CN107603924A

CN107603924A - 一种复合微生物制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107603924A
Application number: CN201711081825.0A
Authority: CN
Inventors: 邓雪娟; 刘世杰; 刘晶晶; 蔡辉益; 王春雨; 李宗平; 程善燕
Original assignee: Tianjin Bofeide Science & Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Bofeide Science & Technology Co ltd
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN107603924B

Abstract

本发明公开了一种复合微生物制剂及其制备方法和应用，所述复合微生物制剂包括枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母。该复合微生物制剂用于微贮饲料的发酵过程，能有效提高饲料的纤维降解率和生物转化率，提高NDF消化率，增加粗蛋白含量，抑制有害菌的繁殖，缩短发酵周期，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种复合微生物制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种复合微生物制剂及其制备方法和应用。

背景技术

农作物秸秆是粮食作物和经济作物生产中的副产物，主要成分为纤维素及木质素，含有丰富的氮、磷、钾等成分，是一种可供开发的优质资源。我国是农业大国，每年生产6亿～7亿吨的秸秆，但利用率极低。根据联合国粮农组织(FAO)统计资料表明，我国仅有6～8％的肉类由草、秸秆转化而来，转化比例远低于美国及澳洲。我国人多地少，粮食长期紧缺，而饲料用粮占粮食总产量的35％。随着我国饲料工业和畜牧业、水产养殖业的进一步发展，饲料用粮的需求量将逐步加大，对我国粮食安全构成极大威胁。另外，随着我国城镇化发展，大量秸秆失去传统消化方式，农民缺乏有效秸秆处理手段，采用焚烧的方法处理秸秆，严重影响空气质量，破坏土壤结构，造成农田质量下降，产生大量有害物质，威胁人类健康。

综上所述，我国农业发达，秸秆产量巨大，但利用转化率极低，且传统焚烧方式严重污染环境。如果每年能将作物秸秆的60％加工成饲料，所发挥的效能相当于现在全国的全部饲料用粮。但是，秸秆消化率低、适口性差，直接饲喂无法得到令人满意的效果，限制了其作为动物饲料的大规模应用。目前秸秆的预处理方法有物理处理法、化学处理法和生物处理法：⑴物理处理法：高温、超声波、微波等物理手段都能不同程度地破坏木质纤维的天然结构，改变其稳定性，但需要专用设备，成本较高，处理过程有二次污染；⑵化学处理法：NaOH、H₂O₂、氨水、CaO等化学试剂对秸秆类材料进行处理后，一定程度的破坏秸秆的纤维组成、形态和结晶区，秸秆表面变得疏松，出现了部分微孔，提高秸秆的生物降解性能，但会产生非常严重的二次污染；⑶生物处理法：利用高效的降解菌对秸秆进行发酵处理，将秸秆中的木质素、纤维素和半纤维素分解成为单糖或低聚糖，改善其营养价值。生物法处理成本较低，没有二次污染，但目前常用的生物处理法中所用微生物制剂的转化效率较低，处理时间较长，影响了生物处理法的应用和推广。

由于物理及化学方法的缺点较多并且很难克服，因此目前主流的发展方向为生物处理法。

CN 104498454 A公开了一种复合微生物发酵剂，由以下原料组成：复合酶，嗜酸乳杆菌，绿色木霉，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌，黑曲霉孢子，乳酸菌，谷氨酸发酵菌，科菲尔乳杆菌。该发明将活性酶和多种微生物有益菌种复合制成活性秸秆发酵剂，提高了纤维素的降解率和秸秆的生物转化率。但菌种组合复杂，且制备工艺繁琐，需要真空冷冻干燥成固体干粉。CN 1425317 A涉及一种秸秆发酵饲料的生产方法，主要步骤包括：配置培养液、选择菌种、粉碎秸秆、发酵培养后干燥。其微生物制剂的组成为产黄纤维单胞菌、解淀粉芽袍杆菌、凝结芽袍杆菌、植物乳杆菌、费氏丙酸杆菌、粪链球菌、乳杆菌、酵母菌。通过生物菌对秸秆的发酵降解作用，减少粮食的消耗及对环境的污染。但该方法涉及的微生物发酵剂配制工艺繁琐复杂，发酵时间为7-30天，所生产的饲料转化效率较低，粗蛋白含量仅为7.4％-12％。

CN101946853A公开了一种利用复合微生物发酵秸秆生产青储饲料的方法，主要方法包括：原料制备、菌种活化、接种装料、好氧培养、厌氧培养。其微生物制剂的组成为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、产朊假丝酵母和酿酒酵母。该方法发酵周期漫长，需要2-4个月。CN105685472 A涉及一种微贮添加剂的制备及应用方法，其微贮添加剂组成为地衣芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、两歧双歧杆菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和沼泽红假单胞菌剂，配方复杂繁琐，粗蛋白含量仅提高6％。

因此，目前生物处理法所采用的微生物制剂配比复杂，制备工艺繁琐，生产的饲料在转化利用率及处理时间方面仍有待优化和提高。

发明内容

本发明针对目前生物处理法所存在的缺陷及不足，提供一种复合微生物制剂及其制备方法和应用，所述复合微生物制剂不仅菌种组合简洁高效，而且能有效提高秸秆发酵的生物转化率和纤维降解率。

第一方面，本发明提供一种复合微生物制剂，所述复合微生物制剂包括枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母；

其中，所述枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.13131，保藏日期为2016年10月21日；

所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus)BFC1602，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13132，保藏日期为2016年10月21日；

所述酿酒酵母，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BFC1603，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13133，保藏日期为2016年10月21日。

本发明中所述复合微生物制剂的菌种为本实验室筛选并提交CGMCC保藏的菌种，其用于发酵饲料的效果明显，优于市售的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母，且三类菌种互相配合，协同增效，缺一不可，显著增强了发酵效果，使得发酵后的粗蛋白含量增加显著，干物质消化率以及NDF降解率和消化率都大幅提高。

根据本发明，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601：植物乳杆菌(Lactobacillus)BFC1602：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BFC1603为(3-12):(1-8):(1-7)，以菌落形成单位计，例如可以是3:1:1、3:1:2、3:1:3、3:1:5、3:1:7、3:2:1、3:2:3、3:2:5、3:2:7、3:3:1、3:3:5、3:3:7、3:4:1、3:4:7、3:5:1、3:5:7、3:6:1、3:6:7、3:7:1、3:7:7、3:8:1、3:8:7、4:1:1、4:1:5、4:1:7、4:2:1、4:2:5、4:2:7、4:3:1、4:3:7、4:4:1、4:4:7、4:5:1、4:5:7、4:6:1、4:6:7、4:7:1、4:7:7、4:8:1、4:8:7、5:1:1、5:1:7、5:3:3、7:5:5、9:7:7、11:8:4、12:7:4或12:8:7，优选为(5-9):(3-6):(1-4)。

本发明中，发明人发现，将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601、植物乳杆菌(Lactobacillus)BFC1602和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BFC1603采用上述的比例配置复合微生物制剂，微生物制剂中三种发酵菌种含菌量均不低于1×10⁹cfu/mL，其发酵饲料的效果更加显著，发酵后的秸秆中粗蛋白含量增加30％，干物质消化率达到49.12％，NDF降解率高达14.3％，NDF消化率提高到47％，枯草芽孢杆菌BFC1601含量不低于1×10⁹cfu/g，发酵秸秆中植物乳杆菌BFC1602含量不低于2×10⁸cfu/g，酿酒酵母BFC1603含量不低于5×10⁷cfu/g。

优选地，所述复合微生物制剂还包括发酵调节剂。

优选地，所述发酵调节剂为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl或MgSO₄中的任意一种或至少两种的组合，所述组合例如可以是K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄的组合，K₂HPO₄和KH₂PO₄的组合，KH₂PO₄和NaCl的组合，NaCl和MgSO₄的组合，K₂HPO₄和NaCl的组合，K₂HPO₄和MgSO₄的组合，KH₂PO₄和MgSO₄的组合，K₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl的组合，KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄的组合，K₂HPO₄、KH₂PO₄和MgSO₄的组合或K₂HPO₄、NaCl和MgSO₄的组合，优选为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄的组合。

优选地，所述K₂HPO₄的质量浓度为10-25％，例如可以是10％、11％、13％、15％、17％、19％、21％、23％或25％，优选为19％。

优选地，所述KH₂PO₄的质量浓度为8-20％，例如可以是8％、9％、10％、11％、13％、14％、15％、17％、19％或20％，优选为14％。

优选地，所述NaCl的质量浓度为15-30％，例如可以是15％、17％、19％、21％、23％、24％、25％、27％、28％或30％，优选为24％。

优选地，所述MgSO₄的质量浓度为25-40％，例如可以是25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％或33％，优选为33％。

第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：分别按配方量制备微生物混合液和发酵调节剂，将制备的微生物混合液和发酵调节剂混合。

本发明中，所述微生物混合液指的是微生物制剂中的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的混合液，其可以按照本申请的比例进行混合。

优选地，所述微生物混合液与所述发酵调节剂的质量比为1:(1-10)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:(2-6)，进一步优选为1:3。

本发明中，发明人发现通过采用所述微生物混合液与所述发酵调节剂的质量比为1:(1-10)，能够增进微生物制剂的发酵效率，尤其当所述微生物混合液与所述发酵调节剂的质量比为1:3时，发酵效率能进一步提高。

优选地，所述复合微生物制剂的含菌量均不低于1×10⁹cfu/mL。

第三方面，本发明提供了如第一方面所述的复合微生物制剂用于秸秆饲料的发酵。

优选地，所述秸秆饲料为甜高粱、玉米、芦苇或棉花中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述发酵包括如下具体步骤：

(1)采用秸秆饲料配制发酵培养基；

(2)向步骤(1)中的培养基中加入所述复合微生物制剂，搅拌均匀；

(3)将步骤(2)加入复合微生物制剂的培养基与秸秆混合，自然发酵。

优选地，步骤(1)所述发酵培养基还包括补充碳源和氮源。

本发明中，秸秆的碳氮比高达65～85︰1，碳素过高，细菌和其它微生物的生长就受到限制，有机物的分解速度就慢，发酵过程就长。并且，秸秆中的碳主要以木质纤维素形式存在，不易被微生物利用，因此，为了使参与有机物分解的微生物营养处于平衡状态，缩短发酵时间，需调节碳氮比并适当的补充容易被微生物利用的碳源，可以提高发酵的效率。

优选地，所述补充碳源为玉米粉、麦麸、葡萄糖、蔗糖、谷物淀粉或糖蜜中的任意一种或至少两种的组合，优选为玉米粉和麦麸的组合。

本发明中，玉米粉和麦麸的碳氮比分别为19.8:1和20.3:1，除了含有丰富的水溶性碳水化合物和膳食纤维，还有蛋白质、矿物质和微生素等，有利于微生物的生长，玉米粉和麦麸作为天然的有机碳源，可以大大降低生产成本，提高发酵效率。

优选地，所述氮源为无机氮源和/或有机氮源，优选为无机氮源。

本发明中，所述无机氮可迅速被微生物利用，利于发酵早期微生物的生长，包括氨水、铵盐或硝酸盐、尿素，所述有机氮源来源不稳定，成分复杂，原料波动易对微生物产生影响。

优选地，所述无机氮源为硫酸铵、尿素、氨水或硝酸盐中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述有机氮源为玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉或酵母浸出膏中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述发酵培养基中补充碳源的质量浓度为1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选为3％。

优选地，所述发酵培养基中碳源的质量浓度为0.1-3％，例如可以是0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、2％、2.1％、2.3％、2.5％、2.7％、2.9％或3％，优选为0.5％。

优选地，步骤(1)所述微贮饲料在所述发酵培养基的质量浓度为40-60％，例如可以是40％、41％、43％、45％、47％、49％、51％、52％、53％、55％、57％、59％或60％，优选为43-55％，进一步优选为49％。

优选地，步骤(2)所述复合微生物制剂的加入量为0.1-1％，例如可以是0.1、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％或1％，优选为0.1-0.5％。

优选地，所述发酵的时间为3-15天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天，优选为5天。

优选地，步骤(3)所述发酵后的枯草芽孢杆菌BFC1601(Bacillus subtilis)的含量不低于1×10⁹cfu/g；

优选地，步骤(3)所述发酵后的植物乳杆菌BFC1602(Lactobacillus)的含量不低于2×10⁸cfu/g；

优选地，步骤(3)所述发酵后的酿酒酵母BFC1603(Saccharomyces cerevisiae)的含量不低于5×10⁷cfu/g。

第四方面，本发明提供了如第一方面所述复合微生物制剂用于制备饲料和/或饲料辅料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的复合微生物制剂的菌种为发明人筛选并提交CGMCC保藏，菌种组合简洁高效，互相配合，协同增效，缺一不可，相比于市售同类菌种有更卓越的发酵效果；

(2)本发明的复合微生物制剂应用到饲料发酵过程中，能够提高生物转化率和纤维降解率，发酵秸秆中粗蛋白含量增加30％，干物质消化率达到49.12％，NDF降解率高达14.3％，NDF消化率提高至47％；

(3)本发明的复合微生物制剂制备工艺简便，成本低廉，易于推广应用。

附图说明

图1为本发明所述的复合微生物制剂发酵秸秆的生产方法流程图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1枯草芽孢杆菌的筛选

将秸秆揉搓粉碎至10～20mm，加水调节含水量至60％～70％，自然发酵3天。称取自然发酵的秸秆5g，加入45mL 0.85％生理盐水中，震荡30min。

芽孢杆菌的富集和分离：吸取5mL上清液，加入无菌试管中，80℃水浴20min。按10％接种量接种到LB液体培养基中，180r/min、30℃摇床富集24h。对富集后的培养液进行梯度稀释，选取10^-4、10^-5、10^-6梯度在LB琼脂培养基上涂布，每个稀释度3个平行，37℃培养24h得到单菌落，镜检，挑取单菌进行LB斜面培养基保存。

产纤维素酶芽孢杆菌的筛选和鉴定：采用平板划线法，从斜面上挑选菌株在刚果红CMC-Na平板上划线，37℃培养48h。挑选生长快、透明圈大的单菌落接种到LB培养基中，180r/min、37℃摇床培养24h后制成发酵种子液。用灭菌牙签蘸取少量菌液点种于CMC-Na平板上，37℃培养2～4d，采用0.2％的刚果红染色30min，用蒸馏水和1mol/L NaCl依次洗去染液。测量透明圈和菌落直径并计算其比值，挑选比值较大的菌株在种子培养基培养24h，以4％的接种量接种到装有100ml纤维素酶液体发酵培养基的500ml三角瓶中，180r/min、37℃摇床培养48h后，在5 000r/min的离心机上离心10min，收集上清液即为待测粗酶液。测定所筛菌株的CMC酶酶活，筛选出产纤维素酶能力强的菌株，命名为BFC1601。BFC1601粗酶液的纤维素内切葡聚糖酶酶活为27.31U/mL,纤维素外切葡聚糖酶酶活为25.26U/mL，木聚糖酶酶活为320.46U/mL。进行形态学和分子生物学鉴定后，确定为枯草芽孢杆菌。

实施例2乳杆菌的筛选

乳酸菌的富集和分离：吸取5mL上清液，加入无菌试管中，80℃水浴20min。按10％接种量接种到MRS液体培养基中，180r/min、30℃摇床富集24h。对富集后的培养液进行梯度稀释，选取10^-4、10^-5、10^-6梯度在MRS琼脂培养基上涂布，每个稀释度3个平行，37℃厌氧培养24h得到单菌落。根据菌落形态的差异，挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，在37℃厌氧培养24h。重复划线纯化3次。

抑菌乳酸菌的筛选和鉴定

将纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到菌株发酵液，4℃，9000r/min离心15min，保留上清液。通过牛津杯扩散法，筛选出产抑菌物质的菌株，选择抑菌圈最大的菌株，命名为BFC1602。进行形态学和分子生物学鉴定后，确定为植物乳杆菌。

实施例3酿酒酵母的筛选

酵母菌的富集和分离：吸取5mL上清液，加入无菌试管中，80℃水浴20min。按10％接种量接种到YPD液体培养基中，180r/min、30℃摇床富集24h。对富集后的培养液进行梯度稀释，选取10^-1、10^-2、10^-3梯度在YPD琼脂培养基上涂布，每个稀释度3个平行，30℃培养24h得到单菌落。根据菌落形态的差异，挑取各种典型菌落，在另一YPD固体平板上进行四区划线，在30℃厌氧培养24h。重复划线纯化3次。

与植物乳杆菌BFC1602共生酵母菌株的筛选

将上述筛选到的酵母菌株按2％的接种量接种于YPD液体培养基，30℃下培养24h。将以上筛选到的植物乳杆菌BFC1602，按2％的接种量接种于MRS液体培养基，37℃下培养24h。两种培养液8000rpm离心10min取上清液，并用孔径的灭菌滤菌器进行过滤处理，即得无菌上清液。将乳杆菌无菌上清液pH值调至5.5，低温保藏备用。

酵母菌制备无菌上清液后，将离心所得菌体加入与培养基等量灭菌PBS(pH7.2)洗涤，离心弃上清液；同法洗涤两次。然后，收集菌体加入等量灭菌PBS，振荡混匀，即为供试菌液。植物乳杆菌BFC1602供试菌液同法所得。将制备好的植物乳杆菌BFC1602无菌上清液按总体积分数30％的量加到YPD液体培养基中，等体积的YPD液体培养基作对照，然后按培养基体积2％的量接入酵母菌，30℃恒温培养24h，振荡混匀后，测其OD600值与活菌数。筛选OD600和活菌数显著高于对照组的菌株，选择OD600和活菌数最高的菌株，命名为BFC1603。进行形态学和分子生物学鉴定后，确定为酿酒酵母。

实施例4

所述复合微生物制剂的制备方法如图1所示，具体包括：

制备复合微生物制剂：发酵菌种分别按枯草芽孢杆菌BFC1601(Bacillussubtilis)：植物乳杆菌BFC1602(Lactobacillus)：酿酒酵母BFC1603(Saccharomycescerevisiae)为7:5:3的比例混合后，与发酵调节剂按1:3的比例混合制成微生物制剂；发酵调节剂的组成为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄，其质量浓度分别为：19％、14％、24％、33％；

制备发酵培养基：用于微贮的玉米秸秆必须进行铡切或揉碎切短处理，根据饲喂动物对象不同秸秆的处理长度有所不同。发酵培养基组成为微贮饲料、补充碳源(玉米粉和麦麸)和氮源(尿素和硫酸铵)，其质量浓度分别为49％、3％、0.5％；

进行发酵：微生物制剂、硫酸铵、尿素和水混匀，微生物制剂按0.3％添加量，其余按发酵培养基配方添加，喷洒接种充分搅拌均匀，装入呼吸袋中，压实封口，自然发酵5d，发酵结束后的微生物制剂中三种发酵菌种含菌量均不低于1×10⁹cfu/mL，发酵秸秆中植物乳杆菌BFC1602含量不低于2×10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌BFC1601含量不低于1×10⁹cfu/g，酿酒酵母BFC1603含量不低于5×10⁷cfu/g，发酵得到的产物可直接饲喂或作为辅料与日粮混合饲喂。

实施例5

制备复合微生物制剂：发酵菌种分别按枯草芽孢杆菌BFC1601(Bacillussubtilis)：植物乳杆菌BFC1602(Lactobacillus)：酿酒酵母BFC1603(Saccharomycescerevisiae)为3:1:1的比例混合后，与发酵调节剂按1:1的比例混合制成微生物制剂；发酵调节剂的组成为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄，其质量浓度分别为：10％、8％、30％、40％。

制备发酵培养基：用于微贮的玉米秸秆必须进行铡切或揉碎切短处理，根据饲喂动物对象不同秸秆的处理长度有所不同。发酵培养基组成为微贮饲料、补充碳源(玉米粉)和氮源(尿素、硫酸铵)，其质量浓度分别为40％、1％、0.1％；

进行发酵：微生物制剂、硫酸铵、尿素和水混匀，微生物制剂按0.1％添加量，其余按发酵培养基配方添加，喷洒接种充分搅拌均匀，装入呼吸袋中，压实封口，自然发酵3d，发酵后得到的产物可直接饲喂或作为辅料与日粮混合饲喂。

实施例6

制备复合微生物制剂：发酵菌种分别按枯草芽孢杆菌BFC1601(Bacillussubtilis)：植物乳杆菌BFC1602(Lactobacillus)：酿酒酵母BFC1603(Saccharomycescerevisiae)为12:8:7的比例混合后，与发酵调节剂按1:10的比例混合制成微生物制剂；发酵调节剂的组成为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄，其质量浓度分别为：25％、20、15％、25％。

制备发酵培养基：用于微贮的玉米秸秆必须进行铡切或揉碎切短处理，根据饲喂动物对象不同秸秆的处理长度有所不同。发酵培养基组成为微贮饲料、补充碳源(葡萄糖和蔗糖)和氮源(氨水)，其质量浓度分别为60％、10％、3％；

进行发酵：微生物制剂、硫酸铵、尿素和水混匀，微生物制剂按1％添加量，其余按发酵培养基配方添加，喷洒接种充分搅拌均匀，装入呼吸袋中，压实封口，自然发酵15d，发酵后的产物可直接饲喂或作为辅料与日粮混合饲喂。

实施例7

制备复合微生物制剂：发酵菌种分别按枯草芽孢杆菌BFC1601(Bacillussubtilis)：植物乳杆菌BFC1602(Lactobacillus)：酿酒酵母BFC1603(Saccharomycescerevisiae)为5:3:1的比例混合后，与发酵调节剂按1:2的比例混合制成微生物制剂；发酵调节剂的组成为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄，其质量浓度分别为：20％、18％、20％、30％。

制备发酵培养基：用于微贮的玉米秸秆必须进行铡切或揉碎切短处理，根据饲喂动物对象不同秸秆的处理长度有所不同。发酵培养基组成为微贮饲料、补充碳源(谷物淀粉和糖蜜)和氮源(硝酸盐)，其质量浓度分别为43％、6％、2％；

进行发酵：微生物制剂、硫酸铵、尿素和水混匀，微生物制剂按0.5％添加量，其余按发酵培养基配方添加，喷洒接种充分搅拌均匀，装入呼吸袋中，压实封口，自然发酵10d，发酵后的产物可直接饲喂或作为辅料与日粮混合饲喂。

实施例8

制备复合微生物制剂：发酵菌种分别按枯草芽孢杆菌BFC1601(Bacillussubtilis)：植物乳杆菌BFC1602(Lactobacillus)：酿酒酵母BFC1603(Saccharomycescerevisiae)为9:6:4的比例混合后，与发酵调节剂按1:6的比例混合制成微生物制剂；发酵调节剂的组成为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄，其质量浓度分别为：15％、10％、28％、36％。

制备发酵培养基：用于微贮的玉米秸秆必须进行铡切或揉碎切短处理，根据饲喂动物对象不同秸秆的处理长度有所不同。发酵培养基组成为微贮饲料、补充碳源(麦麸和糖蜜)和氮源(尿素和氨水)，其质量浓度分别为55％、3％、1％；

进行发酵：微生物制剂、硫酸铵、尿素和水混匀，微生物制剂按0.2％添加量，其余按发酵培养基配方添加，喷洒接种充分搅拌均匀，装入呼吸袋中，压实封口，自然发酵8d，可直接饲喂或作为辅料与日粮混合饲喂。

实施例9

用上述实施例2中的发酵玉米秸秆替代羊草、全株玉米青贮或精料饲喂奶牛，研究其对奶牛生产性能的影响。试验选用64头泌乳中后期荷斯坦奶牛，按照泌乳日龄、产奶量、胎次相近的原则分为4组，其中一组为对照组(不替换成发酵玉米秸秆喂食)，其他三组分别用发酵秸秆搭配DDGS替代奶牛日粮中的15％羊草、12.5％青贮或7％精料补充料(DM基础)。

试验饲养管理：

试验组和对照组在不同牛舍，饲养管理和饲养环境一致，固定专人饲养，不改变试验组和对照组的饲料配方和饲喂方式。预试期为10d，试验期为30d。每日07:00、14:00和17:30分3次投料，自由釆食，自由饮水，机械挤奶。

表1不同试验日粮对奶牛产奶量、乳成分及体况评分的影响

注：同一行的不同字母表示处理间差异显著。

由表1可以看出，用发酵玉米秸秆替代的一部分羊草或玉米青贮，甚至替代一部分精料来喂奶牛，奶牛的干物质采食量、产奶量和体况均未受影响，乳脂量和牛奶尿素氮含量显著降低。

对比例1

未经发酵的秸秆。

对比例2

与实施例2相比，除了复合微生物制剂的菌种替换为市售菌种，其他条件与实施例2相同。

对比例3

与实施例2相比，除了复合微生物制剂的菌种组成为枯草芽孢杆菌BFC1601和植物乳杆菌BFC1602，其他条件与实施例2相同。

对比例4

与实施例2相比，除了复合微生物制剂的菌种组成为枯草芽孢杆菌BFC1601和酿酒酵母BFC1603，其他条件与实施例2相同。

对比例5

与实施例2相比，除了复合微生物制剂的菌种组成为植物乳杆菌BFC1601和酿酒酵母BFC1603，其他条件与实施例2相同。

对比例6

与实施例2相比，复合微生物制剂的枯草芽孢杆菌BFC1601：植物乳杆菌BFC1602：酿酒酵母BFC1603比例为3:9:8，其他条件与实施例2相同。

对比例7

与实施例2相比，复合微生物制剂的枯草芽孢杆菌BFC1601：植物乳杆菌BFC1602：酿酒酵母BFC1603比例为1:1:1，其他条件与实施例2相同。

实施例和对比例的玉米秸秆进行微生物常规和营养常规检测，如表2和表3所示。

表2发酵玉米秸秆附着的微生物数量

	植物乳杆菌BFC1602	枯草芽孢杆菌BFC1601	酿酒酵母BFC1603
				实施例4	3.1×10⁹	2.7×10¹⁰	7.5×10⁸
实施例5	3.0×10⁹	2.5×10¹⁰	7.3×10⁸
				实施例6	2.8×10⁹	2.6×10¹⁰	7.4×10⁸
实施例7	2.9×10⁹	2.5×10¹⁰	7.1×10⁸
				对比例1	1.7×10⁵	1.1×10³	5.1×10²
对比例2	3.2×10⁸	2.5×10⁶	7.3×10⁴
				对比例3	2.2×10⁹	1.6×10¹⁰	1.1×10³
对比例4	1.4×10⁶	2.3×10¹¹	7.1×10⁹
				对比例5	2.9×10⁹	1.5×10³-	6.4×10⁸
对比例6	2.2×10⁷	2.6×10¹⁰	6.2×10⁸
				对比例7	2.7×10⁸	2.4×10⁸	6.1×10⁸

从表2可以看出，实施例中发酵后的玉米秸秆附着的微生物数量都能符合标准，而对比例1中未经发酵的玉米秸秆微生物附着量低，其他对比例中的微生物附着量也都未达到标准。

表3发酵对玉米秸秆化学成分的影响

由表3的结果可以看出，本发明实施例1-5制备的复合微生物制剂的粗蛋白含量高，实施例的粗蛋白含量增加了29％以上，NDF(中性膳食纤维)降解率高达14.3％，NDF消化率达47％，干物质消化率达49％，其中，实施例1中各效果明显最好；与对比例对比可知，本发明的复合生物制剂的发酵效果具有显著的进步，从对比例2可知，市售菌种的发酵效果不如本发明所筛选保藏的菌种；从对比例3-5可知，三个组成复合微生物制剂的菌种缺一不可，具有协同增效的作用；从对比例6-7可知，复合微生物制剂的菌种组合配比只有在本发明所述的范围内才能达到良好的发酵效果。

综上所述，本发明的复合微生物制剂的菌种为发明人筛选并提交CGMCC保藏，菌种组合简洁高效，互相配合，协同增效，缺一不可，相比于市售同类菌种有更卓越的发酵效果。

注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims

1.一种复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂包括枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母；

其中，所述枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13131，保藏日期为2016年10月21日；

2.根据权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BFC1601：植物乳杆菌(Lactobacillus)BFC1602：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BFC1603为(3-12):(1-8):(1-7)，以菌落形成单位计，优选为(5-9):(3-6):(1-4)。

3.根据权利要求1或2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂还包括发酵调节剂；

优选地，所述发酵调节剂为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl或MgSO₄中的任意一种或至少两种的组合，优选为K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄的组合；

优选地，所述K₂HPO₄的质量浓度为10-25％，优选为19％；

优选地，所述KH₂PO₄的质量浓度为8-20％，优选为14％；

优选地，所述NaCl的质量浓度为15-30％，优选为24％；

优选地，所述MgSO₄的质量浓度为25-40％，优选为33％。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：分别按配方量制备微生物混合液和发酵调节剂，将制备的微生物混合液和发酵调节剂混合；

优选地，所述微生物混合液与所述发酵调节剂的质量比为1:(1-10)，优选为1:(2-6)，进一步优选为1:3；

5.一种如权利要求1-3中任一项所述的复合微生物制剂用于秸秆饲料的发酵。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述秸秆饲料为甜高粱、玉米、芦苇或棉花中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述发酵包括如下具体步骤：

(1)采用秸秆饲料配制发酵培养基；

8.根据权利要求5-7中任一项所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述发酵培养基还包括补充碳源和氮源；

优选地，所述补充碳源为玉米粉、麦麸、葡萄糖、蔗糖、谷物淀粉或糖蜜中的任意一种或至少两种的组合，优选为玉米粉和麦麸的组合；

优选地，所述氮源为无机氮源和/或有机氮源，优选为无机氮源；

优选地，所述无机氮源为硫酸铵、尿素、氨水或硝酸盐中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述有机氮源为玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉或酵母浸出膏中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述发酵培养基中补充碳源的质量浓度为1-10％，优选为3％；

优选地，所述发酵培养基中氮源的质量浓度为0.1-3％，优选为0.5％。

9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述微贮饲料在所述发酵培养基的质量浓度为40-60％，优选为43-55％，进一步优选为49％；

优选地，步骤(2)所述复合微生物制剂的加入量为0.1-1％，优选为0.1-0.5％；

优选地，所述发酵的时间为3-15天，优选为5天；

优选地，步骤(3)所述发酵后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601的含量不低于1×10⁹cfu/g；

优选地，步骤(3)所述发酵后的植物乳杆菌(Lactobacillus)BFC1602的含量不低于2×10⁸cfu/g；

优选地，步骤(3)所述发酵后的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BFC1603的含量不低于5×10⁷cfu/g。

10.一种如权利要求1-3中任一项所述的复合微生物制剂用于制备饲料和/或饲料辅料。