殖上具有投喂效果好，完全能够满足水产、家畜、家禽的营养需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1：唾液乳杆菌LS菌株的分离筛选与基因测序
菌种来源：健康的草鱼(江西农业大学水产养殖基地)肠道内容物。
方法：在超净工作台中将健康草鱼解剖，取其肠道内容直接于无菌生理盐水中进行10倍梯度稀释，稀释至10-2-10-8浓度，取0.1ml涂布于含1％碳酸钙的MRS固体培养基上，30℃培养24-48h。从含1％碳酸钙的MRS固体培养基挑取产生溶钙圈的单个菌落于普通MRS固体培养基上进行纯化，纯化2次后进行革兰氏染色和生化鉴定，将生长在MRS上的单个菌落接种于对应的液体培养基中，30℃，180r/min 培养24-48h。
以点种法将MRS液体培养基中的单个菌株点种于1％碳酸钙的MRS固体培养基上，观察其溶钙圈大小，采用pH剂测定菌液pH，验证其产酸能力,结果显示，筛选出来的乳杆菌LS产酸能力最强。
采用细菌总DNA提取试剂盒提取单个纯化菌落得细菌DNA，用细菌通用引物 27F，1492R进行扩增，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行DNA测序，并进行后续BLAST比对和分析。
经DNA测序，唾液乳杆菌LS菌株的基因序列组成如SEQ ID NO.1所示，基因全长为703bp。即：
GTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAAC GAAACTTTCTTACACCGAATGCTTGCATTCACCGTAAGAAGTTGAGTGGCGGACGGGTGAG TAACACGTGGGTAACCTGCCTAAAAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCG TATATCTCTAAGGATCGCATGATCCTTAGATGAAAGATGGTTCTGCTATCGCTTTTAGATG GACCCGCGGCGTATTAACTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGTGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGC AGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAG AAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACACGAGTGAGAGTAACTGTTCA TTCGATGACGGTATCTAACCAGCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAA GTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTG。
本实施例从健康草鱼的肠道内容物中通过选择性培养基进行菌种分离筛选经筛选而得到唾液乳杆菌LS菌株，其消化酶产生能力强、产酸能力也相对最强。该唾液乳杆菌LS菌株，于2017年7月25日保种于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.14458。
实施例2：枯草芽孢杆菌B1菌株的分离筛选与基因测序
菌种来源：白蚁肠道物(白蚁采自江西农业大学校园树林)；健康的草鱼(江西农业大学水产养殖基地)肠道内容物；一株枯草芽孢杆菌和一株解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)，两株菌对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 有抑菌效果，由本实验室分离保藏。
指示菌：嗜水气单胞菌AH-S1、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)AS-S2，分离自患病黄鳝肝脏，由本实验室保藏。
培养基：
愈创木酚初筛培养基：酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，愈创木酚2.5g/L，琼脂 15g/L，调节pH为7.0，121℃高压灭菌20min。
RB亮蓝培养基：RB亮蓝0.03g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调节pH为7.0，121℃高压灭菌20min。
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调节pH 为7.0，121℃高压灭菌20min。
LB固体培养基：在LB液体培养基中添加琼脂15g/L，调节pH为7.0，121℃高压灭菌20min。
纤维素酶筛选培养基：羧甲基纤维素钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，琼脂15g/L。
蛋白酶筛选培养基：葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，脱脂奶粉5g/L，无水氯化钙 1g/L，琼脂15g/L。
淀粉酶筛选培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉 10g/L，琼脂15g/L。
方法：1.分离纯化
将白蚁肠道取出后捣碎，在无菌生理盐水中浸泡48小时，然后吸取少量浸泡液在愈创木酚初筛培养基涂布，在生化培养箱中37度静置培养2天。挑取有变色圈的菌落在愈创木酚培养基和RB亮蓝培养基上纯化培养，在生化培养箱中37度静置培养2天，每天观察培养基颜色的变化。以愈创木酚培养基是否变为粉红色来定性说明是否为木质素分解菌，以RB亮蓝培养基是否褪色来定性说明该菌株是否可以产生漆酶。对从白蚁肠道分离到的木质素降解菌进行初步的菌落形态观察和显微镜镜检，初步确定为芽孢杆菌属，命名为枯草芽孢杆菌B1菌株。
在超净工作台中将健康草鱼解剖，取其肠道内容物，将其在80℃水浴10min，后吸取上清0.1ml涂布于LB固体培养基上，30℃培养24-48h。从LB培养基上挑取形态不一的单个菌落进行纯化，纯化2次后进行革兰氏染色，将生长在LB单个菌落接种于对应的液体培养基中，30℃，180r/min培养24-48h。
2功能菌筛选
利用纤维素酶筛选培养基、蛋白酶筛选培养基和淀粉酶筛选培养基对分离纯化出来的单个菌种进行培养，观察是否有降解圈产生，并测量降解圈的直径。
采用指示菌AH-S1、AS-S2，将单个菌种的菌液点种于涂布了指示菌的LB平板上，观察其抑菌能力。
结果显示枯草芽孢杆菌B1菌株功能性最强。
3分子鉴定
采用细菌总DNA提取试剂盒提取单个纯化菌落得细菌DNA，用细菌通用引物 27F，1492R进行扩增，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行DNA测序，并进行后续BLAST比对和分析。
经DNA测序，该枯草芽孢杆菌B1菌株的基因序列组成如SEQ ID NO.2所示，基因全长为1131bp。即：
CCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACC ACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGC CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG GAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAA GCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCC ACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACT GGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGA ACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGC TGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATC CTCTGACAATCCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGGTTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTAAGTCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTTAGTTTGCCAGCATTC AGTTTGGGGCACTTCTAAAGGTGACTGCCCGGTGACAACTGGAGAGGTTGGGGATGACGTTCATTCATCA。
本实施例从健康白蚁肠道肠道经分离筛选而得到枯草芽孢杆菌，能够产生漆酶、纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶，能降解木质素，能显著抑制病菌生长。该枯草芽孢杆菌B1菌株，于2020年7月20日保种于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.20405。
实施例3：复合微生物制剂中三株菌的复合配比优化
复合微生物制剂：
一株能降解木质素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1菌株，分离自白蚁肠道物，由实施例2经分离筛选得到，保藏号为CGMCC NO.20405；
一株唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LS菌株，分离自健康草鱼肠道内容物，由实施例1经分离筛选得到，保藏号为CGMCC NO.14458；
一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)J1菌株，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.2.388。
饲料配方：
饲料原料以及加工制粒由大佑农生物科技有限公司提供，试验饲料为粒径1.0-1.2mm的膨化颗粒饲料，试验饲料组成见表1。
表1基础饲料配方
Figure BDA0002764244590000091
其中的预混料由维生素和矿物元素组成，折合在每kg饲料中的添加量为：VA 6000.0IU，VD 2 000.0IU，VE 100.0mg，VK 5.0mg，VB1 15.0mg，VB2 15.0mg，烟酸30.0mg，VB610.0mg，泛酸25.0mg，叶酸0.2mg，VB12 0.03mg，生物素0.2mg，VC 100.0mg，肌醇100mg，Zn40mg，Fe 150mg，Mn 20.0mg，I 0.4 mg，Co 0.1mg，Se 0.1mg，Mg 50.0mg。
方法：
1.菌种活化、富集培养以及标准曲线的绘制
将枯草芽孢杆菌B1菌株、唾液乳杆菌LS菌株和酿酒酵母J1菌株分别于LB、 MRS、YPD固体培养基上划线培养，挑选单个菌落分别接种于对应的10ml液体培养基中，30℃，180r/min培养24h-48h，测定OD值(波长：600nm)并进行平板计数确定菌液浓度。
2.发酵饲料
将确定浓度的三种菌的比例作为因素，每个因素4个水平(表2)，进行正交试验设计，共16组复合配比用于发酵饲料，每组设置三个平行，在温度35℃、水分40％(包含菌液)以及pH自然条件下发酵5d。
表2复合菌株发酵饲料接种比例正交试验因素水平表％
Figure BDA0002764244590000092
Figure BDA0002764244590000101
3发酵指标测定
发酵结束后，对发酵饲料进行称重，对饲料pH以及饲料中活菌数进行测定，其余样品放于65℃烘箱烘干后再置于室温回潮2d称重计算风干水分，再粉碎过60 目筛用于指标测定。
水分检测方法：国标(GB/T 6435-2014)；粗蛋白质检测方法：国标(GB/T 6432-1994)。
表3复合菌发酵饲料正交试验结果(粗蛋白)
Figure BDA0002764244590000102
Figure BDA0002764244590000111
以发酵饲料干物质的粗蛋白含量为检测指标，由表3正交试验结果的极差值R 可知，三个菌株混菌发酵饲料对粗蛋白含量的影响程度为：A>B>C，即枯草芽孢杆菌对发酵效果影响最大，其次是唾液乳杆菌，而酿酒酵母对发酵效果影响最小。同时结合k值大小可知，三个菌株混合发酵饲料的最佳接种比例条件组合为：A2B3C2，即以发酵饲料干物质的粗蛋白含量为检测指标,每公斤颗粒饲料加入复合微生物制剂的体积为：枯草芽孢杆菌B1菌液20ml+唾液乳杆菌LS菌液30ml+酿酒酵母菌J1 菌液20ml。
通过粗蛋白含量检测指标进行考察与评价，每公斤颗粒饲料加入复合微生物制剂的最佳菌液配比为：枯草芽孢杆菌B1菌液20ml(菌浓5*108cfu/ml)+唾液乳杆菌LS菌液30ml(菌浓5.6*108cfu/ml)+酿酒酵母菌J1菌液20ml(菌浓 1.08*109cfu/ml)。
实施例4：发酵膨化颗粒饲料(甲)的制备
S1、按照基础饲料配方配制基础饲料。以质量百分比计基础饲料配方为：鱼粉46.0％、豆粕15.0％、小麦20.0％、动物用鸡肉粉12.0％、大豆油1.5％、磷酸二氢钙 2.0％、预混料1.0％、含量50％的氯化胆碱0.5％、玉米蛋白粉2.0％。其中预混料由维生素和矿物元素配比组成，折合在每kg饲料中的添加量为VA 6 000.0IU，VD 2 000.0IU，VE 100.0mg，VK 5.0mg，VB1 15.0mg，VB2 15.0mg，烟酸30.0mg， VB6 10.0mg，泛酸25.0mg，叶酸0.2mg，VB12 0.03mg，生物素0.2mg，VC 100.0 mg，肌醇100mg，Zn 40mg，Fe 150mg，Mn 20.0mg，I0.4mg，Co 0.1mg， Se 0.1mg，Mg 50.0mg。
S2、将基础饲料加工制粒成为膨化颗粒饲料。膨化颗粒饲料的粒径为0.8-1.0 mm。
S3、在膨化颗粒饲料中配入复合微生物制剂进行微生物发酵成为发酵膨化颗粒饲料。所述复合微生物制剂的加入量为：每公斤颗粒饲料加入复合微生物制剂30 毫升。复合微生物制剂的菌液配比为：由活菌浓度5×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌 B1菌液2体积份、活菌浓度5.6×108cfu/ml的唾液乳杆菌LS菌液3体积份、活菌浓度10.8×108cfu/ml的酿酒酵母菌J1菌液2体积份混配而成。
S4、检验包装入库，得到发酵膨化颗粒饲料(甲)。
实施例5：发酵膨化颗粒饲料(乙)的制备
S1、按照基础饲料配方配制基础饲料。基础饲料配方同实施例4。
S2、将基础饲料加工制粒成为膨化颗粒饲料。膨化颗粒饲料的粒径为1.0-1.2 mm。
S3、在膨化颗粒饲料中配入复合微生物制剂进行微生物发酵成为发酵膨化颗粒饲料。复合微生物制剂的菌液配比同实施例4，复合微生物制剂的加入量为：每公斤颗粒饲料加入复合微生物制剂60毫升。
S4、检验包装入库，得到发酵膨化颗粒饲料(乙)。
实施例6：发酵膨化颗粒饲料(丙)的制备
S1、按照基础饲料配方配制基础饲料。基础饲料配方同实施例4。
S2、将基础饲料加工制粒成为膨化颗粒饲料。膨化颗粒饲料的粒径为1.2-1.5 mm。
S3、在膨化颗粒饲料中配入复合微生物制剂进行微生物发酵成为发酵膨化颗粒饲料。复合微生物制剂的菌液配比同实施例4，复合微生物制剂的加入量为：每公斤颗粒饲料加入复合微生物制剂120毫升。
S4、检验包装入库，得到发酵膨化颗粒饲料(丙)。
对比例1：采用传统的先发酵后制粒工艺制备发酵膨化颗粒饲料(丁)
S1、按照基础饲料配方配制基础饲料。基础饲料配方同实施例4。
S2、在S1配制好的基础饲料中加入复合微生物制剂进行微生物发酵成为发酵饲料。复合微生物制剂的菌液配比同实施例4，复合微生物制剂的加入量为：每公斤基础饲料加入复合微生物制剂60毫升。
S3、将S2经复合微生物制剂发酵过的发酵基础饲料，加工制粒成为发酵膨化颗粒饲料。发酵膨化颗粒饲料的粒径为1.0-1.2mm。
S4、检验包装入库，得到发酵膨化颗粒饲料(丁)。
对比例2：不经加菌发酵的膨化颗粒饲料(戊)的制备
S1、按照基础饲料配方配制基础饲料。基础饲料配方同实施例4。
S2、将基础饲料加工制粒成为膨化颗粒饲料。膨化颗粒饲料的粒径为1.2-1.5 mm。
S3、检验包装入库，得到膨化颗粒饲料(戊)。
检测例：发酵膨化颗粒饲料中活菌含量、粗蛋白、粗纤维的检测
饲料活菌含量测定方法：将发酵结束的饲料用无菌水充分震荡于4℃静置过夜，取上清进行梯度稀释后涂布于LB、MRS、YPD平板上培养24h，将符合各自菌株形态的单个菌落进行计数。所检测的活菌含量为每克发酵膨化颗粒饲料中所含唾液乳杆菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母菌三者微生物之和。
粗蛋白检测方法：按国标(GB/T 6432-1994)进行；
粗纤维检测方法：按国标(GB/T 6438-2007)进行。
将实施例4-6与对比例1制备所得的发酵膨化颗粒饲料，按照上述方法进行活菌含量、粗蛋白、粗纤维的测定，同时将对比例2的未加菌发酵的膨化颗粒饲料作检测对比。结果如下：
颗粒饲料 活菌含量(cfu/g) 粗蛋白(％) 粗纤维(％)
甲(实施例4制备所得) 8.6*10<sup>4</sup> 48.2 1.35
乙(实施例5制备所得) 7.5*10<sup>5</sup> 49.0 1.20
丙(实施例6制备所得) 2.6*10<sup>6</sup> 49.2 1.12
丁(对比例1，传统工艺) 516 48.8 1.23
戊(对比例2，未加菌发酵) 10 44.4 2.51
检测结果分析：
从实施例4-6所制备的发酵膨化颗粒饲料，其活菌含量与对比例1比较可知：对比例1虽然也采用了相同的复合微生物制剂进行饲料复合发酵，但采用的是先发酵后制粒的传统工艺，造成饲料内所含的复合微生物基本失活，测得的活菌含量仅有516cfu/g；而实施例4-6均是先将饲料加工制粒，再用含有唾液乳杆菌、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母菌科学混配而成的复合微生物制剂，进行复合发酵，发酵后无需再次加工制粒，既避免了活菌失活，也减少加工过程中营养物质的损失，保证发酵后的颗粒饲料不经过高温高压等一系列加工手段，充分保留了活性物质，测得的活菌含量很高。
从实施例4-6所制备的发酵膨化颗粒饲料，其粗蛋白、粗纤维与对比例2比较可知：膨化颗粒饲料经复合微生物制剂发酵后所得到的发酵膨化颗粒饲料，能有效降低饲料中的粗纤维含量，有效提高饲料的粗蛋白含量，具有代谢产物好、营养价值足、饲料利用率高等特点。
实施例8：发酵膨化颗粒饲料在黄鳝养殖中的应用
将实施例4-6制备的发酵膨化颗粒饲料(甲、乙、丙)用于黄鳝养殖试验。具体实验方案为：暂养3天后，分组，每组3个重复，每个重复25尾黄鳝，放置300L 实验桶中，按体重3％-5％计投喂同等质量(按干物质计)的发酵膨化颗粒饲料(甲、乙、丙三个实验组)和对比例1采用传统的先发酵后制粒工艺制备发酵膨化颗粒饲料(对照1组)及未加菌发酵制得的颗粒饲料(对照2组)，每2-3天换水一次，换水量10％，水温28.0±1.0℃，养殖试验持续60天。养殖试验结果如下：
Figure BDA0002764244590000141
从上述养殖试验结果可以看出：
实验甲乙丙三组与对照2组相比：采用本发明制备的发酵膨化颗粒饲料喂食的三组实验黄鳝，其日增重为22.62-23.83g/组，饲料系数(饲料/黄鳝增重)为 0.92-0.93g/g，而采用未加菌发酵的基础配合饲料喂食的对照2组黄鳝，其日增重为18.25g/组，饲料系数(饲料/黄鳝增重)为0.98g/g，说明黄鳝养殖采用发酵膨化颗粒饲料喂食，比采用未加菌发酵的基础配合饲料喂食，其摄食率升高，日增重上升，饲料系数降低，饲料利用率高。
实验甲乙丙三组与对照1组相比：采用本发明制备的发酵膨化颗粒饲料喂食的三组实验黄鳝，其日增重为22.62-23.83g/组，饲料系数(饲料/黄鳝增重)为 0.92-0.93g/g，而采用传统的先发酵后制粒工艺制备的发酵膨化颗粒饲料，喂食的对照1组黄鳝，其日增重为19.70g/组，饲料系数(饲料/黄鳝增重)为0.96g/g。前者饲料饲喂效果好于后者饲料。说明发酵膨化颗粒饲料，宜采用本发明的先将饲料加工制粒-再用微生物制剂进行复合发酵的工艺进行制备，而不宜采用传统的先用微生物制剂发酵-再加工制粒的工艺进行制备。
本发明所制得的发酵膨化颗粒饲料，富含有益菌及其代谢物，并能降低饲料中的粗纤维、粗灰分含量，提高饲料的粗蛋白含量，饲料利用率更高，且发酵膨化颗粒饲料pH下降，产生发酵香味，适口性好，应用于黄鳝养殖上具有投喂效果好，完全能够满足黄鳝的营养需求。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及发酵膨化颗粒饲料
<141> 2020-09-07
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 703
<212> DNA
<213> 唾液乳杆菌LS菌株(Lactobacillus salivarius)
<400> 1
gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgaacgaa 60
actttcttac accgaatgct tgcattcacc gtaagaagtt gagtggcgga cgggtgagta 120
acacgtgggt aacctgccta aaagaagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt 180
atatctctaa ggatcgcatg atccttagat gaaagatggt tctgctatcg cttttagatg 240
gacccgcggc gtattaacta gttggtgggg taacggccta ccaaggtgat gatacgtagc 300
cgaactgaga ggttgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag 360
gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg 420
aagaaggtct tcggatcgta aaactctgtt gttagagaag aacacgagtg agagtaactg 480
ttcattcgat gacggtatct aaccagcaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 540
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagggaac gcaggcggtc 600
ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagta gtgcattgga aactggaaga 660
cttgagtgca gaagaggaga gtggaactcc atgtgtagcg gtg 703
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌B1菌株(Bacillus subtilis)
<400> 2
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 60
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 120
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 180
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 240
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 300
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 360
ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 420
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 480
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 540
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 600
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 660
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 720
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 780
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 840
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 900
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca 960
gagtgacagg tggtgcatgg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg gggttaagtc 1020
cgcaacgagc gcaacccttg atctttagtt tgccagcatt cagtttgggg cacttctaaa 1080
ggtgactgcc cggtgacaac tggagaggtt ggggatgacg ttcattcatc a 1131

Claims (10)

1.一种用于发酵饲料的复合微生物制剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B1菌株、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LS菌株、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)J1菌株三种菌株复合配比组成；所述的枯草芽孢杆菌B1菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.20405；所述唾液乳杆菌LS菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.14458。
2.根据权利要求1所述的一种用于发酵饲料的复合微生物制剂，其特征在于：所述复合微生物制剂的活菌含量为：每毫升复合微生物制剂中含枯草芽孢杆菌B1菌液0.5-3.3×108cfu、唾液乳杆菌LS菌液0.6-3.7×108cfu、酿酒酵母菌J1菌液1.2-7.2×108cfu。
3.根据权利要求1所述的一种用于发酵饲料的复合微生物制剂，其特征在于：所述的唾液乳杆菌LS菌株，由健康草鱼的肠道内容物经菌种分离筛选而得，经DNA测序，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的枯草芽孢杆菌B1菌株，由健康白蚁肠道经菌种分离筛选而得，经DNA测序，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种用于发酵饲料的复合微生物制剂在制备发酵膨化颗粒饲料中的应用。
5.一种应用权利要求1-3任一所述的复合微生物制剂制备的发酵膨化颗粒饲料，其特征在于，包含以下制备步骤：S1、配制基础饲料；S2、将基础饲料加工制粒成为膨化颗粒饲料；S3、在膨化颗粒饲料中配入复合微生物制剂进行微生物发酵成为发酵膨化颗粒饲料；S4、检验包装。
6.根据权利要求5所述的一种应用复合微生物制剂制备的发酵膨化颗粒饲料，其特征在于，步骤S1所述的基础饲料配方以质量份数计：鱼粉30-60份、豆粕15-20份、小麦10-20份、动物用鸡肉粉10-20份、大豆油1-2份、磷酸二氢钙1-2份、预混料1-2份、质量含量50％的氯化胆碱0.5-1份、玉米蛋白粉1-2份。
7.根据权利要求5所述的一种应用复合微生物制剂制备的发酵膨化颗粒饲料，其特征在于：步骤S2所述膨化颗粒饲料的粒径为0.8-1.5mm。
8.根据权利要求5所述的一种应用复合微生物制剂制备的发酵膨化颗粒饲料，其特征在于，步骤S3所述复合微生物制剂的菌液配比为：由活菌浓度5×108cfu/ml的枯草芽孢杆菌B1菌液1-4体积份、活菌浓度5.6×108cfu/ml的唾液乳杆菌LS菌液1-4体积份、活菌浓度10.8×108cfu/ml的酿酒酵母菌J1菌液1-4体积份混配而成。
9.根据权利要求5所述的一种应用复合微生物制剂制备的发酵膨化颗粒饲料，其特征在于，步骤S3所述复合微生物制剂的加入量为：每公斤颗粒饲料加入复合微生物制剂30-120毫升。
10.根据权利要求5所述的一种应用复合微生物制剂制备的发酵膨化颗粒饲料，在水产、家畜、家禽养殖中的应用。
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