CN117165439A - 一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品。以冻干保护剂的干重计，所述保护剂含有50‑60％的二糖、25‑35％的第一氨基酸/蛋白、0.1‑1％的多糖、5‑10％的第二氨基酸/蛋白、5‑10％的抗氧化剂，所述二糖选自蔗糖、海藻糖的至少一种，所述第一氨基酸/蛋白为L‑精氨酸或其盐酸盐，所述多糖选自普鲁兰糖、阿拉伯胶、黄原胶的至少一种，所述第二氨基酸/蛋白为谷氨酸钠、酸水解酪蛋白、水解植物蛋白中的至少一种，所述抗氧化剂选自维生素C钠、谷胱甘肽、半胱氨酸盐酸盐的至少一种。以本发明的冻干保护剂制备的乳杆菌冻干制品解决了乳杆菌冻干制品常温放置稳定性差的难题。

Description

一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品。

背景技术

乳杆菌广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，乳酸杆菌是人体肠道内的正常菌群群员，含有乳酸杆菌的微生态制剂，也广泛应用于临床，常用于调整微生态失调，保持生态平衡，提高人体的健康水平，以达到防病、治病的效果。目前国内外乳杆菌产品不是很多，绝大多数乳杆菌制剂存在一个需要解决的非常关键的问题：乳杆菌对环境温度、氧气、湿度非常敏感。产品在常温下货架期寿命非常短，一般需要冷链运输并在低温储存下销售，这影响产品的应用方式及效果，另外还提高能耗。因此乳杆菌常温稳定性的解决关系到微生态制剂更好和更广泛的应用、以及提高生产企业的生产效率，有着极大的市场竞争力。

乳杆菌与其他微生物类似，直接冻干会对细胞造成不可逆的损伤，造成菌体的直接死亡或在存放过程中死亡，因此当前乳杆菌制品通常采用添加冻干保护剂来减少乳杆菌菌体在冷冻干燥过程中所受损伤，提高其冻干存活率与存放的稳定性。冻干保护剂对乳杆菌的主要保护原理包括：(1)减少微生物冻结时乳杆菌菌体的细胞膜破裂、细胞脱水、细胞质浓缩等物理化学变化造成的损伤；(2)填充作用，保证冻干体系中的有效成分不飞散；(3)防止冻干前沉淀；(4)维持冻干体系pH值，氧含量等。

已经有较多的现有技术利用冻干保护剂制备微生物冻干制品，例如专利CN102649945A、CN113005040A和CN114376977A中所呈现的技术。CN102649945A和CN113005040A都通过研究保护剂的成分和含量提高菌的冻干存活率，特别是CN113005040A能使得冻干存活率达到80％-90％。CN114376977A则更侧重于研究活菌制剂在结肠的靶向释放。然而与冻干存活率同样重要的是常温储存的稳定性。市场中的产品很少有能够在常温下长期存储的冻干制品，常温条件下冻干制品中活菌存活率随着保存时间迅速下降。专利CN113005040A的常温存储已经达到了较高的水平，其1个月存活率为79％。然而3个月后迅速降低到65％以下。

因此，为了进一步提高乳杆菌冻干粉在常温条件下储存时活菌存活率，有必要找到适宜的冻干保护剂，以解决冻干粉常温放置稳定性差的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冻干保护剂及含有其的混合液或乳杆菌冻干制品，有效解决乳杆菌冻干粉在常温条件下储存稳定性差的问题。

本发明的研究人员前期提供了一种冻干保护剂，以冻干保护剂的干重计，含有80-88％的二糖、0.1-1％的多糖、5-10％的氨基酸/蛋白和5-10％的抗氧化剂。该保护剂用作乳杆菌冻干保护时，冻干存活率高，而且能够有效提高常温存储稳定性，3个月、6个月常温存储存活率基本大于70％。

上述冻干保护剂在用于约氏乳杆菌和格氏乳杆菌冻干制品时，效果尤其令人惊喜，这两种乳杆菌冻干制品的3个月、6个月的常温存储存活率基本大于80％。虽然已证实前述配方的效果，然而针对商业化产品的活菌都努力实现常温存储存活率基本大于80％仍是需要的。

因而，本发明人基于前述方案已有的成果，进一步研究并提供了另一种能够使詹氏乳杆菌和卷曲乳杆菌的常温存储稳定性也能达到理想效果的冻干保护剂，以冻干保护剂的干重计，其含有50-60％的二糖、25-35％的第一氨基酸/蛋白、0.1-1％的多糖、5-10％的第二氨基酸/蛋白、5-10％的抗氧化剂，所述第一氨基酸/蛋白为L-精氨酸或其盐酸盐，所述第二氨基酸/蛋白为谷氨酸钠、酸水解酪蛋白、水解植物蛋白中的至少一种。

在一些实施方案中，所述二糖选自蔗糖、海藻糖的至少一种。

在一些实施方案中，所述50-60％的二糖包括35-60％的海藻糖和0-20％的蔗糖。

在一些实施方案中，所述5-10％的第二氨基酸/蛋白含有5-10％的谷氨酸钠。

在一些实施方案中，所述5-10％的第二氨基酸/蛋白含有5-7％的酸水解酪蛋白。

在一些实施方案中，所述第二氨基酸/蛋白为酸水解酪蛋白，根据研究结果，选用酸水解酪蛋白的保护剂其常温存储稳定性更高。在一些实施方案中，选用所述氨基酸/蛋白为谷氨酸钠，其成分单一，在药物制造中有一定优势。

在一些实施方案中，所述多糖选自普鲁兰糖、阿拉伯胶、黄原胶的至少一种。在一些实施方案中，所述多糖为黄原胶。

在一些实施方案中，所述抗氧化剂选自维生素C钠、谷胱甘肽、半胱氨酸盐酸盐的至少一种。在一些实施方案中，所述抗氧化剂为维生素C钠(VC钠)。

在一些实施方案中，提供一种冻干保护剂混合液，其含有上述冻干保护剂以及任意量的水，水用于将保护剂成分形成溶液或浆液或混悬液，以进一步与乳杆菌菌泥混合均匀。在一些实施方案中，保护剂与水的重量比为1：1-3，在一些实施方案中为1：1.5-2.5，在一些实施方案中为1：1.5-2.0。

可以理解的是，经过冻干工艺后残留的水量一般低于冻干制品重量的10％，优选低于7％，更优选低于5％，比如0.5-5％、0.5-3％。

本发明还提供了一种乳杆菌冻干制品，其含有前述任一方案所述的冻干保护剂和乳杆菌。

在一些实施方案中，上述乳杆菌冻干制品中含有的乳杆菌选自詹氏乳杆菌和/或卷曲乳杆菌。

在一些实施方案中，乳杆菌菌泥湿重与干的保护剂的重量比为1：0.5-1.5或1：0.8-1.2。

本发明还提供了上述乳杆菌冻干制品的制备方法：包括保护剂混合液的制备和冻干制品的制备步骤。这些步骤可以采用本领域常用的一些方法，例如CN102649945A、CN113005040A、CN104147605A等。本发明的实施例也提供了一些非限制性的实例。例如，保护剂混合液的制备包括先按上述重量份分取二糖、氨基酸/蛋白、抗氧化剂、多糖及纯化水，将二糖、多糖类加入纯化水中搅拌混合均匀，灭菌，得灭菌混合液，再将氨基酸/蛋白、抗氧化剂溶解于灭菌混合液，混合均匀制得乳杆菌冻干保护剂。所述灭菌可以是121℃高压蒸汽灭菌20-30min，或其他灭菌方式。冻干制品的制备步骤包括将乳杆菌菌泥与保护剂混合液混合均匀，再经冷冻干燥制备成乳杆菌冻干粉，所述乳杆菌冻干粉在常温条件下存储3个月、6个月其活菌存活率可达80％以上。

更具体的制备方法包括如下步骤：

S1收集菌泥：将乳杆菌经种子液培养、发酵培养后所得乳杆菌菌液，进行离心，收集菌泥，重悬于无菌PBS，离心，得到乳杆菌菌泥；

S2配置保护剂：配制乳杆菌保护剂混合液；

S3菌泥乳化：将乳杆菌菌泥与保护剂混合液混合均匀，得到乳杆菌菌悬液；

S4冷冻干燥：将乳杆菌菌悬液冷冻干燥、粉碎、过筛，得到乳杆菌冻干粉；所述冷冻干燥，其真空度为12～30Pa，其升华干燥温度为-30℃～-10℃，其解析干燥温度为10～25℃。

在一些实施方案中，所述乳杆菌采用詹氏乳杆菌或卷曲乳杆菌。例如专利CN110656060A中的詹氏乳杆菌CCTCC No.2019429、卷曲乳杆菌CCTCCNo.2019427。

相比于现有技术，本发明的技术方案解决了乳杆菌冻干粉常温放置稳定性差的难题，提高了常温条件下储存乳杆菌冻干粉的活菌存活率，为常温储存、运输乳杆菌冻干粉提供了有利条件，降低储存、运输成本的同时，为更好和更广泛的应用乳杆菌冻干粉提供了新的途径。此外，本发明的一些技术方案还解决了工艺操作中的一些难题，使得放大生产成为可能。

具体实施方法

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述：显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例以詹氏乳杆菌CCTCC No.2019429为例，评估冻干保护剂对乳杆菌冻干制品常温储存稳定性的差异。按如下步骤制备冻干菌粉：

(1)种子液培养

从超低温冰箱中取出保藏的甘油管菌种(詹氏乳杆菌CCTCC No.2019429)，接种至MRS肉汤培养基中(MRS培养基027315广东环凯微生物科技有限公司)，37℃厌氧培养12小时，得种子液。

(2)发酵培养基的配制

葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，大豆蛋白胨15g/L，乙酸钠10g/L，磷酸氢二钾5g/L，吐温80 1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，硫酸锰0.5g/L，硫酸镁0.8g/L。按20L的配制量称量上述组分，溶解于纯化水中，装至30L发酵罐；121℃高压蒸汽灭菌30min，降温；降温阶段通氮气，冷却至37℃。

(3)发酵培养

按2％接种量，将种子液转接发酵罐；设定发酵参数包括：初始发酵pH值为6.5；补加20％的氢氧化钠溶液将pH值恒定在5.0；搅拌转速为100rpm；发酵温度为37℃；发酵不通气，维持罐压力为0.04Mpa。监测发酵过程发酵液的OD值变化趋势，在对数末期停止发酵，将发酵液温度降低至20-25℃，即得詹氏乳杆菌发酵液。

(4)离心

取詹氏乳杆菌发酵液，记录其体积V₁，经7000rpm离心获得浓缩菌泥，将浓缩菌泥重悬于30％V₁体积的无菌PBS缓冲溶液，再次以7000rpm离心，得到詹氏乳杆菌菌泥。

(5)保护剂的配制

按表1中经证明的配方分取各组分，保护剂合计干重为200g，另取纯化水配制混合液。其中保护剂与纯化水的重量比约为1：1-3，或者更适合的为1：1.5-2.5，进一步适合的为1：1.5-2.0。将其中的海藻糖、蔗糖(二糖)、黄原胶(多糖)加入纯化水中搅拌混合均匀，经121℃高压蒸汽灭菌20-30分钟，得到灭菌混合液；保护剂使用前，再将余下组分溶解于灭菌混合液，混合均匀，制得乳杆菌保护剂混合液。

表1乳杆菌冻干保护剂组份表

(6)菌泥乳化

以保护剂的干重总量为200g，按詹氏乳杆菌菌泥湿重与保护剂干重重量比为1：0.5-1.5，更适宜的为1：0.8-1.2分取上述步骤(4)所得詹氏乳杆菌菌泥，将詹氏乳杆菌菌泥加入步骤(5)制得的的乳杆菌保护剂混合液，混合搅拌均匀，得到詹氏乳杆菌菌悬液。

(7)冷冻干燥

将上述詹氏乳杆菌菌悬液装盘，装盘厚度1cm，放入冻干机(Lyo0.5东富龙)内进行冷冻干燥，于-45℃预冻3h，于-30℃进行第一次升华干燥48h，转-10℃进行第二次升华干燥3h，再转10℃进行解析干燥3h，最后再转25℃进行解析干燥6h，干燥阶段维持真空度为0.12mbar，收集冻干物料。

(8)粉碎、分装

将上述冻干物料置于相对湿度30％以下环境中粉碎，过60目筛网，以铝箔袋密封分装，即得詹氏乳杆菌冻干粉。

(9)稳定性考察

将所得詹氏乳杆菌冻干粉，分别置于25±2℃、60±5％RH的稳定性考察箱中，定期取样检测活菌数，分析不同保护剂下詹氏乳杆菌冻干粉的稳定性差异。

检测活菌数方法：取0.5g菌粉溶解于4.5ml PBS溶液中，随后进行10倍梯度稀释，取合适梯度的稀释液100μL于无菌平皿上，倾注45℃的含1.5％琼脂的MRS固体培养基。晾凉后，置于厌氧培养箱内，于37℃培养48小时后，统计菌落数，计算每个样品活菌数。与稳定性考察初始的活菌数对比，计算不同时间的存储活菌存活率，结果如表2所示。

表2冻干菌粉的稳定性考察结果

根据表2结果可以看出，以保护剂干重总量计，含有80-88％的二糖，0.1-1％的多糖，5-10％的氨基酸/蛋白(不包括脱脂乳粉)，和5-10％的抗氧化剂的保护剂，使詹氏乳杆菌在常温存储3个月、6个月的存活率高于70％。

实施例2

本发明研究人员继续优化配方，按表3所示，分取各保护剂成分。除保护剂配方不同外，其余条件基本与实施例1相同，并按相同方法制备詹氏乳杆菌冻干粉。

表3冻干保护剂组份表

按与实施例1同法对所制得的詹氏乳杆菌冻干粉进行稳定性考察，考察结果见表4。

表4冻干菌粉的稳定性考察结果

如表4所示，配方1添加了新的成分L-精氨酸盐酸盐后，詹氏乳杆菌冻干粉常温稳定性有明显的提升，3个月、6个月存储存活率都达到80％以上。但是研究人员发现，L-精氨酸盐酸盐的添加会导致冻干存活率明显下降，大约会降低到40-50％，使初始活菌数处于较低的水平，即对冻干得率有负向影响。

实施例3

本实施例在实施例1、2的稳定性考察结果分析的基础上，继续优化配方。

按表5所示，分取各保护剂成分。除保护剂配方不同外，其余条件基本与实施例1相同，并按相同方法制备詹氏乳杆菌冻干粉。

表5冻干保护剂组份表

按与实施例1同法对所制得的詹氏乳杆菌冻干粉进行稳定性考察，考察结果见表6。

表6冻干菌粉的稳定性考察结果

如表6所示，降低成分L-精氨酸盐酸盐的含量后，詹氏乳杆菌冻干粉3个月、6个月存储存活率为75％以上，而且冻干存活率回升至80％以上。

实施例4

按表7所示，分取各保护剂成分。除保护剂配方不同外，其余条件基本与实施例1相同，并按相同方法制备詹氏乳杆菌冻干粉。

表7冻干保护剂组份表

按与实施例1同法对所制得的詹氏乳杆菌冻干粉进行稳定性考察，考察结果见表8。

表8冻干菌粉的稳定性考察结果

如表8所示，本实施例制得的冻干制品，常温下存储3个月、6个月，其存活率达到80％以上，而且冻干存活率也令人满意。可见，选用含有50-60％的二糖，25-35％的第一氨基酸/蛋白(L-精氨酸盐酸盐)，0.1-1％的多糖，5-10％的第二氨基酸/蛋白，和5-10％的抗氧化剂的保护剂能够有效提高詹氏乳杆菌的常温储存稳定性，使活菌制剂常温存储成为可能。

实施例5

为考察本发明保护剂对其他乳杆菌的冻干保护效果和常温存储效果，设计系列保护剂，保护剂干重中含有50-60％的二糖，25-35％的L-精氨酸盐酸盐，0.1-1％的多糖，5-10％的第二氨基酸/蛋白(不包括脱脂乳粉)，和5-10％的抗氧化剂，采用与实施例1相同的方法制备卷曲乳杆菌冻干粉(CCTCC No.2019427)，并同法进行稳定性考察。考察结果显示常温存储3个月、6个月其存活率高于80％，说明本发明保护剂配方可以用于其他乳杆菌，特别是卷曲乳杆菌的常温保存。下表9是其中一个具体示例，下表10是其考察结果：

表9冻干保护剂组份表

表10冻干菌粉的稳定性考察结果

实施例6工艺放大试验

在小试成功的基础上进行中试放大，以保护剂干重总量为1kg进行生产，中试试验配方包括效果比较好的包括实施例4表7所示的3～7号配方。除保护剂配方不同，和进行公斤级放大外，按照与实施例1相同的方法制备詹氏乳杆菌冻干粉，考察工艺的放大可行性。各组均能够成功冻干，L-精氨酸盐酸盐的添加量不会导致冻干产品的粘盘或/和鼓泡。

本发明组份中的抗氧化剂还可以用谷胱甘肽、半胱氨酸盐酸盐替代维生素C钠，本发明组份中的多糖可以用普鲁兰糖或阿拉伯胶替换黄原胶，本发明组份中第二氨基酸/蛋白还可以选用水解植物蛋白。

由以上实施例可见，以本发明所述保护剂制备所得的乳杆菌冻干粉，其常温储存稳定性良好。基于该乳杆菌冻干粉常温储存稳定性良好的特性，为常温储存、运输乳杆菌冻干粉提供了有利条件，降低储存、运输成本的同时，为更好和更广泛的应用乳杆菌冻干粉提供了新的途径。

以上所述，仅为本发明的较佳具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员，在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种冻干保护剂，其特征在于：以冻干保护剂的干重计，含有50-60％的二糖、25-35％的第一氨基酸/蛋白、0.1-1％的多糖、5-10％的第二氨基酸/蛋白、5-10％的抗氧化剂，所述二糖选自蔗糖、海藻糖的至少一种，所述第一氨基酸/蛋白为L-精氨酸或其盐酸盐，所述多糖选自普鲁兰糖、阿拉伯胶、黄原胶的至少一种，所述第二氨基酸/蛋白为谷氨酸钠、酸水解酪蛋白、水解植物蛋白中的至少一种，所述抗氧化剂选自维生素C钠、谷胱甘肽、半胱氨酸盐酸盐的至少一种。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：所述第二氨基酸/蛋白为酸水解酪蛋白。

3.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：所述第二氨基酸/蛋白为谷氨酸钠。

4.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：所述多糖为黄原胶。

5.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述抗氧化剂为维生素C钠。

6.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述50-60％的二糖包括35-60％的海藻糖和0-20％的蔗糖。

7.一种冻干保护剂混合液，其特征在于：含有权利要求1-6任意一项所述的保护剂以及纯化水，保护剂与纯化水的重量比为1：1-3，所述纯化水用于将保护剂成分形成溶液或浆液或混悬液。

8.一种乳杆菌冻干制品，其特征在于：所述乳杆菌冻干制品含有1-6任意一项所述的冻干保护剂和乳杆菌，乳杆菌菌泥湿重与冻干保护剂的重量比为1：0.5-1.5。

9.根据权利要求8所述的乳杆菌冻干制品，其特征在于：所述乳杆菌与冻干保护剂的重量比为1：0.8-1.2。

10.根据权利要求9所述的乳杆菌冻干制品，其特征在于：所述乳杆菌选自詹氏乳杆菌和/或卷曲乳杆菌。