CN111154689A - 一种提高益生菌耐热存活率的方法 - Google Patents

一种提高益生菌耐热存活率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高益生菌存活率的方法，该方法包括菌株活化、热激处理与修复培养处理等步骤。本发明的方法操作简单，条件温和，益生菌株通过修复处理后其耐热性明显提高，原益生菌的热致死存活率是5％～10％；热激处理益生菌的热致死存活率是20％～35％；修复培养益生菌的热致死存活率是60％～80％，本发明解决传统干燥方法存在的菌株因高温致死的弊端，因此可以广泛应用于食品、生物技术等技术领域的菌株前处理。

Description

一种提高益生菌耐热存活率的方法
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种提高益生菌耐热存活率的方法。
【背景技术】
世界卫生组织(WHO)和粮农组织(FAO)联合将益生菌定义为“当其被摄入充足数量时，能够赋予机体某种健康益处的活微生物”。益生菌具有多种生理功能，其中包括改善人体肠道功能、抑制有害菌生长、减少肠道疾病、缓解乳糖不耐症、促进糖类、蛋白质及钙、镁等营养物质的吸收、降胆固醇、调节免疫系统、抗肿瘤、预防癌症等。若想使益生菌充分发挥其有益作用必须满足两个条件：1)在被人体摄入时必须保持一定活性；2)必须有足够数量的益生菌定植于肠道中，通常认为每g或ml产品不低于107CFU。实际情况是在生产、贮运以及消化过程中，益生菌容易受到所处不利环境(温度、O2、pH值、过氧化物)和宿主消化系统(胃酸、胆盐、各种酶)的影响，导致益生菌存活率大幅下降，无法实现良好的益生效果。
喷雾干燥技术因生产效率高且成本较低而被应用于制备益生菌菌粉，但与真空冷冻干燥相比，其对益生菌造成的损伤较严重，主要表现为高温与脱水胁迫导致的益生菌发酵活力下降，及其在后期贮藏过程中菌体细胞稳定性较差等问题。针对上述问题，大量研究者已从提高菌株自身抗性及干燥保护介质两方面做了大量研究。保护介质方面的研究比较成熟，保护效果已经得到初步验证。所以，近年来国内外研究者把研究重点放在提高菌株自身抗性上，已有研究证实：热激处理能提高益生菌菌株的耐热存活率(Dijkstra A R,Alkema W,Starrenburg M J,et al.Fermentation-induced variation in heat andoxidative stress phenotypes ofLactococcus lactisMG1363 reveals transcriptomesignatures for robustness[J].Microbial Cell Factories,2014,13(1):148.)。研究者也做了相关机制分析，认为热激处理会促使细胞产生热应激反应，产生的热休克蛋白及分子伴侣蛋白协同来调节菌株亚细胞结构的稳定性(Magyar C,Gromiha M M,Sávoly,Zoltán,et al.The role of stabilization centers in protein thermal stability[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2016:S0006291X16301826.)。但是热激处理时间较短，产生的热激蛋白在热致死处理时(喷雾干燥过程中)极易变性失活，不能充分发挥修复细胞结构及重新合成细胞组分的功能，也不能将细胞中已变性的蛋白质进行折叠、重组及降解。也有研究证实，喷雾干燥造成的高温环境，极易导致益生菌细胞中部分蛋白质变性，这些蛋白质不仅失去生理活性，且在后期贮藏过程中，长期存在于细胞中会对益生菌细胞产生毒害作用。但是，由于益生菌细胞具有一定的自我修复能力，部分应激蛋白能将细胞中失活的蛋白进行修复、折叠及降解，使细胞重新恢复活性(Angelis M D,Gobbetti M.Environmental stress responses inLactobacillus:Areview[J].PROTEOMICS,2004,4(1):106-122.)。所以热激处理后给予益生菌一定的自我修复时间来提高应激蛋白基因的表达量，在贮藏过程中也能更好的发挥其修复作用的研究是非常有意义的。然而，关于热激后益生菌修复培养的最佳条件还鲜有报道。
为此，针对这一问题，本发明人经过大量实验研究与分析总结，确定了修复培养的最佳条件，达到了提高菌株耐热性的目的。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种提高益生菌耐热存活率的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种提高益生菌耐热存活率的方法。
该方法的步骤如下：
A、菌株活化
按照以MRS液体培养基体积计1～3％接种量，将选定的益生菌株接种到MRS液体培养基中，然后置于在恒温培养箱中，在温度37℃的条件下活化培养16～24h，按照相同的方式活化培养三代，得到一种活菌数为109CFU/ml以上的浓缩菌液，并采用MRS琼脂培养基法检测其有效活菌数；
B、热激处理
让步骤A得到的浓缩菌液在MRS液体培养基中在温度42～47℃的条件下热激处理10～15min，然后置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s，取样，采用平板计数法检测其活菌数；接着让热激处理菌液在温度75～80℃的条件下模拟热致死处理10-30s，再置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s；与此同时，让步骤A得到的浓缩菌液直接在同样的条件下进行模拟热致死处理；
采用MRS琼脂培养基法准确检测它们的有效益生菌活菌数，由此计算热激处理益生菌的存活率；
C、修复培养处理
将步骤B得到的菌液置于水浴锅中，在温度28、30、32、34与36℃的条件下分别恒温修复培养10min，接着迅速置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测它们的活菌数，确定最佳修复培养温度；然后在温度75～80℃的条件下模拟热致死处理10-30s，再置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s，取样，采用平板计数法检测活菌数；
将步骤B得到的菌液置于最佳修复培养温度的水浴锅中分别恒温培养0、5、10、15、20、25及30min，取样，采用平板计数法检测活菌数，确定最佳修复培养时间；
与此同时，在热激处理后未经修复培养处理就直接进行热致死处理的菌液按照与前面描述的相同方式进行，对比分析确定最优恢复培养条件。
根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，所述的益生菌株是植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG或植物乳杆菌P8。
根据本发明的另一种优选实施方式，MRS液体培养基是按照下述制备方法制备得到的：将10g蛋白胨、5g酵母提取粉、10g牛肉膏、2g柠檬酸钠、1ml吐温80、5g乙酸钠、2g磷酸氢二钾、0.2g硫酸镁、0.054g硫酸锰与20g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，得到的溶液使用无机酸或无机碱溶液调节至pH值6.2～6.6，接着在温度121℃下灭菌15min，得到所述的MRS液体培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，MRS固体培养基是按照每1000ml MRS液体培养基添加10g琼脂得到的培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸溶液是浓度为0.5～2.0N盐酸、硫酸、磷酸或硝酸水溶液。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机碱溶液是浓度为0.8～3.0N氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠水溶液。
根据本发明的另一种优选实施方式，最优修复培养条件是在温度30～37℃的条件下修复培养10～20min。
根据本发明的另一种优选实施方式，原益生菌的热致死存活率是5％-10％；热激处理益生菌的热致死存活率是20％-35％；修复培养益生菌的热致死存活率是60％-80％。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种提高益生菌耐热存活率的方法。
本发明提高益生菌耐热存活率方法是一种在热激处理后接着修复培养提高益生菌耐热稳定性的方法。根据本发明，修复培养不仅促使热应激反应充分发挥后续作用，而且给益生菌的亚细胞结构留有一定的自我修复时间，增强了细胞各组分的耐热稳定性。
该方法的步骤如下：
A、菌株活化
按照以MRS液体培养基体积计1～3％接种量，将选定的益生菌株接种到MRS液体培养基中，然后置于在恒温培养箱中，在温度37℃的条件下活化培养16～24h，按照相同的方式活化培养三代，得到一种活菌数为109CFU/ml以上的浓缩菌液，并采用MRS琼脂培养基法检测其有效活菌数；
在本发明方法中，益生菌株活化步骤的主要目的是将-80℃下保藏的菌种接入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够(109CFU/ml)的培养物。
在本发明中，所述的益生菌是一类当机体摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体，即当其被摄入充足数量时，能够赋予机体某种健康益处的活微生物。
根据本发明，所述的益生菌株是植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG或植物乳杆菌P8。
植物乳杆菌(L.plantarum)LIP-1保藏单位LABCC(内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库)、保藏号IMAU30118是一株从新疆地区酸马奶样品中分离的乳杆菌，经体外实验证实该菌具有较好的耐酸性和胆盐耐受性以及较强的降胆固醇活性。利用16SrDNA序列同源性分析对该菌进行鉴定，植物乳杆菌在Genbank/EMBL/DDBJ上的序列注册号是EU213062。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ZHANG保藏单位LABCC、保藏号IMAU10048是从酸马奶中分离得到的耐酸耐胆汁酸的益生菌；干酪乳杆菌ZHANG作为一种益生菌具有优良的益生特性，具有良好的耐酸性、人工肠胃液耐受性及胆盐耐受性，对免疫系统具有显著的调节功能等。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P8保藏单位LABCC、保藏号IMAU10120是2005年从内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗牧民家庭自然发酵酸牛奶中分离的102株植物乳杆菌中筛选出的一株益生性能优异的乳杆菌。它具有免疫调节特性，并已被用于发酵剂和乳制品的工业化生产，及在医学上作为活疫苗提供更广泛的治疗。
当然，除了本申请说明书列举的益生菌之外，本发明方法也可以应用于现有的其它益生菌，只是它们经本发明方法处理后不会对这些益生菌及其应用产生不利影响，这些益生菌也都在本发明保护范围之内。
根据本发明，MRS液体培养基是按照下述制备方法制备得到的：将10g蛋白胨、5g酵母提取粉、10g牛肉膏、2g柠檬酸钠、1ml吐温80、5g乙酸钠、2g磷酸氢二钾、0.2g硫酸镁、0.054g硫酸锰与20g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，得到的溶液使用无机酸或无机碱溶液调节至pH值6.2～6.6，接着在温度121℃下灭菌15min，得到所述的MRS液体培养基。
本发明制备MRS液体培养基所使用的蛋白胨等原料都是目前市场上销售的产品。
根据本发明，所述的无机酸溶液是浓度为0.5～2.0N盐酸、硫酸、磷酸或硝酸水溶液。所述的无机碱溶液是浓度为0.8～3.0N氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠水溶液。
在本发明中，制备MRS液体培养基所使用的灭菌设备是现有实验室通常使用的、在目前市场上销售的产品。
本发明使用的恒温培养箱是本技术领域通常使用的、在目前市场上销售的产品，例如由SANYO公司生产的CO2恒温培养箱。本发明在离心分离时使用的离心设备是本技术领域通常使用的、在目前市场上销售的产品，例如由Eppendorf公司生产的5810R离心机。
得到浓缩菌液的活菌数是采用MRS琼脂培养基法检测的。
MRS琼脂培养基法具体操作如下：
按照浓缩菌液与灭菌生理盐水的重量比1：6～10，用灭菌生理盐水稀释的浓缩菌液与MRS固体培养基按照体积比1：20～25混匀，然后在温度37℃下培养36～48h，采用平板计数法检测得到所述浓缩菌液的活菌数为(5～8)×109CFU/ml。
其中，生理盐水是生物技术领域里通常使用的、浓度为以重量计0.80～0.85％的盐水。本发明使用的灭菌生理盐水是在高压蒸汽灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min，并将微生物含量控制在102CFU/ml以下的生理盐水。
浓缩菌液与灭菌生理盐水的重量比是1：6～10，如果浓缩菌液与灭菌生理盐水的重量比大于1：6，则得到的菌液浓度过高；如果浓缩菌液与灭菌生理盐水的重量比小于1：10，则得到的菌液浓度过低；因此，浓缩菌液与无菌生理盐水的重量比为1：6～10是恰当的；优选地是1：7～9。
MRS固体培养基是按照每1000ml MRS液体培养基添加10g琼脂得到的培养基。
平板计数法的具体操作参见文献：张江涛、刘敏、魏滨美，“探讨平板接种法在牙科综合治疗台水路菌落总数监测中的应用”，《全科口腔医学电子杂志》,2016(04):113～116。
在本发明中，将该浓缩菌液的菌密度控制在(5～8)×109CFU/ml这个范围内的主要目的在于提高模拟喷雾干燥热致死处理后的活菌数。
B、热激处理
让步骤A得到的浓缩菌液在MRS液体培养基中在温度42～47℃的条件下热激处理10～15min，然后置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s，取样，采用平板计数法检测其活菌数；接着让热激处理菌液在温度75～80℃的条件下模拟热致死处理10-30s，再置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s；与此同时，让步骤A得到的浓缩菌液直接在同样的条件下进行模拟热致死处理；
采用MRS琼脂培养基法准确检测它们的有效益生菌活菌数，由此计算热激处理益生菌的存活率。
在本发明的方法中，热激处理的主要作用在于激发细胞自身的热休克反应，为修复培养做准备。在热激处理后冷却处理的主要目的是及时降低菌株活性以及高温对菌株造成的持续损伤，以保证活菌计数结果的可靠性。
热激处理的时间为10～15min时，如果热激处理的温度低于42℃，则益生菌的耐热性较不进行热激处理的菌株没有显著提高；如果热激处理的温度高于47℃，则热激处理后菌量大幅降低，且模拟热致死后菌株的耐热性较在较适热激条件下没有明显变化；因此，热激处理的温度为42～47℃是合适的。
热激处理的温度为42～47℃时，如果热激处理的时间低于10min，则热激处理效果不明显；如果热激处理的时间长于15min，则菌株细胞在长期较高温度下极易发生热损伤，导致菌量下降，后期在模拟热致死处理的过程中，因细胞受到的损伤而降低其耐热性；因此，热激处理的时间为10～15min是合理的。
在本发明的方法中，模拟热致死处理的主要目的是为了模拟喷雾干燥条件，即出口温度75-80℃，时间10-30s，评价经过热激处理及修复培养的菌株的耐热性；在模拟热致死处理后冷却处理的主要目的是及时降低菌液的温度，防止持续高温对菌株造成进一步的损伤；
热致死处理的时间为10～30s时，如果热致死处理的温度低于75℃，则低于喷雾干燥的最低出口温度；如果热致死处理的温度高于80℃，则高于喷雾干燥的最高出口温度；因此，热致死处理的温度为75～80℃是恰当的。
热致死处理的温度为75～80℃时，如果热致死处理的时间低于10s，则不足以模拟喷雾干燥的喷雾及塔内停留时间；如果热致死处理的时间长于30s，则大于实际喷雾干燥所用的最长时间；因此，热致死处理的时间为10～30是可取的。
采用MRS琼脂培养基法准确检测它们的有效益生菌活菌数，根据下式计算热激处理益生菌的存活率；
热激存活率(％)＝(A1/B1)×100％ (1)
式中：
A1：热激后的活菌数；
B1：热激前的活菌数；
C、修复培养处理
将步骤B得到的菌液置于水浴锅中，在温度28、30、32、34与36℃的条件下分别恒温培养10min，接着迅速置于温度为10℃的水中冷却30s，取样，采用平板计数法计算它们的活菌数，确定最佳修复培养温度；然后在温度75～80℃的条件下模拟热致死处理10-30s，再置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s，取样，采用平板计数法计算活菌数；
将步骤B得到的菌液置于最佳修复培养温度的水浴锅中分别恒温培养0、5、10、15、20、25及30min，取样，采用平板计数法计算活菌数，确定最佳修复培养时间；
与此同时，在热激处理后未经修复培养处理就直接进行热致死处理的菌液按照与前面描述的相同方式进行，对比分析确定最优恢复培养条件是在温度30～37℃的条件下修复培养10～20min。
根据本发明，最优修复培养条件是在温度30～37℃的条件下修复培养10～20min。
本发明选定益生菌的热致死存活率是根据下式计算得到的：
修复培养后热致死存活率(％)＝(C1/D1)×100％ (2)
式中：
C1：修复培养后菌株模拟热致死处理后的活菌数；
D1：修复培养后菌株模拟热致死处理前的活菌数；
根据前面描述方法与上述公式，对选定的原益生菌、热激处理的益生菌与热致死后修复培养的益生菌进行了热致死存活率测定，其结果表明，原益生菌的热致死存活率为5％～10％；热激处理益生菌的热致死存活率为20％～35％；修复培养益生菌的热致死存活率为60％～80％，这些结果充分说明修复培养处理能够提高益生菌存活率达到30％～50％，因此，本发明的方法解决了传统干燥方法存在的菌株因高温致死的弊端。
[有益效果]
本发明的有益效果是：
本发明的方法操作简单，条件温和，成本较低，益生菌株通过修复处理后其耐热性明显提高，因此能够提高喷雾干燥过程中益生菌存活率，解决传统干燥方法存在的菌株因高温致死的弊端。本发明提高益生菌耐热存活率方法有望广泛应用于食品、生物技术等多个技术领域的菌株前处理过程中。
【附图说明】
图1是益生菌菌株耐热存活率随修复培养温度的变化图；
图2是益生菌菌株耐热存活率随修复培养时间的变化图；
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明提高益生菌存活率的方法
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化
按照以MRS液体培养基体积计1％接种量，将由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的益生菌植物乳杆菌LIP-1接种于MRS液体培养基中，然后置于培养箱中，在温度37℃的条件下培养21h，按照相同的方式活化培养三代，得到的浓缩菌液采用MRS琼脂培养基法检测其活菌数为5.24×109CFU/ml；
B、热激处理
将步骤A得到的浓缩菌液在MRS液体培养基中在温度44℃的条件下热激处理10min，然后置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测其活菌数；接着让热激处理菌液在温度75℃的条件下模拟热致死处理30s，再置于温度10℃的水浴中冷却30s，与此同时，让步骤A得到的浓缩菌液直接在同样的条件下进行模拟热致死处理；
采用MRS琼脂培养基法准确检测它们的有效益生菌活菌数，由此计算热激处理益生菌的存活率91.67％；
C、修复培养处理
将步骤B得到的菌液分别置于水浴锅中，在温度28、30、32、34与36℃的条件下分别恒温修复培养10min，接着迅速置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测它们的活菌数，确定最佳修复培养温度30℃，其结果参见附图1；然后在温度75℃的条件下模拟热致死处理30s，再置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测活菌数；
将步骤B得到的菌液置于最佳修复培养温度的水浴锅中分别恒温培养0、5、10、15、20、25及30min，取样，采用平板计数法检测活菌数，确定最佳修复培养时间10min，其结果参见附图2；
与此同时，在热激处理后未经修复培养处理就直接进行热致死处理的菌液按照与前面描述的相同方式进行，对比分析确定最优修复培养条件是在温度30℃的条件下修复培养10min。
采用本说明书描述的检测方法检测确定，该实施例制备的耐热性益生菌活菌数为3.43×109CFU/ml。
该实施例的植物乳杆菌LIP-1原菌的热致死存活率是8％；热激处理益生菌的热致死存活率是25％；修复培养益生菌的热致死存活率是72.50％。
实施例2：本发明提高益生菌存活率的方法
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化
按照以MRS液体培养基体积计1％接种量，将由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的益生菌干酪乳杆菌ZHANG接种于MRS液体培养基中，然后置于培养箱中，在温度37℃的条件下培养16h，按照相同的方式活化培养三代，得到的浓缩菌液采用MRS琼脂培养基法检测其活菌数为5×109CFU/ml；
B、热激处理
将步骤A得到的浓缩菌液在MRS液体培养基中在温度42℃的条件下热激处理10min，然后置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测其活菌数；接着让热激处理菌液在温度75℃的条件下模拟热致死处理10s，再置于温度10℃的水浴中冷却30s，与此同时，让步骤A得到的浓缩菌液直接在同样的条件下进行模拟热致死处理；
采用MRS琼脂培养基法准确检测它们的有效益生菌活菌数，由此计算热激处理益生菌的存活率83％；
C、修复培养处理
将步骤B得到的菌液分别置于水浴锅中，在温度28、30、32、34与36℃的条件下分别恒温修复培养10min，接着迅速置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测它们的活菌数，确定最佳修复培养温度36℃；然后在温度75℃的条件下模拟热致死处理10s，再置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测活菌数；
将步骤B得到的菌液置于最佳修复培养温度的水浴锅中分别恒温培养0、5、10、15、20、25及30min，取样，采用平板计数法检测活菌数，确定最佳修复培养时间20min；
与此同时，在热激处理后未经修复培养处理就直接进行热致死处理的菌液按照与前面描述的相同方式进行，对比分析确定最优修复培养条件是在温度36℃的条件下修复培养20min。
采用本说明书描述的检测方法检测确定，该实施例制备的耐热性益生菌活菌数为2.15×109CFU/ml。
该实施例的干酪乳杆菌ZHANG原菌的热致死存活率是5％；热激处理益生菌的热致死存活率是20％；修复培养益生菌的热致死存活率是61.35％。
实施例3：本发明提高益生菌存活率的方法
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化
按照以MRS液体培养基体积计3％接种量，将由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库保藏的益生菌植物乳杆菌P8接种于MRS液体培养基中，然后置于培养箱中，在温度37℃的条件下培养24h，按照相同的方式活化培养三代，得到的浓缩菌液采用MRS琼脂培养基法检测其活菌数为8×109CFU/ml；
B、热激处理
将步骤A得到的浓缩菌液在MRS液体培养基中在温度47℃的条件下热激处理15min，然后置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测其活菌数；接着让热激处理菌液在温度80℃的条件下模拟热致死处理10s，再置于温度10℃的水浴中冷却30s，与此同时，让步骤A得到的浓缩菌液直接在同样的条件下进行模拟热致死处理；
采用MRS琼脂培养基法准确检测它们的有效益生菌活菌数，由此计算热激处理益生菌的存活率92％；
C、修复培养处理
将步骤B得到的菌液分别置于水浴锅中，在温度28、30、32、34与36℃的条件下分别恒温修复培养10min，接着迅速置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测它们的活菌数，确定最佳修复培养温度30℃；然后在温度80℃的条件下模拟热致死处理10s，再置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测活菌数；
将步骤B得到的菌液置于最佳修复培养温度的水浴锅中分别恒温培养0、5、10、15、20、25及30min，取样，采用平板计数法检测活菌数，确定最佳修复培养时间20min；
与此同时，在热激处理后未经修复培养处理就直接进行热致死处理的菌液按照与前面描述的相同方式进行，对比分析确定最优修复培养条件是在温度30℃的条件下修复培养10min。
采用本说明书描述的检测方法检测确定，该实施例制备的耐热性益生菌活菌数为5.45×109CFU/ml。
该实施例的植物乳杆菌P8原菌的热致死存活率是10％；热激处理益生菌的热致死存活率是35％；修复培养益生菌的热致死存活率是79.82％。

Claims (8)

1.一种提高益生菌耐热存活率的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、菌株活化
按照以MRS液体培养基体积计1～3％接种量，将选定的益生菌株接种到MRS液体培养基中，然后置于在恒温培养箱中，在温度37℃的条件下活化培养16～24h，按照相同的方式活化培养三代，得到一种活菌数为109CFU/ml以上的浓缩菌液，并采用MRS琼脂培养基法检测其有效活菌数；
B、热激处理
让步骤A得到的浓缩菌液在MRS液体培养基中在温度42～47℃的条件下热激处理10～15min，然后置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s，取样，采用平板计数法检测其活菌数；接着让热激处理菌液在温度75～80℃的条件下模拟热致死处理10-30s，再置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s；与此同时，让步骤A得到的浓缩菌液直接在同样的条件下进行模拟热致死处理；
采用MRS琼脂培养基法准确检测它们的有效益生菌活菌数，由此计算热激处理益生菌的存活率；
C、修复培养处理
将步骤B得到的菌液置于水浴锅中，在温度28、30、32、34与36℃的条件下分别恒温修复培养10min，接着迅速置于温度为10℃的水浴中冷却30s，取样，采用平板计数法检测它们的活菌数，确定最佳修复培养温度；然后在温度75～80℃的条件下模拟热致死处理10-30s，再置于温度为10℃的水浴中冷却10～30s，取样，采用平板计数法检测活菌数；
将步骤B得到的菌液置于最佳修复培养温度的水浴锅中分别恒温培养0、5、10、15、20、25及30min，取样，采用平板计数法检测活菌数，确定最佳修复培养时间；
与此同时，在热激处理后未经修复培养处理就直接进行热致死处理的菌液按照与前面描述的相同方式进行，对比分析确定最优恢复培养条件。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A中，所述的益生菌株是植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG或植物乳杆菌P8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于MRS液体培养基是按照下述制备方法制备得到的：将10g蛋白胨、5g酵母提取粉、10g牛肉膏、2g柠檬酸钠、1ml吐温80、5g乙酸钠、2g磷酸氢二钾、0.2g硫酸镁、0.054g硫酸锰与20g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，得到的溶液使用无机酸或无机碱溶液调节至pH值6.2～6.6，接着在温度121℃下灭菌15min，得到所述的MRS液体培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于MRS固体培养基是按照每1000mlMRS液体培养基添加10g琼脂得到的培养基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的无机酸溶液是浓度为0.5～2.0N盐酸、硫酸、磷酸、盐酸或硝酸水溶液。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的无机碱溶液是浓度为0.8～3.0N氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠或碳酸氢钠水溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于最优修复培养条件是在温度30～37℃的条件下修复培养10～20min。
8.根据权利要求所述的方法，其特征在于原益生菌的热致死存活率是5％～10％；热激处理益生菌的热致死存活率是20％～35％；修复培养益生菌的热致死存活率是60％～80％。
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