CN102696860B - 基于醋糟和杂粕的一种高效低成本的微生物饲料蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用醋糟、杂粕经益生菌三期发酵，生产一种高效低成本的微生物饲料蛋白。是以醋糟为主要碳源，棉粕为主要氮源兼部分碳源，经食品级霉菌一期发酵预处理，再以芽孢杆菌和酵母菌为发酵菌种同时补料添加部分棉粕进行二期发酵，最后再添加部分豆粕和菜子粕作为氮源兼部分碳源，接种乳酸菌和耐酸双歧杆菌并充分混匀后，分装在单向膜厌氧袋中密封保存，即三期发酵获得成品。本发明生产成本极低，所以可以作为饲料组份，添加量达5-40%。由于成品不需要干燥处理，活菌数极高，酶量丰富，杂菌极少，饲养效果明显：大幅度提高畜禽饲料利用率，提高产量，改善肠道环境，提高免疫力和抵抗力，代替抗生素，改善动物产品品质。
Description
技术领域
本发明属于微生物饲料添加剂领域，特别是涉及基于纤维质的酿造废弃物的高效低成本的新型微生物饲料蛋白或微生物饲料添加剂。
背景技术
目前饲料产业利润很低，绝大多数是以粮食为原料进行配合，成本难以下降，具有充分提高饲料利用率降低饲料成本的微生物饲料给饲料业和养殖业带来新的希望。众所周知，动物胃肠道内存在着大量的微生物，这些微生物群系之间，以及微生物与动物之间，形成了相互依存，相互作用的不可分割的整体——微生态系统。益生菌是这个微生态系统主要活菌组成部分，对动物的生长、发育、消化、吸收、营养和免疫等具有重要意义。化学合成类药物,特别是低剂量抗生素饲料添加剂的广泛使用，不仅破坏了动物胃肠道内的微生态平衡，而且产生了耐药性和药物残留等一系列副作用,给人类和动物的健康带来了严重危害。因此,一些国家和地区已经限制或禁止其使用，如欧盟在2006年在饲料添加剂中全面禁止使用低剂量的抗生素,这就更加促使了抗生素替代品的研究和应用。益生菌，具有绿色安全、无抗药性、无残留、无毒副作用等优点，对动物具有防治疾病、促进生长、提高饲料利用率、保健等多方面的益生作用，可以完全或部分替代抗生素。主力益生菌，如乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌、枯草杆菌都是在美国FDA、饲料管理协会及中国农业部公布的益生菌。
其中枯草杆菌类，能形成芽孢，将自己保护起来，发芽快，复活率高，最能耐酸、碱、盐及抗高温高压，因而在饲料加工、保存、通过胃酸环境等过程中有较高的稳定性。枯草杆菌类是好氧兼性厌氧，定植肠道后可夺取肠内有限的氧气，维持肠内厌氧环境，从而促进乳酸菌、双歧杆菌等的生长，抑制各种有害菌的繁殖。枯草杆菌类生产丰富的酶群，维生素，氨基酸，有机酸，寡糖等物质，提高饲料利用率和总体营养水平。枯草杆菌可也能促进机体免疫器官成熟，使T淋巴细胞和B淋巴细胞增多，提高机体的免疫力，使内源干扰素产生感应同时枯草杆菌可产生70多种包括枯草杆菌素等抗菌物质，能杀死或抑制大部分葡萄球菌，链球菌，绿脓杆菌，肠道杆菌，沙门氏菌，变形杆菌等有害菌。枯草杆菌能产生氨基氧化酶及分解硫化氢的酶类等，添加后粪便恶臭大大降低。因此，枯草杆菌是有很大潜力的高成活率的益生菌。
作为主要益生之一，乳酸菌在体内可产生各种消化酶, 有助于食物消化, 也可降解饲料中的某些抗营养因子, 提高饲料转化率。同时又有预防和治疗疾病作用， 如对维持机体微生态平衡有着重要的作用，增加肠道有益菌和抑制病原菌， 降低胆固醇，降血压，抑制肠癌的发生，治疗痢疾。乳酸菌增强机体免疫力，进入动物体内, 除产生细菌素以外, 还可以刺激宿主产生防御素。
作为主要益生菌之一，双歧杆菌具有保持肠道正常微生物菌群平衡的作用，阻止致病菌、条件致病菌的入侵和定植。双歧杆菌具有免疫调节和辅助治疗疾病的作用，及能合成VB1、VB2、VB6以及VK 等多种维生素，同时还能合成多种氨基酸，双歧杆菌可使仔猪肠道内的蔗糖酶、乳糖酶、三肽酶的活性提高。降低血清胆甾醇水平，控制内毒素血症，分降解一些致癌物质，又启动机体免疫功能，具有一定的抗肿瘤作用。
酵母作为益生菌，具有改善饲料风味，增加饲料营养成分，促进养分的转化和吸收，从而促进生长，促进消化道微生态体系健康发展，调节机体免疫功能，提高生产性能和肉产品品质，改善水质，减少有害气体排放等功能。
目前国内外生物饲料分为以下几类：一是早期的菌体蛋白饲料，菌体为死菌体，不是真正的生物饲料。二是基于粮食或常用工业发酵原料的生物发酵饲料，也需要低温干燥或冷冻干燥保存处理，总体上讲成本大，饲用时添加量少，生物活性也不是很明显！如发明专利（CN1682599A），（CN1806659A），（CN101190003A），（CN102204632A）。三是基于秸秆、酒糟等废弃物，用木霉或纤维素酶处理，或益生菌发酵，低温干燥处理保存，原料也需要灭菌处理，成本大，但活性成分不易保存，益生菌效果不明显，如发明专利（CN101897381B），（CN100337555C）。四是以非纤维质废弃物为发酵原料，进行厌氧发酵，但原料来源有限，成本难以降低，如发明专利（CN101554202A），（CN100574627C）。五是本发明的生物饲料技术，基于纤维质醋糟杂粕为发酵原料，生产成本及低，原料不需灭菌，产品不需干燥，活性成分全部保存，上述需氧和厌氧的益生菌效果非常明显，产品具有很大的竞争力和市场容量，这样的生物饲料既是饲料蛋白，又是富含益生活菌及功能酶和因子，价廉物美。
在以往的研究中，如发明专利（CN1285156A）、（CN101491290A）、（CN101366445A），将鲜白酒糟部分烘干，能耗大，用一种白地霉或拟青霉菌接种降解，但对于木质素效果不明显，产品没有益生菌的功效。又如发明专利（CN101919490A）（CN101756009A）及（CN101756044A）中，醋糟没有经过富含木质素酶和纤维素酶的菌群预处理，仅靠加纤维素酶等，成本高，效果不明显，而且，需氧益生菌和厌氧益生菌没有前后分期发酵，导致双方都发酵不好。发明专利（CN101756012A）虽是有二期发酵，但一期的黑曲酶对木质素和纤维素降解不明显，二期也是需氧发酵，没有益生菌的发酵。上述三种发明的产品都要经过低温干燥处理，能耗大，菌酶保存率低。因此生产成本高，饲用效果不明显，不利于产业化推广。
发明内容
本发明的目的在于生产一种基于纤维质醋糟、杂粕的高效极低成本的微生物饲料添加剂，添加量大，可达5-40%，综合营养丰富，也称微生物饲料蛋白，成品中益生菌主要有芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌，活菌数60亿以上cfu/g，功能酶、营养物质丰富，必需氨基酸匀恒，饲养效果显著，价廉物美，保存期长，市场容量大，环境友好，社会和经济效益明显。
本发明所述的基于醋糟的微生物饲料是以醋糟为主要碳源，棉粕为主要氮源兼部分碳源，经食品级霉菌一期发酵预处理，再以芽孢杆菌和酵母菌为发酵菌种同时补料添加部分棉粕进行二期发酵，最后再添加部分豆粕和菜子粕作为氮源兼部分碳源，接种乳酸菌和耐酸双歧杆菌并充分混匀后，分装在单向膜厌氧袋中密封保存，即三期发酵获得成品。
本发明所有菌种
霉菌为：粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila). 中间脉孢霉(Neurospora intermedia)的任意一种或多种。酵母菌为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母（Candida utilis），啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的任意一种或多种。双歧杆菌为：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等。乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），干酪乳杆菌(Lactobacillus casei )等的任意一种或多种。芽孢杆菌为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆杆菌（Bacillus natto）的任意一种或多种。上述菌种为普通常规的商品化菌株，可在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）或市场上购买到。
本发明产品的具体生产过程如下：
1第一期生物预处理发酵
（1） 脉孢霉种子培养和生产培养基。
斜面培养基和平板培养基：马铃薯200 g，蔗糖 20 g，琼脂 20 g，定容1L中，pH 5.0， 110℃灭菌30min。接种30℃培养4-10 天。
种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨 5g，酵母浸膏3 g，麦芽汁3g，FeSO4·7H2O 0.005g，ZnSO4 0.0014g，MnSO4.4H2O 0.0016g，CoCl20.002 g，定溶于1 L中，pH 5.0。500 ml 三角瓶中加100 ml 培养基，110℃灭菌30min。
固态发酵生产种子培养基和生产培养基：按质量计，40-100目粉碎后的湿醋糟占培养基的10-90%，棉粕占5-40%，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.1-3%，尿素占0.1-3%，碳酸钙占0.1-5%，磷酸二氢钾占0.1-3%，硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1%，培养基最终含水量为53-65%。
(2) 培养方法
将脉孢菌在斜面培养基上划单菌落复壮，再挑选强壮的单菌落，各接种在新的脉孢菌斜面培养基25-38℃生长，斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中，装液量100-250ml /L三角瓶，150-220 r/min，25-38℃，培养24-48h，再各以1-5%（V/V）接种量，混合转接到200L的种子罐中，于25-38℃，150-220 r /min培养24-48h，活菌总数为1×107 cfu/ml以上，再以1-10%接种量（重量）转接到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，25-38℃，发酵24-72h，作为固态发酵生产种子，以1-15%接种量（重量）接种到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，25-38℃，发酵24-72h，完成一期预处理发酵。进入连续生产阶段，一期固态发酵接种生产种子到上次发酵的预处理的固态培养基菌剂，按1-20%接种量接种。
第二期发酵
（1）芽孢杆菌培养基
芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂15g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000ml，最终pH7.0±0.2。110-121℃灭菌20-30min.
芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐培养基：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖5.0g/L，FeCl2·6H2O 0.07g/L，MnC12·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L，pH 6.5-7.0，110-121℃灭菌20-30min。
（2）酵母菌培养基
酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100 ml)：葡萄糖2 g、酵母浸出物1 g、蛋白胨2 g、琼脂2 g，pH 值约6.0。
摇瓶种子培养基和种子罐培养基：成分同斜面培养基，不加琼脂。
（3）二期发酵培养基由一期发酵预处理的固态菌剂再加10-30%棉粕组成，含水量为45-55%。首次启动二期发酵要制作混合酵母菌和混合芽孢杆菌液体种子液，再固态发酵产生固态种子，以1-12%接种量接到一期发酵后的固态菌剂。
（4）培养方法
芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下分别将4 ℃保存的芽孢杆菌菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆杆菌（Bacillus natto）。各接一环至斜面培养基中，30-37 ℃培养16-36 h 复苏菌种。再在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基，装液量100-300ml /L三角瓶， 150-240 r/min，28-38℃，培养16-24h，再以1-10%的接种量混合接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，150-240r/min，通气量为20-50L/min，培养16-24h后制得复合芽孢杆菌液体种子，活菌总数为2×107 cfu/ml以上。
酵母菌液体菌种培养：
无菌条件下分别将4 ℃保存的酵母菌菌种：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母（Candida utilis）。分别接一环至斜面培养基中，28-38 ℃培养24-48 h 复苏菌种。再挑单菌落各在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基，装液量100-300ml /L三角瓶, 150-240 r/min，28-38℃ ,培养24-48h，再以1-10%的接种量混合接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，150-240r/min，通气量为20-50L/min，培养24-48h后制得复合酵母菌液体种子，活菌总数为2×107 cfu/ml以上。
二期固态发酵：
上述混合芽孢杆菌液体种子以1-10%接种量，混合酵母菌液体菌种以1-10%接种量，都接种到二期发酵培养基中，充分搅拌，28-38℃通气发酵12-72h，得到第一批二期固态发酵完成后的半成品。进入连续生产阶段，种子为上次二期发酵的剩余固态菌剂，按1-20%接种量，接种到二期发酵培养基中，这样循环接种利用。
3 第三期发酵
（1）乳酸菌培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
摇瓶和种子罐乳酸菌种子培养基：大豆低聚糖2.25%、葡萄糖2.00%、蛋白胨1.25%、酵母粉1.25%、番茄汁6.50%、吐温 80.10%、磷酸氢二钾0.20%。pH 6.5，1L的三角瓶装液量200 ml。
以上培养基配好后均在115-120℃条件下高压灭菌20-30min。
（2）双歧杆菌的培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
厌氧瓶和种子罐双歧杆菌增殖培养基：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温-80 1.0ml，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，聚果糖5g和碳酸钙1g 番茄汁65ml。加蒸馏水至1000ml，调pH值为6.5。
以上培养基配好后均在115-120℃条件下高压灭菌15-30min。
（3） 三期发酵培养基
在二期固态发酵菌剂上，加5-30%菜子粕和5-30%豆粕，充分混匀，组成三期发酵培养基，含水量为30-35%。首次启动三期发酵要制作乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，再厌氧固态发酵产生固态种子，以1-15%接种量接到三期发酵培养基进行三期发酵。
（4）培养方法
乳酸菌种子培养
将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ）等在MRS斜面培养基上划线活化，在33-38℃培养24-72h进行复壮，并形成单菌落，再各挑取单菌落，接种到乳酸菌种子培养基，35-38℃静置培养24-72h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量。再按1-10%接种量接种到种子罐乳酸菌种子培养基静置培养24-60h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量，活菌总数为5×107 cfu/ml以上。
双歧杆菌种子培养
首先是菌种活化，取保存的菌种，在厌氧操作台上，在装有MRS固体斜面培养基上划线复壮，置于35-38 ℃厌氧培养24 -72h，挑选强壮单菌落，接入装有10 ml液体MRS 培养基的充满氮气的厌氧管中，置于35-38℃厌氧培养24-72 h。再按0.1-1%接种量，接到1L厌氧瓶双歧杆菌增殖培养基中置于35-38℃厌氧培养24-72h，然后再按1-10%接种量接到种子罐双歧杆菌增殖培养基中，进行35-38 ℃厌氧培养，活菌总数为5×107 cfu/ml以上。
第三期固态发酵
在二期固态发酵菌剂上，加5-30%菜子粕和5-30%豆粕组成三期发酵培养基，含水量为30-35%，首次启动三期发酵要制作混合乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，混合乳酸菌种子液和双歧杆菌种子液按1:(1-4)比例，活菌总数为5×107 cfu/ml以上，以1-15%接种量接种到三期发酵培养基上，充分搅拌后，尽快装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，含水量30-35%，产品保质期可达1到2年，保存二到三个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g固体。
进入连续发酵阶段，三期发酵一个月后，以此成品为种子，按1-20%接种量，接到上述三期发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵。产品保质期可达1到3年，保存二个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g。
本发明固体原料价格低廉，不需高温灭菌，不需要购买纤维素酶制剂来降解纤维质原料，成品不需要干燥处理，保质期一年以上，不需要复杂的设备，生产成本极低，所以可以作为饲料组份，添加量达5-40%。由于成品不需要干燥处理，活菌数极高，酶量丰富，杂菌极少，饲养效果明显：大幅度提高畜禽饲料利用率，提高产量，改善肠道环境，提高免疫力和抵抗力，代替抗生素，改善动物产品品质。本发明化废为宝，同时消除栏舍恶臭，因而具有明显的生态和社会效益。
具体实施方式
下述实施例中所用菌种仅为举例说明，不是对本发明的限制，本发明保护范围内的菌种均都实现发明目的。
实施例1
第一期生物预处理发酵
（1） 脉孢霉种子培养和生产培养基。
斜面培养基和平板培养基：马铃薯200 g，蔗糖 20 g，琼脂 20 g，定容1 L 中，pH 5.0, 110℃灭菌30min。接种30℃，培养7-10 天。
种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨 5g，酵母浸膏3 g，麦芽汁3g，FeSO4·7H2O 0.005g，ZnSO4 0.0014g，MnSO4.4H2O 0.0016g，CoCl20.002 g，定容于1 L中，pH 5.0。500 ml 三角瓶中加100 ml 培养基，110℃灭菌30min。
固态发酵生产种子培养基和生产培养基：粉碎后的湿醋糟76% 棉粕18%，硝酸氨2%，尿素1%，碳酸钙2%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁0.1%，培养基最终含水量为58%。
（2） 培养方法
将粗糙脉孢霉(Neurospora crassa CGMCC3.1600)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila, CGMCC3.1618). 中间脉孢霉(Neurospora intermedia, CGMCC 3.591)各在斜面培养基上划单菌落复壮，再各挑选强壮的单菌落，接种在新的脉孢菌斜面培养基30℃生长，斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中, 装液量200ml /1L三角瓶, 180 r/min，30℃ ,条件下培养24h，再以5%接种量，混合转接到200L的种子罐中，于30℃ , 180 r /m in培养24h，活菌总数为5×108cfu/ml以上，再以10%接种量转接到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，30℃，发酵48h，作为固态发酵生产种子，以10%接种量接种到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，30℃，发酵48h，完成一期预处发酵。进入连续生产阶段，一期发酵接种生产种子为上次发酵的预处理的固态培养菌制，按10%接种量接种。
实施例2
第二期发酵
（1）芽孢杆菌培养基
芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂15g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000ml，最终pH7.0±0.2。110℃灭菌30min；
芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐培养基：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖5.0g/L，FeCl2·6H2O 0.07g/L，MnC12·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L，pH 7.0，110℃灭菌30min。
（2）酵母菌培养基
酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100 ml)：葡萄糖2 g、酵母浸出物1 g、蛋白胨2 g、琼脂2 g，pH 值约6.0。
摇瓶种子培养基和种子罐培养基：成分同斜面培养基,不加琼脂。
（3）二期发酵培养基由一期发酵预处理的固态菌剂再加20%棉粕组成，含水量为49%。首次启动二期发酵要制作酵母菌和芽孢杆菌液体种子液，再固态发酵产生固态种子，以10%接种量接到二期发酵培养基中。
（4）培养方法
芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下分别将4 ℃保存的芽孢杆菌菌种，即地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis, CGMCC 1.813）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, CGMCC 1.884）、纳豆杆菌（Bacillus natto, CGMCC 1.1086）各接一环至斜面培养基中，37 ℃培养36 h 复苏菌种。再在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基，装液量200ml /1L三角瓶, 220 r/min，30℃ ,培养16h，再各以2%的接种量接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，220r/min，通气量为40L/min，培养24h后制得混合芽孢杆菌液体种子。
酵母菌液体菌种培养：
无菌条件下分别将4 ℃保存的酵母菌菌种：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, CGMCC 2.1527)，热带假丝酵母(Candida tropicalis, CGMCC 2.637)，产朊假丝酵母（Candida utilis, CGMCC 2.1180）各接一环至斜面培养基中，30 ℃培养24 h 复苏菌种。再分别在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基，装液量200ml /1L三角瓶, 220 r/min，30℃ ,培养24h，再各以2%的接种量接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，220r/min，通气量为40L/min，培养24h后制得混合酵母菌液体种子。
二期固态发酵：
上述混合芽孢杆菌液体种子以5%接种量，混合酵母菌液体菌种以2%接种量，接种到二期发酵培养基中，充分搅拌，30℃通气发酵48h，得到第一批二期固态发酵完成后的半成品。进入连续生产阶段，固态发酵种子为上次二期发酵的剩余固态菌剂，按10%接种量，接种到二期发酵培养基中，这样循环接种利用。
实施例3
第三期发酵
(1)乳酸菌培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
摇瓶和种子罐乳酸菌种子培养基(g/L)：大豆低聚糖2.25%、葡萄糖2.00%、蛋白胨1.25%、酵母粉1.25%、番茄汁6.50%、吐温 80.10%、磷酸氢二钾0.20%。pH 6.5，1L的三角瓶装液量200 ml。
以上培养基配好后均在115℃条件下高压灭菌30min。
(2) 双歧杆菌的培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
厌氧瓶和种子罐双歧杆菌增殖培养基: 蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温-80 1.0ml，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，聚果糖5g和碳酸钙1g 番茄汁65ml，加蒸馏水至1000ml，调pH值为6.5。
以上培养基配好后均在115℃条件下高压灭菌30min。
（3）三期发酵培养基：
在二期固态发酵菌剂上，加20%菜子粕和20%豆粕，充分混匀，组成三期发酵培养基，含水量为32%。首次启动三期发酵要制作乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，再厌氧固态发酵产生固态种子，以10%接种量接到三期发酵培养基中进行三期发酵。
（4）培养方法
乳酸菌种子培养
将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, CGMCC 1.557），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus, CGMCC 1.1482），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus, CGMCC 1.2467），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis, CGMCC 1.2467），干酪乳杆菌(Lactobacillus casei, CGMCC 1.62) 等各在MRS斜面培养基上划线活化，在37℃培养28h进行复壮，并形成单菌落，再各挑取单菌落，接种到乳酸菌种子培养基，37℃静置培养24h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量。再各按2%接种量接种到种子罐乳酸菌种子培养基静置培养48h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量。
双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，CGMCC 1.2477）种子培养
首先是菌种活化，取保存的菌种，在厌氧操作台上，在装有MRS固体斜面培养基上划线复壮，置于37 ℃厌氧培养48h，挑选强壮单菌落，接入装有10 ml液体MRS 培养基的充满氮气的厌氧管中，置于37 ℃厌氧培养24 h。再按1%接种量，接到1L厌氧瓶双歧杆菌增殖培养基中置于37 ℃厌氧培养48h，然后再按2%接种量接到种子罐双歧杆菌增殖培养基中，进行37 ℃厌氧培养。双歧杆菌利用此培养基在37℃厌氧培养20h，活菌数可达1×1010cfu/ml。
第三期固态发酵
在二期固态发酵菌剂上，加20%菜子粕和20%豆粕组成，配成三期发酵培养基，含水量为32%，首次启动三期发酵要制作混合乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，混合乳酸菌种子液和双歧杆菌种子液按1:2比例以6%接种到三期发酵培养基上，充分搅拌后，尽快装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，含水量32%，产品保质期可达2年，保存二个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g固体。
进入连续生产阶段，三期发酵一个月后，以此成品为种子，按10%接种量，接到上述三期发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，进行连续生产，产品保质期可达2年，保存二个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g，产品检测结果如表1。
上述三期发酵，实际上醋糟约为40%， 棉粕、菜籽粕、豆粕各约为20%，因为棉粕精氨酸含量高达3.6%-3.8%，显著高于豆粕，是菜籽粕的2倍，而赖氨酸含量仅为1.3%-1.5%，只有豆粕的50%，利用率低，赖氨酸是棉粕的第一限制性氨基酸；蛋氨酸含量仅为0.4 %，只有菜籽粕的50 %。所以本发明的功能饲料蛋白必需氨基酸相对均衡，是一种优质的功能性饲料蛋白。
表1.三期发酵成品检测结果
| 检测项目 | 干基（%） | 标准 |
| 粗蛋白质（%） | 28.9 | ＞15 |
| 粗脂肪(g/kg) | 25.11 | ＞15 |
| 粗纤维 | 7.5 | ＜9 |
| 棉酚 | 0.0001 | ＜0.03 |
| 异硫氰酸酯 | 0.012 | ＜0.075 |
| 恶唑烷硫酮 | 0.0051 | |
| 粗灰分(%) | 9.7 | ＜10 |
| 钙(%) | 0.8 | 0.4-0.8 |
| 水溶性氯化物(%) | 0.4 | 0.3-0.8 |
| 霉菌总数(cfu/g) | 4.17×104 | ＜4.5×104 |
| 沙门氏菌(cfu/25g) | 不得检出 | |
| 黄曲霉毒B1(μg/kg) | 3.75 | ＜20 |
实施例4
产品效果实验
试验点为江苏省镇江市京口区谏壁镇龙山村猪场，取60只断奶小猪（长白猪），20公斤左右，混合放养，随机组合成两组，每组30只，试验日粮配方如表2，饲养90天，试验结果如表3。
表2 试验猪日粮配方（%）
| 日粮组成 | 试验组 | 对照组 |
| 玉米 | 62 | 62 |
| 豆粕 | 18 | 28 |
| 麸皮 | 5 | 5 |
| 预混料 | 5 | 5 |
| 微生物饲料 | 10 | 0 |
| 合计 | 100 | 100 |
表3 微生物饲料试验结果
| 项目 组别 | 试验组 | 对照组 |
| 实验猪数量（头） | 30 | 30 |
| 平均始重（kg/头） | 19.6±1.23 | 20.1±1.33 |
| 平均末重（kg/头） | 98±1.91 | 85±1.82 |
| 全期净增重（kg/头） | 78.4 | 64.9 |
| 平均日增重（kg/头·日） | 0.871 | 0.721 |
| 平均耗料量（kg/头） | 180.32 | 175.23 |
| 日采食量（kg/头·日） | 2.00 | 1.95 |
| 料肉比 | 2.3:1 | 2.7:1 |
本发明的饲料成本价为1800-2000元/吨，售价为3500元每吨，和豆粕的价格差不多，所以以10%的本发明微生物饲料代替10%的豆粕，从日粮饲料成本上刚好差不多。但是使用本发明饲料的料肉比从2.7:1下降到2.3:1，尽管日采食量从1.95上升到2.00，但是日增重更是从0.721上升到0.871.总体上讲，全期毛重相对于对照组增加13.5Kg，猪价以14元/Kg算增加189元，饲料只增了5.09Kg，相当于20元不到，因此每头猪直接增加收入169元，不包括用药减少，生病减少，猪价略高等增收因素，总体上讲，使用本发明饲料，饲用和经济效果非常明显。
Claims (2)
1.一种基于醋糟的微生物饲料，其特征是以醋糟为主要碳源，棉粕为主要氮源兼部分碳源，组成一期发酵培养基；经食品级霉菌一期发酵得固态菌剂，向一期发酵所得固态菌剂中再加5-30%棉粕组成二期发酵培养基，二期发酵培养基含水量为45-55%；以芽孢杆菌和酵母菌为发酵菌种，进行二期发酵得固态菌剂；再向二期发酵所得固态菌剂中添加5-30%菜籽粕和5-30%豆粕组成三期发酵培养基，三期发酵培养基含水量为30-35%，接种乳酸菌和耐酸双歧杆菌并充分混匀后，分装在单向膜厌氧袋中密封保存，进行三期发酵获得成品；
其中：
所述一期发酵发酵培养基配方为醋糟10-90%，棉粕5-40%，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.1-3%，尿素占0.1-3%，碳酸钙占0.1-5%，磷酸二氢钾占0.1-3%，硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1%；一期发酵发酵培养基的含水量为53-70%；
所述霉菌为：粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila)，中间脉孢霉(Neurospora intermedia) 的任意一种或多种；酵母菌为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母（Candida utilis），啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的任意一种或多种；双歧杆菌为：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)；乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 的任意一种或多种；芽孢杆菌为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的微生物饲料，其特征是所述醋糟在潮湿状态下经过粉碎为20到100目。
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