CN113293101B - 一种乳酸菌的灭活方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体公开一种乳酸菌的灭活方法及应用。所述乳酸菌的灭活方法，包括以下步骤：a、将乳酸菌进行高密度发酵培养，使得到的发酵液中乳酸菌的活菌数达到3.0×109cfu/ml‑1.0×1010cfu/ml；b、将所述发酵液先降温至23℃以下，然后升温至68℃‑72℃保温1.5h‑2.5h，再降温至23℃以下，离心收集菌泥；c、将菌泥与冻干保护剂混合，进行冷冻干燥，得到灭活乳酸菌粉。本发明提供的乳酸菌的灭活方法可以有效降低乳酸菌灭活过程中代谢产物的损失，保证菌体的完整性，进而保证灭活乳酸菌产品中有机酸、维生素、生物肽和低聚糖等活性物质的完整性，保持灭活乳酸菌产品的功效。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种乳酸菌的灭活方法及应用。
背景技术
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌具有调节胃肠道正常菌群和维持微生态平衡的功能，进而可以改善胃肠道功能、提高食物消化率和生物效价、降低血清胆固醇、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长、提高机体免疫力等。随着人们对健康生活的需求也越来越高，乳酸菌制剂在一些食品或者药物领域有着巨大的开发潜力。
在食品或者日用品当中添加活菌制剂，由于有活菌的存在，这些产品中的乳酸菌会生长繁殖和发酵，导致产品口感、气味等改变，甚至变质。灭活的乳酸菌也有一定的功效，如灭活过的乳酸菌也可以粘附在人和动物肠道上皮细胞，形成生物膜，排斥有害微生物；灭活后的乳酸菌可以吸附肠道内的有害物质，防止其经过代谢进入人体，灭活后的乳酸菌产品也含有丰富的有机酸，可以降低肠道pH，起到抑制有害菌生长的作用等。如果产品中加入的是经过灭活的乳酸菌，由于乳酸菌经过灭活，其不会继续生长发酵，则上述现象就可以避免。然而现有的乳酸菌灭活方式有很大的缺点，灭活过程中容易造成乳酸菌细胞的破裂，从而导致乳酸菌制剂产品乳酸菌细胞总数降低，严重影响乳酸菌产品的使用效果。
发明内容
针对现有乳酸菌灭活方法存在的上述问题，本发明提供一种乳酸菌的灭活方法及应用，该方法可以显著降低乳酸菌灭活过程中的细胞破裂数量，有效降低乳酸菌代谢产物的损失，保证酶活乳酸菌产品中有机酸、维生素、生物肽和低聚糖等活性物质的完整性，进而保持产品功效。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种乳酸菌的灭活方法，包括以下步骤：
a、将乳酸菌进行高密度发酵培养，使得到的发酵液中乳酸菌的活菌数达到3×109cfu/ml-1×1010cfu/ml；
b、在搅拌过程中，将所述发酵液先以0.3-0.4℃/min的速率降温至23℃以下，然后以2.5-3.5℃/min的速率升温至68℃-72℃保温1.5h-2.5h，再以0.8℃/min-1℃/min的速率降温至23℃以下，离心收集菌泥；
c、将所述菌泥与冻干保护剂混合，然后进行冷冻干燥，得到灭活乳酸菌粉。
相对于现有技术，本发明提供的乳酸菌的灭活方法可以有效降低乳酸菌灭活过程中代谢产物的损失，保证菌体的完整性，进而保证灭活乳酸菌产品中有机酸、维生素、生物肽和低聚糖等活性物质的完整性，保持灭活乳酸菌产品的功效。本发明提供的灭活方法中通过特定速率的先降温再升温的过程可以使菌体由生长状态进入休眠状态，并使菌体产生一定的抗逆性，使菌体在后续高温保持的时候能够最大限度保证菌体完整度。在68℃-72℃保温结束后再以特定的速率降温的目的可以有效降低菌体在降温过程中出现的受损破裂。同时，本发明提供的灭活方法可以省去大量甘油的加入，有效降低操作成本以及外来菌株污染的可能性。
本发明提供的乳酸菌的灭活方法还具有生产工艺简单、能耗低、无三废、成本低和可规模化生产的特点。
优选的，步骤a中，所述高密度发酵培养的方法为：将所述乳酸菌按照3％-5％的接种体积，接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为35℃-42℃、pH5-6以及不搅拌的条件下进行发酵，直到发酵液中所述乳酸菌的活菌数达到预期值。
优选的，所述液体培养基按质量百分比计，包括葡萄糖1％-3％、酵母浸粉1％-4％、磷酸缓冲盐0.1％-1％、乙酸钠0.1％-1％、硫酸镁0.01％-0.1％、吐温800.05％-0.1％和余量的无菌水。所述磷酸缓冲盐可以选用NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4和KH2PO4中的一种或几种的组合。
优选的，步骤b中，所述发酵液的pH始终保持在4.5-5.5。
优选的，步骤c中，所述菌泥的含水质量为5％-50％。
优选的，步骤c中，所述冻干保护剂按质量百分比计，包括：脱脂奶粉1％-10％、海藻糖5％-15％、蔗糖1％-10％、乳糖1％-10％、麦芽糊精5％-15％、甘露醇0.1％-1％和余量的无菌水，所述菌泥与所述冻干保护剂的质量比为1:1-5。
上述优选的冻干保护剂够在菌体冻干过程中对菌体进行有效保护，防止冰晶的破坏，进一步保证菌体完整性。
优选的，步骤c中，所述冷冻干燥的条件为：预冻温度为-40℃～-50℃；一次升华温度为1～10℃，真空度为0.01mbar～0.05mbar；解析干燥温度为20℃～30℃，真空度为0.001mbar～0.01mbar。
上述优选的冷冻干燥条件可以进一步提高完整菌体的细胞数量，提高灭活产品的功效。
优选的，步骤c中，所述乳酸菌粉的含水质量为2％-8％。
本发明还提供所述乳酸菌的灭活方法制得的灭活乳酸菌粉。
本发明还提供所述灭活乳酸菌粉在食品和保健品中的应用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
鼠李糖乳杆菌LR863灭活方法：
a、按照乳酸菌在发酵罐中进行高密度培养的常规方法(按照3％的接种体积，接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为37℃、pH5.5以及不搅拌的条件下进行发酵)对鼠李糖乳杆菌LR863进行发酵培养，使发酵液中的鼠李糖乳杆菌活菌数达到9×109cfu/ml，得到高密度菌体发酵液；其中，液体培养基按质量百分比计，包括葡萄糖2％、酵母浸粉2％、NaH2PO40.5％、乙酸钠0.5％、硫酸镁0.05％、吐温800.08％和余量的无菌水。
b、在发酵罐中，搅拌条件下将发酵液以0.35℃/min的速率从37℃降至20℃；然后将发酵液以2.5℃/min的速率从20℃升温至70℃，并保持2h；再以1℃/min的速率降至20℃，上述升温和降温过程中通过碳酸钠的加入使发酵液的pH始终保持在4.5-5.5，离心收集菌泥，得到的菌泥中水的质量含量为20％。
c、按照1:2的质量比将菌泥和保护剂(脱脂奶粉5％、海藻糖10％、蔗糖5％、乳糖5％、麦芽糊精10％、甘露醇0.5％和余量的无菌水)混合，进行冷冻干燥，得到含水质量为4.5％灭活乳酸菌粉。
其中，冷冻干燥的条件设置为：预冻温度为-45℃；一次升华温度为5℃，真空度为0.02mbar；解析干燥温度为25℃，真空度为0.005mbar。
对上述灭活乳酸菌粉中的菌体数进行检测，测得其中的活菌数为200cfu/g，失活且细胞完整的菌体数为1.5×1012cfu/g。(检测方法中，使用倾注平板法统计灭活乳酸菌粉中菌体的存活数，使用流式细胞仪统计总菌数和菌体存活率。)
将本实施例得到的灭活乳酸菌粉用于在食品和保健品中，可以显著提高食品和保健品中乳酸菌的功效。
实施例2
鼠李糖乳杆菌LR863灭活方法：
a、按照乳酸菌在发酵罐中进行高密度培养的常规方法(按照4％的接种体积，接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为35℃、pH5以及不搅拌的条件下进行发酵)对鼠李糖乳杆菌LR863进行发酵培养，使发酵液中的鼠李糖乳杆菌活菌数达到3×109cfu/ml，得到高密度菌体发酵液；其中，液体培养基按质量百分比计，包括葡萄糖1％、酵母浸粉1％、NaH2PO40.1％、乙酸钠0.1％、硫酸镁0.01％、吐温800.05％和余量的无菌水。
b、在发酵罐中，搅拌条件下将发酵液以0.3℃/min的速率从35℃降至23℃；然后将发酵液以3℃/min的速率从23℃升温至68℃，并保持2.5h；再以0.8℃/min的速率降至23℃，上述升温和降温过程中通过碳酸钠的加入使发酵液的pH始终保持在4.5-5.5，离心收集菌泥，得到的菌泥中水的质量含量为5％。
c、按照1:1的质量比将菌泥和保护剂(脱脂奶粉1％、海藻糖5％、蔗糖1％、乳糖1％、麦芽糊精5％、甘露醇0.1％和余量的无菌水)混合，进行冷冻干燥，得到含水质量为2％灭活乳酸菌粉。
其中，冷冻干燥的条件设置为：预冻温度为-40℃；一次升华温度为1℃，真空度为0.01mbar；解析干燥温度为20℃，真空度为0.001mbar。
对上述灭活乳酸菌粉中的菌体数进行检测，测得其中的活菌数为240cfu/g，失活且细胞完整的菌体数为1×1012cfu/g。
将本实施例得到的灭活乳酸菌粉用于在食品和保健品中，可以显著提高食品和保健品中乳酸菌的功效。
实施例3
鼠李糖乳杆菌LR863灭活方法：
a、按照乳酸菌在发酵罐中进行高密度培养的常规方法(按照5％的接种体积，接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为42℃、pH6以及不搅拌的条件下进行发酵)对鼠李糖乳杆菌LR863进行发酵培养，使发酵液中的鼠李糖乳杆菌活菌数达到1×1010cfu/ml，得到高密度菌体发酵液；其中，液体培养基按质量百分比计，包括葡萄糖3％、酵母浸粉4％、NaH2PO41％、乙酸钠1％、硫酸镁0.1％、吐温800.1％和余量的无菌水。
b、在发酵罐中，搅拌条件下将发酵液以0.4℃/min的速率从42℃降至18℃；然后将发酵液以3.5℃/min的速率从18℃升温至72℃，并保持1.5h；再以0.9℃/min的速率降至18℃，上述升温和降温过程中通过碳酸钠的加入使发酵液的pH始终保持在4.5-5.5，离心收集菌泥，得到的菌泥中水的质量含量为50％。
c、按照1:5的质量比将菌泥和保护剂(脱脂奶粉10％、海藻糖15％、蔗糖10％、乳糖10％、麦芽糊精15％、甘露醇1％和余量的无菌水)混合，进行冷冻干燥，得到含水质量为8％灭活乳酸菌粉。
其中，冷冻干燥的条件设置为：预冻温度为-50℃；一次升华温度为10℃，真空度为0.05mbar；解析干燥温度为30℃，真空度为0.01mbar。
对上述灭活乳酸菌粉中的菌体数进行检测，测得其中的活菌数为150cfu/g，失活且细胞完整的菌体数为1.3×1012cfu/g。(检测方法中，使用倾注平板法统计灭活乳酸菌粉中菌体的存活数，使用流式细胞仪统计总菌数和菌体存活率。)
将本实施例得到的灭活乳酸菌粉用于在食品和保健品中，可以显著提高食品和保健品中乳酸菌的功效。
实施例4
副干酪乳杆菌YMC1069灭活方法：
a、按照乳酸菌在发酵罐中进行高密度培养的常规方法(按照3％的接种体积，接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为35℃、pH5以及搅拌的条件下进行发酵)对副干酪乳杆菌YMC1069进行发酵培养，使发酵液中的副干酪乳杆菌活菌数达到5×109cfu/ml，得到高密度菌体发酵液；其中，液体培养基按质量百分比计，包括葡萄糖3％、酵母浸粉3％、NaH2PO41％、乙酸钠1％、硫酸镁0.1％、吐温80 0.1％和余量的无菌水。
b、在发酵罐中，搅拌条件下将发酵液以0.4℃/min的速率从35℃降至18℃；然后将发酵液以3.5℃/min的速率从18℃升温至72℃，并保持2h；再以0.9℃/min的速率降至18℃，上述升温和降温过程中通过碳酸钠的加入使发酵液的pH始终保持在4.5-5.5，离心收集菌泥，得到的菌泥中水的质量含量为40％。
c、按照1:2的质量比将菌泥和冻干保护剂(脱脂奶粉10％、海藻糖15％、蔗糖10％、乳糖10％、麦芽糊精15％、甘露醇1％和余量的无菌水)混合，进行冷冻干燥，得到含水质量为5％灭活乳酸菌粉。
其中，冷冻干燥的条件设置为：预冻温度为-50℃；一次升华温度为10℃，真空度为0.05mbar；解析干燥温度为30℃，真空度为0.01mbar。
对上述灭活乳酸菌粉中的菌体数进行检测，测得其中的活菌数为170cfu/g，失活且细胞完整的菌体数为1.1×1012cfu/g。
将本实施例得到的灭活乳酸菌粉用于在食品和保健品中，可以显著提高食品和保健品中乳酸菌的功效。
对比例1
将实施例1中，步骤b修改为：在发酵罐中，搅拌条件下将发酵液从37℃直接以2.5℃/min的速率升温至70℃，并保持2h；再以1℃/min的速率降至20℃，上述升温和降温过程中通过碳酸钠的加入使发酵液的pH始终保持在4.5-5.5，离心收集菌泥，得到的菌泥中水的质量含量为20％。
其它步骤同时实施例1，得到含水质量为4％的灭活乳酸菌粉。
测得其中的活菌数为150cfu/g，失活且细胞完整的菌体数为3.2×1011cfu/g。
对比例2
将实施例1中，步骤b修改为：搅拌条件下将发酵液以0.35℃/min的速率从37℃降至20℃；然后将发酵液以2.5℃/min的速率从20℃升温至70℃，并保持2h，上述降温和升温过程中通过碳酸钠的加入使发酵液的pH始终保持在4.5-5.5；离心收集菌泥，得到的菌泥中水的质量含量为20％。
其它步骤同时实施例1，得到含水质量为3.8％的灭活乳酸菌粉。
测得其中的活菌数为135cfu/g，失活且细胞完整的菌体数为1.5×1011cfu/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种乳酸菌的灭活方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、将乳酸菌进行高密度发酵培养，使得到的发酵液中乳酸菌的活菌数达到3×109cfu/ml-1×1010cfu/ml；所述高密度发酵培养的方法为：将所述乳酸菌按照3%-5%的接种体积，接种到装有液体培养基的发酵罐中，在温度为35℃-42℃、pH5-6以及不搅拌的条件下进行发酵，直到发酵液中所述乳酸菌的活菌数达到预期值；
b、在搅拌过程中，将所述发酵液先以0.3-0.4℃/min的速率降温至23℃以下，然后以2.5-3.5℃/min的速率升温至68℃-72℃保温1.5h-2.5h，再以0.8℃/min-1℃/min的速率降温至23℃以下，离心收集菌泥；所述发酵液的pH始终保持在4.5-5.5；
c、将所述菌泥与冻干保护剂混合，然后进行冷冻干燥，得到灭活乳酸菌粉；所述冻干保护剂按质量百分比计由脱脂奶粉1%-10%、海藻糖5%-15%、蔗糖1%-10%、乳糖1%-10%、麦芽糊精5%-15%、甘露醇0.1%-1%和余量的无菌水组成，所述菌泥与所述冻干保护剂的质量比为1:1-5。
2.如权利要求1所述的乳酸菌的灭活方法，其特征在于：所述液体培养基按质量百分比计，包括葡萄糖1%-3%、酵母浸粉1%-4%、磷酸缓冲盐0.1%-1%、乙酸钠0.1%-1%、硫酸镁0.01%-0.1%、吐温800.05%-0.1%和余量的无菌水。
3.如权利要求1所述的乳酸菌的灭活方法，其特征在于：步骤c中，所述菌泥的含水质量为5%-50%。
4.如权利要求1所述的乳酸菌的灭活方法，其特征在于：步骤c中，所述冷冻干燥的条件为：预冻温度为-40℃~-50℃；一次升华温度为1℃~10℃，真空度为0.01mbar~0.05mbar；解析干燥温度为20℃~30℃，真空度为0.001mbar~0.01mbar。
5.如权利要求1所述的乳酸菌的灭活方法，其特征在于：步骤c中，所述乳酸菌粉的含水质量为2%-8%。
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