CN105316261A - 一种提高乳酸菌制剂热稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，采用鱼溶浆为营养源，乳酸菌发酵过程中采用程序性变温控制，其方法是：在乳酸菌发酵周期中，至少采用2次升温热激发酵处理，两次升温热激发酵的时间间隔为2～5hr，且每次热激处理时间为10～30min，热激发酵温度比正常发酵温度高3～10℃，发酵结束收获菌体干燥处理；所述正常发酵温度为35～42℃。本发明方法可以大幅度提高乳酸菌干燥粉剂的热稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸菌，特别是涉及一种提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，主要用于乳酸菌粉剂制品延长货架期。
背景技术
乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。
乳酸菌制剂的生产，通常是采用冷冻干燥法制得冻干粉，也有少数耐热菌株可以采用喷雾干燥法生产。对于大多数乳酸菌制剂，都对高温敏感，即使常温保存，也存在快速失活的问题。乳酸菌制剂的常温难保存的问题对乳酸菌在食品和饲料中的添加、流通等带来了很大限制，制约了乳酸菌的广泛应用。为解决乳酸菌的稳定保存问题，人们开发了一系列保护剂。冻干保护剂就是一种非常常用的乳酸菌保护物质，其一般是由奶粉、海藻糖、多元醇等物质复合而成，其一方面可以减少乳酸菌在冻干过程中的损失，另一方面，可以提高乳酸菌的热稳定性。
热激处理是提高菌体稳定性的另一类重要方法，热激处理是在乳酸菌发酵过程中突然升温保持一段时间，从而提高了微生物的热稳定性。一般认为，此情况下，微生物的热稳定性的提高和热激蛋白的产生有关。热激蛋白(HeatShockProtein，HSP)是在高低温、激素、高盐、干旱、缺氧及机械损伤等多种环境胁迫下生物体内正常蛋白收到抑制而诱导合成的新的或功能增强的应激蛋白，又被称为热休克蛋白。热激蛋白最早是在1962年，由Riotossa在果蝇上发现，至今，已经在几乎所有的动植物、微生物体内发现热激蛋白的合成。采用热激方法也是微生物制剂生产中一种常用的提高菌体热稳定性的方法。尽管已经开发了一系列提高乳酸菌热稳定性的方法，但乳酸菌制剂的热稳定性仍有待进一步提高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明旨在开发一种新型提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，显著提高乳酸菌制剂的热稳定性。
发明人课题组研究发现，发酵工艺的改变对于乳酸菌制剂冻干存活率、冻干粉稳定性等均具有重要影响，包括发酵培养基、培养温度、发酵周期等参数是重要影响因素，其中，发酵温度是影响最为显著的因素，且发现，发酵温度和培养基组成间存在交互作用关系。采用合适的发酵培养基和发酵条件，可以显著提高乳酸菌制剂的热稳定性。鱼抽提物为是鱼粉生产时所副产的鱼汤经油脂分离和浓缩而得到的产物。鱼抽提物是采用鱼体生产的一种复合营养物，其一般的生产方法是将蒸煮后的鱼挤压获得富含可溶性组分的液体，然后浓缩标准化所得到的一种产物。
本发明在利用鱼溶浆作为培养基研究乳酸菌制剂稳定性时，意外地发现采用鱼溶浆作为乳酸菌的营养源，并且采用至少2次升温热激的发酵工艺，可以获得更高稳定性的乳酸菌制剂。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，采用鱼溶浆为营养源，乳酸菌发酵过程中采用程序性变温控制，其方法是：在乳酸菌发酵周期中，至少采用2次升温热激发酵处理，两次升温热激发酵的时间间隔为2～5hr，且每次热激处理时间为10～30min，热激发酵温度比正常发酵温度高3～10℃，发酵结束收获菌体干燥处理；所述正常发酵温度为35～42℃。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述程序性变温控制的具体过程为：先采用正常发酵温度发酵6～15h，然后进行第一次热激发酵处理，再降温至正常发酵温度发酵1-3h，之后进行第二次热激发酵处理，再次降温至正常发酵温度发酵8～15h。
优选地，所述热激发酵温度为比正常发酵温度高5～8℃。
优选地，采取3次以上热激发酵处理。先采用正常发酵温度发酵6～10h，然后进行第一次热激发酵处理，再降温至正常发酵温度发酵1-3h，之后进行第二次热激发酵处理，再次降温至正常发酵温度发酵6～10h，之后进行第三次热激发酵处理，再次降温至正常发酵温度发酵6～10h。
优选地，所述乳酸菌包括：短乳杆菌(Lactobacillus.breris)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus.helveticus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus.curvatus)、德式乳杆菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus.fermentum)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus.casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)、乳脂链球菌(streptococcus.cremoris)，二丁酮链球菌(Streptococcus.diacetylactis)、粪链球菌(Streptococcus.faecium)、乳酸乳球菌(Lactococcus.lactis)、嗜热链球菌((Streptococcus.thermophilus))、乳酸片球菌(Pediococcus.acidilactici)、啤酒片球菌(Pediococcus.cerecisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus.pentosaceus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)中的一种或两种以上的混合物。
优选地，所述干燥处理为冷冻干燥或喷雾干燥。
优选地，所述冷冻干燥是加入冻干保护剂，冷冻干燥得到菌粉。
优选地，以质量份数计，所述鱼溶浆为营养源的培养基配方组成为：鱼溶浆15‐25份、柠檬酸氢二铵1.5‐2.5份、葡萄糖15‐25份、乙酸钠4‐6份，磷酸氢二钾1.5‐2.5份，硫酸镁0.5‐1.份，硫酸锰0.2‐0.3份，吐温801‐2份，蒸馏水适量；控制pH值为6‐6.8。
通常乳酸菌是发酵培养基一般应包含乳制品、酵母膏、蛋白胨等营养物。而本发明中特别限定采用鱼溶浆为营养源。鱼溶浆是鱼粉生产的副产物，现已标准化生产。其生产工艺流程如下：鱼粉生产工艺的第一步是鱼的蒸煮，经过蒸煮鱼肉变硬，为下一步操作打下基础；第二是压榨，压榨是将鱼肉和鱼汤分开，鱼汤分离去除油脂经过浓缩，即可得到鱼溶浆。鱼溶浆含有丰富的营养，包括核苷酸、牛磺酸、氨基酸和多肽等，对微生物的生长具有促进作用。通常，鱼溶浆被浓缩至40％左右的水分含量，被用作饲料原料，用法和鱼粉类似，但目前尚未见采用鱼溶浆作为发酵培养基的报道。
对于鱼溶浆提高乳酸菌热稳定性的机理，目前尚未有明确的答案。一种可能的解释是乳酸菌生长一般对营养要求较高，而鱼溶浆中丰富的营养物质，可以更好地帮助乳酸菌适应各种不利的环境。目前，关于营养源对于乳酸菌适应力的报道还不多见。关于鱼溶浆提高乳酸菌热稳定性的另一个机理可能和鱼溶浆中的多肽有关，分析表明，鱼溶浆的中分子量小于500的多肽高达蛋白的30％以上，多肽可以为乳酸菌营造一个良好的保护环境，提高乳酸菌的抗逆性。
关于乳酸菌的热激方法，一般的处理是一次热激，热激时间通常为30min左右，发明人发现，多次热激具有更好的效果，优选地，采取3次以上热激。每次热激处理时间为5～30min，热激温度为比正常发酵温度高3～8℃。发酵结束，需要收集菌体进行干燥处理，乳酸菌通常采用冻干的方式进行粉剂生产，但不局限于冻干，亦可以采用喷雾干燥的方式的生产。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
采用本发明技术，和传统技术相比，可以显著提高乳酸菌干粉制剂的热稳定性，尤其是解决乳酸菌制剂在非冷链物流时的稳定性问题，使得乳酸菌具有更长货架期，对于产品的应用推广具有重要意义。另外，采用鱼溶浆作为乳酸菌的发酵培养基，实现了废物利用，具有成本低廉的优点。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但是本发明的实施方式不限如此。
培养基1配方(MRS培养基)：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.5。
培养基2配方：鱼溶浆20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.5。
冻干保护剂：以质量百分比计，冻干保护剂的组成为：脱脂奶粉90％，海藻糖8％，甘氨酸2％。
本发明对比例和实施例中涉及的各菌种均为市售通用产品或保藏菌株，购买获得。
对比例1
5L发酵罐，加入3.5L培养基1，接种植物乳杆菌(LactobacillusplantarumATCC8014)，于37℃发酵24hr后离心收获菌体，按照菌泥的2倍加入冻干保护，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉1。
对比例2
5L发酵罐，加入3.5L培养基2，接种植物乳杆菌(LactobacillusplantarumW‐9)，于37℃发酵24hr后离心收获菌体，按照菌泥的2倍加入冻干保护，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉2。
对比例3
5L发酵罐，加入3.5L培养基1，接种植物乳杆菌(LactobacillusplantarumW‐9)，于37℃发酵12hr后，升温至42℃热激发酵30min，然后恢复37℃发酵2小时，再升温至47℃热激发酵10min，然后恢复37℃发酵，直至完成24hr发酵周期，离心收获菌体，按照菌泥的2倍加入冻干保护剂，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉3。
实施例1
5L发酵罐，加入3.5L培养基2，接种植物乳杆菌(LactobacillusplantarumW‐9)，于37℃发酵12hr后，升温至42℃热激发酵30min，然后恢复37℃发酵5小时，再升温至47℃热激发酵10min，然后恢复至37℃发酵，直至完成24hr发酵周期，离心收获菌体，按照菌泥的2倍体积加入冻干保护剂，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉4。
培养基2配方：鱼溶浆20.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.5。
鱼溶浆参数：水分38.6％，粗蛋白40.2％。来源于鳀鱼。
对典型鱼溶浆组分进行分析，氨基酸组成如表1所示。鱼溶浆中还含有丰富的核苷酸和牛磺酸等物质，也有观点认为鱼溶浆中包含未知生长因子。
表1鱼溶浆氨基酸组成
| 氨基酸 | 含量(mg/g干物质) | 氨基酸 | 含量(mg/g干物质) |
| 天门冬氨酸 | 4.90 | 蛋氨酸 | 1.50 |
| 苏氨酸 | 2.06 | 异亮氨酸 | 2.15 |
| 丝氨酸 | 1.74 | 亮氨酸 | 4.69 |
| 谷氨酸 | 9.85 | 酪氨酸 | 0.67 |
| 脯氨酸 | 2.26 | 苯丙氨酸 | 1.86 |
| 甘氨酸 | 4.79 | 赖氨酸 | 4.71 |
| 丙氨酸 | 5.13 | 组氨酸 | 1.75 |
| 胱氨酸 | 0.57 | 精氨酸 | 2.64 |
| 缬氨酸 | 2.87 | 色氨酸 | 0.36 |
实施例2
5L发酵罐，加入3.5L培养基2，接种植物乳杆菌(LactobacillusplantarumW‐9)，于37℃发酵12hr后，升温至42℃热激发酵20min，然后恢复37℃发酵2小时；再升温至45℃热激发酵10min，然后恢复37℃发酵2hr；再升温至47℃热激发酵20min，然后再恢复37℃发酵，直至完成24hr发酵周期，离心收获菌体，按照菌泥的2倍加入冻干保护，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉5。
活菌数存活率测试：
取菌粉1～5，置于45℃恒温箱中，定期取样测其活菌数存活率。活菌数计数方式采用MRS平板计算菌落个数。结果见表2。
表2菌粉稳定性考察
从表2数据可见，对比例1采用传统MRS培养基发酵，采用传统的非变温发酵工艺，稳定性最差。对比例2采用了鱼溶浆替代培养基1的有机氮源进行发酵，菌粉稳定性较实施例1有轻微提升；表明鱼溶浆本身具有一定的提高乳酸菌热稳定性的作用。从对比例1～3来看，对比例3采用了传统培养基，但采用了热激工艺，菌粉热稳定性有了较大幅度提升，表明热激发酵本身对于提升热稳定性具有作用，但尚不知热激发酵和鱼溶浆联用是否具有更佳效果。
对比例3和实施例1比较，二者的区别是实施例1采用鱼溶浆作为氮源，结果显示实施例1菌粉热稳定性显著提升，说明鱼溶浆和热激发酵具有协同作用，二者共用可以获得更好的热稳定性。可能是因为鱼溶浆中含有丰富的营养物质，可以有助于乳酸菌适应环境变化做出一系列保护反应，如产生热激蛋白等物质。
对比实施例1和2，实施例2菌粉热稳定性较实施例1有轻微提升，二者的区别是实施例2采用了3次热激，表明增加热激次数对于提高菌粉热稳定性具有一定作用。
实施例3
5L发酵罐，加入3.5L培养基3，接种鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusCGMCC1.2568)，于37℃发酵12hr后，升温至42℃热激发酵20min，然后恢复37℃发酵2小时；再升温至45℃热激发酵10min，然后恢复37℃发酵3hr；再升温至47℃热激发酵20min，然后再恢复37℃发酵，直至完成24hr发酵周期，离心收获菌体，按照菌泥的2倍加入冻干保护，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉6。
培养基3配方：鱼溶浆15.0g，柠檬酸氢二铵2.5g，葡萄糖25.0g，吐温801.5mL，乙酸钠4.5g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.50g，硫酸锰0.20g，蒸馏水1000mL，pH6.8。
实施例4
5L发酵罐，加入3.5L培养基2，接种干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiCGMCC1.3113)，于35℃发酵12hr后，升温至42℃热激发酵20min，然后恢复37℃发酵2小时；再升温至45℃热激发酵10min，然后恢复35℃发酵3hr；再升温至47℃热激发酵20min，然后再恢复35℃发酵，直至完成24hr发酵周期，离心收获菌体，按照菌泥的2倍加入冻干保护，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉7。
实施例5
5L发酵罐，加入3.5L培养基4，接种粪链球菌(StreptococcusfaeciumCGMCC1.101)，于42℃发酵12hr后，升温至50℃热激发酵20min，然后恢复42℃发酵2小时；再升温至50℃热激发酵10min，然后恢复42℃发酵3hr；再升温至50℃热激发酵20min，然后再恢复42℃发酵，直至完成24hr发酵周期，离心收获菌体，按照菌泥的2倍加入冻干保护，冻干保护剂加入前用2倍无菌水溶解，冻干得到菌粉8。培养基4配方：鱼溶浆25.0g，柠檬酸氢二铵1.5g，葡萄糖15.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.5g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁0.56g，硫酸锰0.3g，蒸馏水1000mL，pH6.4。
活菌数存活率测试：取菌粉6～8，置于45℃恒温箱中，定期取样测其活菌数存活率。活菌数计数方式采用MRS平板计算菌落个数。结果见表3。
表3菌粉稳定性考察
由表3结果可以，采用本发明方法可以获得稳定性良好的冻干粉，菌粉在45℃3天的储存后均可以存活50％以上。
Claims (9)
1.一种提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，采用鱼溶浆为营养源，乳酸菌发酵过程中采用程序性变温控制，其方法是：在乳酸菌发酵周期中，至少采用2次升温热激发酵处理，两次升温热激发酵的时间间隔为2～5hr，且每次热激处理时间为10～30min，热激发酵温度比正常发酵温度高3～10℃，发酵结束收获菌体干燥处理；所述正常发酵温度为35～42℃。
2.根据权利要求1所述的提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，所述程序性变温控制的具体过程为：先采用正常发酵温度发酵6～15h，然后进行第一次热激发酵处理，再降温至正常发酵温度发酵1-3h，之后进行第二次热激发酵处理，再次降温至正常发酵温度发酵8～15h。
3.根据权利要求1所述的提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，所述热激发酵温度为比正常发酵温度高5～8℃。
4.根据权利要求1所述的提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，采取3次以上热激发酵处理。
5.根据权利要求4所述的提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，先采用正常发酵温度发酵6～10h，然后进行第一次热激发酵处理，再降温至正常发酵温度发酵1-3h，之后进行第二次热激发酵处理，再次降温至正常发酵温度发酵6～10h，之后进行第三次热激发酵处理，再次降温至正常发酵温度发酵6～10h。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌包括：短乳杆菌(Lactobacillus.breris)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus.helveticus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus.curvatus)、德式乳杆菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus.fermentum)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus.casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)、乳脂链球菌(streptococcus.cremoris)，二丁酮链球菌(Streptococcus.diacetylactis)、粪链球菌(Streptococcus.faecium)、乳酸乳球菌(Lactococcus.lactis)、嗜热链球菌((Streptococcus.thermophilus))、乳酸片球菌(Pediococcus.acidilactici)、啤酒片球菌(Pediococcus.cerecisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus.pentosaceus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)中的一种或两种以上的混合物。
7.根据权利要求1～5任一项所述的提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，所述干燥处理为冷冻干燥或喷雾干燥。
8.根据权利要求7所述的提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，所述冷冻干燥是加入冻干保护剂，冷冻干燥得到菌粉。
9.根据权利要求1～5任一项所述的提高乳酸菌制剂热稳定性的方法，其特征在于，以质量份数计，所述鱼溶浆为营养源的培养基配方组成为：鱼溶浆15‐25份、柠檬酸氢二铵1.5‐2.5份、葡萄糖15‐25份、乙酸钠4‐6份，磷酸氢二钾1.5‐2.5份，硫酸镁0.5‐1.份，硫酸锰0.2‐0.3份，吐温801‐2份，蒸馏水适量；控制pH值为6‐6.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20190308 Termination date: 20191105 |