CN108587965A - 一种直投式泡粑发酵剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提供一种直投式发酵泡粑发酵剂的制备方法：一是从米浆的发酵液中分离出发酵性能良好的纯种菌株作为微生物发酵粉应用的菌株，并复合培养驯化；二是制备作为发酵米制品特别是发酵泡粑用酿酒酵母菌、产香酵母菌、植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌的复合发酵菌剂。采用从发酵成熟的浆料中提取纯化在发酵过程中起主要作用的微生物，并进一步在泡粑米浆中驯化培养，最大程度的保留了泡粑发酵中起主要作用的微生物菌种及微生物发酵的特殊风味。采用复合保护剂和真空冷冻干燥工艺，能最大程度的保证微生物在干燥过程中的成活率。
Description
技术领域
本发明涉及传统食物发酵加工领域.重要特别是一种直投式泡粑发酵剂的制备方法。
背景技术
泡粑是四川地区一种经典的传统特色手工小吃，属于发酵米制食品的一种，传承悠久。发酵作为泡粑制作的重要工艺步骤，是利用微生物降解原料大米中所含的淀粉、蛋白质以及外援甜味素等，形成丰富的酶系及风味物质。使得熟化后的泡粑形成蓬松多孔的结构，色如凝脂的外观，舒适细腻的口感和独特的风味，且更易与被人体消化吸收。我们在传承和发扬泡粑传统工艺的同时，也展开对泡粑发酵微生物及发酵剂的深入研究，为泡粑产业化生产奠定基础。
发酵是泡粑制作的重要关键点，传统发酵工艺是利用成熟老浆中自然形成的微生物，自然常温发酵。整个发酵过程是一个不可控的自然变化过程，微生物种类复杂，增加了产生有毒有害物质的风险，也造成发酵品质不稳定。提取纯化泡粑发酵过程中的起主要作用的微生物，再通过培养、筛选、驯化，制备泡粑专用发酵菌剂，使泡粑发酵过程可控，发酵效果稳定，整个工艺流程更具有可操作性，更利于泡粑加工的工业化发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种直投式发酵泡粑发酵剂的制备方法：一是从米浆的发酵液中分离出发酵性能良好的纯种菌株作为微生物发酵粉应用的菌株，并复合培养驯化；二是制备作为发酵米制品特别是发酵泡粑用酿酒酵母菌、产香酵母、植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌的复合发酵菌剂。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种直投式泡粑发酵剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取10～30g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入80～100g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养24～48h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养36～60h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别3～5个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养24～48h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别3～5个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养36～60h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化3～5代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出3～5株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出3～5株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养24～48h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养24～48h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间36～60h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养5～10次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，5～10g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的0.3％～1.5％。
进一步的，步骤S5中所述离心机的转速为4000～5000r/min，离心分离时间为10～15min。
进一步的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：10％～15％脱脂乳、3％～6％VC、8％～10％海藻糖、10％～12％麦芽糖、5％～8％谷氨酸钠，保护剂使用量为5～10g菌泥使用100mL保护剂。
进一步的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-55～-65℃，预冻时间2h，冻干厚度0.4～0.6cm，冻干温度-70～-80℃，冻干时间15～24h。
进一步的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的64％～73％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
本发明具有以下优点：
1.本发明采用从发酵成熟的浆料中提取纯化在发酵过程中起主要作用的微生物，并进一步在泡粑米浆中驯化培养，最大程度的保留了泡粑发酵中起主要作用的微生物菌种及微生物发酵的特殊风味。
2.本发明驯化过程中采用了酿酒酵母、产香酵母、植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌复合培养驯化的方法，利用培养在泡粑发酵过程中四种菌种的协同作用。
3.本发明采用复合保护剂和真空冷冻干燥工艺，能最大程度的保证微生物在干燥过程中的成活率。
附图说明
图1为本发明的制备流程工艺示意图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取10g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入80g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养24h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养36h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别3个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养24h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别3个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养36h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化3～5代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出3株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出3株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养24h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养24h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间36h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养5次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，5g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的0.3％。
具体的，步骤S5中所述离心机的转速为4000r/min，离心分离时间为10min。
具体的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：10％脱脂乳、3％VC、8％海藻糖、10％麦芽糖、5％谷氨酸钠，保护剂使用量为5g菌泥使用100mL保护剂。
具体的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-55℃，预冻时间2h，冻干厚度0.4cm，冻干温度-70℃，冻干时间15h。
具体的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的64％％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
实施例2
包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取20g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入90g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养36h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养48h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别4个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养36h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别4个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养48h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化4代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出4株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出4株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养36h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养36h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间48h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养8次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，8g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的1.2％。
具体的，步骤S5中所述离心机的转速为4500r/min，离心分离时间为12min。
具体的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：13％脱脂乳、5％VC、9％海藻糖、11％麦芽糖、6％谷氨酸钠，保护剂使用量为8g菌泥使用100mL保护剂。
具体的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-60℃，预冻时间2h，冻干厚度0.5cm，冻干温度-75℃，冻干时间20h。
具体的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的70％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
实施例3
包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取30g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入100g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养48h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养60h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别5个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养48h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别5个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养60h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化3～5代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出5株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出5株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养48h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间60h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养10次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，10g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的1.5％。
具体的，步骤S5中所述离心机的转速为5000r/min，离心分离时间为15min。
具体的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：15％脱脂乳、6％VC、10％海藻糖、12％麦芽糖、8％谷氨酸钠，保护剂使用量为10g菌泥使用100mL保护剂。
具体的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-65℃，预冻时间2h，冻干厚度0.6cm，冻干温度-80℃，冻干时间24h。
具体的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的73％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
实施例4
包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取30g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入90g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养36h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养36h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别5个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养24h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别5个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养36h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化5代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出5株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出5株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养48h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养48h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间60h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养6次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，5～10g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的1.5％。
具体的，步骤S5中所述离心机的转速为5000r/min，离心分离时间为15min。
具体的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：15％脱脂乳、5％VC、9％海藻糖、11％麦芽糖、6％谷氨酸钠，保护剂使用量为8g菌泥使用100mL保护剂。
具体的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-55℃，预冻时间2h，冻干厚度0.4cm，冻干温度-70℃，冻干时间15h。
具体的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的73％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
实施例5
包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取10g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入100g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养24h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养60h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别4个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养24h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别4个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养60h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化4代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出4株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出4株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养24h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养24h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间60h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养10次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，10g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的1.5％。
具体的，步骤S5中所述离心机的转速为4000r/min，离心分离时间为15min。
进一步的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：15％脱脂乳、6％VC、10％海藻糖、12％麦芽糖、5％谷氨酸钠，保护剂使用量为5菌泥使用100mL保护剂。
具体的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-65℃，预冻时间2h，冻干厚度0.6cm，冻干温度-80℃，冻干时间24h。
具体的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的73％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
实施例6
包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取30g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入100g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养36h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养36h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别3个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养36h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别3个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养36h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化3代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出3株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出3株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养36h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养36h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间36h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养5次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，10g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的0.3％。
具体的，步骤S5中所述离心机的转速为4500r/min，离心分离时间为15min。
具体的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：10％脱脂乳、3％VC、8％海藻糖、10％麦芽糖、5％谷氨酸钠，保护剂使用量为5g菌泥使用100mL保护剂。
具体的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-60℃，预冻时间2h，冻干厚度0.6cm，冻干温度-75℃，冻干时间15h。
具体的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的64％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
实施例7
包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取20g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入90g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3～10-9 7个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养36h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养36h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别5个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养36h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别5个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养36h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用PDA和MRS培养基平板纯化5代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出5株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出5株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养36h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养36h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间36～60h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度30℃，培养时间48h，重复培养7次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10％；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，10g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的0.3％。
具体的，步骤S5中所述离心机的转速为5000r/min，离心分离时间为10min。
具体的，步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：10％脱脂乳、6％VC、10％海藻糖、12％麦芽糖、8％谷氨酸钠，保护剂使用量为10g菌泥使用100mL保护剂。
具体的，步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-55℃，预冻时间2h，冻干厚度0.4cm，冻干温度-70℃，冻干时间15h。
具体的，步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的70％，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
传统泡粑独特的品质和风味的形成主要原因是酵母菌和乳酸协同作用，不仅它们的代谢产物相互作用产生了等酯类呈香物质，还包括两种菌属互为利用对方的代谢产物作为营养素代谢生长，彼此促进，加快浆料中的活菌数量增长，提升发酵效果。
本发明在分离提纯成熟泡粑浆料中的主要菌种时发现浆料中的酵母菌和乳酸菌并非单一菌种，其中含有的植物乳酸菌活菌数相较于其他乳酸菌较高，是泡粑发酵的主要产酸菌种；而且植物乳酸菌在生长代谢过程中能产生一种特有的生物型防腐剂—乳酸杆菌素，对改善泡粑的贮存品质有一定的作用。
而发现的嗜酸乳酸菌在生长代谢过程中能产生一些有益泡粑发酵过程中其他微生物生长的物质，也能产生一些抗菌素抑制泡粑发酵过程中有害菌的生长，同时也能辅助产酸。酿酒酵母是泡粑浆料菌种分离中发现的主要酵母菌种，它在生长代谢中主要把单糖在无氧条件下转化为CO2和C2H5OH，CO2的大量产生能使泡粑结构蓬松，而C2H5OH自身能散发浓郁的醇香，也能和乳酸菌代谢物产生酯类呈香物质，提升泡粑的风味。产香酵母则是泡粑浆料中发现的另一种酵母菌，它主要是能把泡粑浆料中的单糖转化为一些产香物质，增加泡粑的风味，也能辅助酿酒酵母产生CO2和C2H5OH。
直投式泡粑发酵剂发酵泡粑与市售菌粉发酵泡粑品质比较
直投式泡粑发酵剂发酵泡粑、市售菌粉发酵泡粑、传统泡粑质构与感官品质比较
综上所述，本发明最终分离纯化泡粑成熟浆料中的酿酒酵母菌、产香酵母菌、植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌等四种菌种，并通过对四种菌种的复合驯化，产生由四种菌种在驯化过程中形成的复合菌系，再加工制作成直投式泡粑发酵剂。直投式泡粑发酵剂让泡粑的连续化工业生产成为可能。
Claims (5)
1.一种直投式泡粑发酵剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：菌种源的选取：称取10~30g采用传统发酵工艺循环多次并成功制作泡粑的米浆发酵液为直投式泡粑发酵粉微生物菌种源；
S2：菌悬液的培养，包括以下步骤：
S21.梯度稀释培养：
S211：将步骤S1所述发酵液，加入80~100g无菌生理盐水中，震荡搅拌均匀，配置成10-1稀释梯度菌悬液；
S212：用1mL移液枪量取步骤S2中制备的10-1稀释梯度菌悬液1mL，然后移入9mL无菌生理盐水中，混合均匀，配置成10-2稀释梯度菌悬液，重复上述步骤依次稀释菌悬液，直到配置完成10-3 ～10-97个稀释梯度的菌悬液；
S213：用1mL移液枪量取10-2～10-98个稀释梯度菌悬液，每个梯度每种培养基做3个涂布平行样，分别为酵母菌PDA平板培养基和乳酸菌MRS平板培养基；
S214：步骤S213所述PDA培养基置入30℃恒温培养箱培养24~48h，将MRS培养基置入37℃恒温培养箱培养36~60h；
S22.分离培养：挑选步骤S214中单个PDA培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似酿酒酵母和产香酵母菌菌落分别3~5个用PDA培养基表面平板划线的方式于30℃恒温培养箱培养24~48h；挑选步骤S214中单个MRS培养基表面菌落形态基本一致且占优势的疑似植物乳杆菌、嗜酸乳酸菌菌落分别3~5个用MRS培养基表面平板划线的方式于37℃恒温培养箱培养36~60h；
S23：纯化培养，包括以下步骤：
S231：步骤S22:中培养的菌种分别用 PDA 和 MRS 培养基平板纯化3~5代，然后分别镜检，确认所纯化培养的菌种为目标菌种；
S232：利用杜氏小管确认不同酿酒酵母和产香酵母产气量、分析不同酿酒酵母菌和产香酵母发酵液特性和生长曲线从步骤S23所纯化的酿酒酵母菌和产香酵母菌菌种中筛选出3 ~5株高发酵性能效的酿酒酵母和产香酵母菌菌株；利用对不同植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌进行革兰氏染色、葡萄糖产酸、产气实验、pH 值和生长曲线的分析，从步骤S231所纯化的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌菌种中筛选出3~5株高发酵性能的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌；
S3：菌种驯化，包括以下步骤：
S31：单菌种驯化：将步骤S311所筛选的酿酒酵母和产香酵母菌种接种入PDA与泡粑米浆比10:1的培养液中30℃培养24~48h为第一阶段，然后逐渐调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液每调整一次比例为一个培养阶段，每阶段培养24~48h；同理，步骤S311所筛选的植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌也首先接种入MRS与泡粑米浆比例为10:1的混合培养液，然后不断调整泡粑米浆比例，直到调整为纯泡粑米浆培养液，每调整一次为一个培养阶段，培养温度30℃，培养时间36~60h.通过国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S32：复合菌种驯化：将步骤S31培养的酿酒酵母菌和产香酵母菌纯泡粑米浆培养液与植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌纯泡粑米浆培养液按活菌数比例2.5:2:1:0.5混合接种入纯泡粑米浆培养液恒温震荡培养，培养温度 30℃，培养时间48h，重复培养5~10次，检测每次培养完成后的四种菌种活菌数，直到前后两次检测数据偏差小于10%；
S4：增殖培养：将步骤S32所培养的菌种利用泡粑米浆培养液增殖培养，通过食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验和食品微生物学检验霉菌和酵母计数的测定方法检测四种菌种的活菌数；
S5：离心分离：取步骤S4所增殖培养的复合菌液通过离心机进行离心分离，得到菌泥；
S6：冷冻干燥：将步骤S5所制得的菌泥加入保护剂中形成菌悬液，对菌悬液进行真空冷冻干燥制得菌粉；
S7：对应包装：将S6所制得的菌粉进行真空包装，制得直投式泡粑发酵剂，5~10g/袋；
S8：活化步骤S7所制得的菌粉，检测活化后的四种菌种的活菌数；
S9：利用制得的直投式泡粑发酵剂发酵泡粑米浆，确定直投式泡粑发酵剂的最适添加量为泡粑米浆重量比的0.3%~1.5%。
2.根据权利要求1所述的一种直投式泡粑发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤S5中所述离心机的转速为4000~5000r/min，离心分离时间为10~15min。
3.根据权利要求1所述的一种直投式泡粑发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤S6中所述真空冷冻采用的保护剂组成是：10%~15%脱脂乳、3%~6%VC、8%~10%海藻糖、10%~12%麦芽糖、5%~ 8%谷氨酸钠，保护剂使用量为5~10g菌泥使用100mL保护剂。
4.根据权利要求1所述的一种直投式泡粑发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤S6真空冷冻干燥预冻温度-55～-65℃，预冻时间2h，冻干厚度0.4~0.6cm，冻干温度-70~-80℃，冻干时间15~24h。
5.根据权利要求1所述的一种直投式泡粑发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤S8所测得的活菌数为步骤S4所测得的活菌数的64%~73%，菌种比例约为酿酒酵母菌、产香酵母菌，植物乳杆菌和嗜酸乳酸菌活菌数比例为2.5:2:1:0.5。
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