CN105002123A - 一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法 - Google Patents

一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌(Bacillus？coagulans)Liu-g1(CGMCC？No.10790)活菌制剂的制备方法，适用于畜禽水产养殖业中饲用功能性活菌制剂的生产。本发明利用筛选自传统干酪的一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩和冷冻干燥等工序制备成高活菌数的活菌制剂。本发明通过对发酵培养基和发酵条件的优化，利用全自动发酵罐发酵使Liu-g1菌株的活菌数量可达9.0×109CFU/mL以上，冻干后活菌制剂的活菌数量可达1011CFU/g以上。本发明制备的活菌制剂价格低廉，活菌含量高，可作为禽畜饲料生物添加剂及微生态制剂，具有提高动物生长速度、节省饲料用量、减少发病率、降低饲养成本等特点。

Description

一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法，适用于畜禽养殖业功能性微生态制剂的生产。
背景技术
饲用微生态制剂是采用农业部认可的动物肠道有益微生物经发酵、纯化、干燥而精制的复合生物制剂，是一种减少或替代抗生素使用的绿色生物添加剂。
1989年，美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单共42种，其中包括凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。我国农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》发布的饲料添加剂包括凝结芽孢杆菌，可饲喂肉鸡、生长育肥猪和水产养殖动物。凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，在有氧条件下有利于繁殖菌体，在无氧条件下产生大量乳酸。该菌既具有乳酸菌产乳酸的特性，又具有良好的抗逆性。其芽孢对高温及低pH环境具有很强的耐受性，可顺利通过胃肠道逆环境，并发挥良好的益生效果，因此可用于制备微生态制剂。
凝结芽孢杆菌可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、海藻糖产酸而不产气。该菌具有丰富的能够水解大分子物质的胞外酶系，可产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及纤维素酶等活性物质，有助于增强胃肠道对食物的消化与吸收能力，提高饲料转化率，因此可作为饲用微生态制剂而广泛应用于畜禽饲养中。此外，凝结芽孢杆菌还可产生β-半乳糖苷酶与乳酸脱氢酶，因此有助于乳糖不耐受症人群对乳糖的消化。
本发明涉及的产中性蛋白酶凝结芽孢杆菌Liu-g1可用于发酵生产活菌制剂。经过本发明优化培养基配方与发酵条件后，活菌制剂中Liu-g1菌株的活菌数量可达到1011CFU/g以上。将凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂添加到畜禽饲料中，可提高畜禽对饲料中蛋白质的消化吸收。此外，试验研究表明，该菌还能分泌α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类共同发挥作用，提高饲料利用率。
在制备凝结芽孢杆菌活菌制剂过程中，由于发酵培养基配方直接影响凝结芽孢杆菌的活菌数量、发酵时间和生产成本，故优化发酵培养基的配方是本发明的关键技术。
目前，国内申请凝结芽孢杆菌的专利较多，发明内容大多是凝结芽孢杆菌的菌种检测技术和芽孢的制备方法，如发明专利CN1103160455A公开了“凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法”，该专利报道采用半封闭式固体发酵工艺，生长后期氧气大量减少，刺激芽孢快速形成；如发明专利CQ 102304559A公开了“凝结芽孢杆菌的荧光定量PCR快速检测方法”，该专利报道了一种快速检测凝结芽孢杆菌的荧光定量PCR方法。
关于凝结芽孢杆菌发酵方面的专利：如发明专利CN 103289910A公开了“一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法”，该专利报道了凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，采用凝结芽孢杆菌作为发酵菌种，在优化的固体培养基中，温度为37～40℃的条件下培养，经过三级种子扩大培养而进行大规模发酵生产；如发明专利CN 103911326A公开了“凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备”，该专利报道了一种凝结芽孢杆菌利用分段接种技术，混菌发酵对菌种的生长、增殖具有互相促进作用，发酵后产品的色泽和口感等感官特征得到改善和多样化，同时提高了营养物质降解率；如发明专利CN 104232525A公开了“一种凝结芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺”，该专利报道了一种凝结芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，凝结芽孢杆菌经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，在发酵过程中通过补料流加碳源增加芽孢杆菌的数量和转化率，显著提高了产量，降低了成本。
目前有关凝结芽孢杆菌快速检测、芽孢制备及其活菌制剂制备方法已见专利报道。但是，关于利用产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌制备活菌制剂的方法尚未见国内外相关文献报道和专利报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明所涉及的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1，分离筛选自传统干酪中，已于2015年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.10790。在脑心浸液(BHI)培养基上，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1的菌落大小为2～4mm，灰白色、不透明、表面湿润、边缘不整齐，菌落表面初期(45℃，培养6～8h)扁平，后期皱褶凸起；菌体细胞呈大杆状，长短不一，中生芽孢，G+好氧嗜热菌。
所述方法中，采用单因素多水平和正交试验对凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵培养基配方进行优化，优化后的发酵培养基配方为(质量体积比浓度，W/V)：1％玉米淀粉，1％大豆粕，0.2％碳酸钙，蒸馏水1000mL，pH7.5。
所述方法中，在上述试验结果基础上，采用单因素多水平和正交试验进行凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵条件的优化。优化后的发酵条件为：发酵液初始pH7.5，发酵时装液量50mL/250mL三角瓶，接种量2％，发酵温度45℃，摇床转速180r/min，发酵时间48h。
所述方法中，将上述1L优化发酵培养基装入5L自动发酵罐中进行高密度分批发酵，接种量为2％，控制发酵温度45℃，发酵液初始pH7.5，搅拌转速180～220r/min，发酵时间48h，得到凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵液。
上述方法中，5L自动发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为 BIOF6005GBN。
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用立式高速冷冻离心机将1L发酵液于4℃条件下，5000r/min离心20min，弃上清液，收集得到菌泥。
所述方法中，立式高速冷冻离心机由湘仪离心机仪器有限公司提供，型号为GL-21M。
所述方法中，将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有10.5％麦芽糊精、4％马铃薯淀粉和5.5％乳清粉(质量体积比浓度，W/V)冻干保护剂中，混合均匀后，得到凝结芽孢杆菌Liu-g1与冻干保护剂的混合物。
所述方法中，将上述混合物于-36℃低温冰箱中预冻12h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。
所述方法中，利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.18mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1冻干活菌制剂。
所述方法中，采用小试发酵生产技术和冻干工艺所得到的产蛋白酶凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的活菌数量可达到1011CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。
上述方法得到的产中性蛋白酶凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法，以及专用生产菌株属于本发明保护范围。
具体实施方式
下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。
实施例1、产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备
1、菌种活化 
将凝结芽孢杆菌Liu-g1斜面或平板培养物接种于装有灭菌的5mL BHI培养基试管中，于45℃转速为150r/min的摇床培养12h活化培养一代。而后以2％的接种量移种于装有灭菌的5mL基础培养基试管中，于37℃转速为150r/min的摇床培养48h活化培养二代，得到活化菌种。
凝结芽孢杆菌Liu-g1基础培养基配方为(质量体积比浓度，W/V)：1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％NaCl，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
2、发酵培养基配方的优化
(1)单因素多水平试验确定发酵培养基配方
碳源的确定：将基础培养基中的碳源分别由葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、纤维素、麦芽糖代替，将凝结芽孢杆菌Liu-g1活化菌种以2％的接种量移种于盛有50mL灭菌培养基的250mL三角瓶中，于37℃转速为150r/min的摇床培养48h，采用平板计数培养基以倾注法检测发酵液中的活菌数量，结果见表1。
表1发酵培养基碳源对发酵液中Liu-g1菌株活菌数的影响
由表1可知，五种不同的碳源条件下，凝结芽孢杆菌Liu-g1的活菌数有差异，其中葡萄糖作为碳源的活菌数最低，仅为3.3×108CFU/mL；玉米淀粉作为碳源时活菌数最高，为4.53×109CFU/mL。故选取玉米淀粉为发酵培养基的碳源。
氮源的确定：在确定碳源为玉米淀粉的基础上，将基础培养基中的氮源分别由花生麸皮、大豆粕、玉米麸皮、棉籽粕、小麦麸皮代替，以上述同样条件和方法进行发酵与活菌计数，结果见表2。
表2发酵培养基氮源对发酵液中Liu-g1菌株活菌数的影响
由表2可知，五种不同的有机氮源条件下，凝结芽孢杆菌Liu-g1的活菌数有差异，其中玉米麸皮作为氮源条件下的活菌数最低，仅为3.0×107CFU/mL；大豆粕作为氮源时活菌数最高，为2.53×109CFU/mL。故选取大豆粕为发酵培养基氮源。
无机盐的确定：在确定玉米淀粉和大豆粕分别为碳源和氮源的基础上，将基础培养基中的无机盐分别由氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙代替，以上述同样条件和方法进行发酵与活菌计数，结果见表3。
表3发酵培养基无机盐对发酵液中Liu-g1菌株活菌数的影响
由表3可知，在含有五种不同的无机盐发酵培养基中，凝结芽孢杆菌Liu-g1的活菌数有明显差异，其中硫酸锰作为无机盐条件下的活菌数最低，仅为1.0×107CFU/mL；而碳酸钙、氯化钙和氯化钠作为无机盐时活菌数均大于109CFU/mL，其中碳酸钙作为无机盐时活菌数最高，为9.33×109CFU/mL。此外，碳酸钙还具有调节发酵液pH的作用，故选取碳酸钙为发酵培养基中的无机盐。
(2)正交试验优化发酵培养基配方
根据单因素多水平试验结果，选择1％、2％、4％的玉米淀粉(碳源)，1％、2％、4％的大豆粕(氮源)，0.2％、0.4％、0.6％的碳酸钙(无机盐)设计三因素三水平[L9(33)]正交试验，以上述同样条件和方法进行发酵与活菌计数，结果见表4。
表4优化凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵培养基配方[L9(33)]正交试验结果表
由表4极差分析可知，影响发酵液Liu-g1菌株活菌数的因素主次顺序为：C＞B＞A，即无机盐含量对活菌数的影响最大，氮源大豆粕含量对活菌数的影响相对略小，而碳源玉米淀粉含量对活菌数的影响最小；由K值分析KA1＞KA2＞KA3，KB1＞KB3＞KB2，KC1＞KC2＞KC3可知，发酵培养基配方最优组合为A1B1C1，即碳源含量为1％，氮源含量为1％，无机盐含量为0.2％，碳源∶氮源为1∶1。
3、发酵条件的优化
(1)单因素多水平试验确定发酵条件
发酵pH的确定：将上述优化发酵培养基配方中的pH分别调节至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，121℃灭菌15min。将凝结芽孢杆菌Liu-g1第二代活化菌种以2％的接种量，分别移种于盛有50mL不同pH的发酵培养基的250mL三角瓶中，于37℃转速为150r/min的摇床培养48h，采用平板计数培养基以倾注法检测发酵液中的活菌数量，结果见表5。
表5发酵液pH对Liu-g1菌株活菌数的影响
由表5可知，在发酵培养基初始pH为6.0～7.5时，发酵液中凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌数逐渐升高；当pH为7.5时，发酵液活菌数最高，为7.8×108CFU/mL；而pH为8.0时，发酵液中的活菌数又开始降低。由于发酵培养基的自然pH为7.5，故确定凝结芽孢杆菌Liu-g1的发酵培养基初始pH值为自然。
发酵装液量的确定：在优化发酵培养基的pH为自然(pH7.5)的基础上，分别将优化发酵培养基以30mL、40mL、50mL、60mL、70mL的装液量盛入250mL三角瓶中，以上述同样条件和方法进行发酵与活菌计数，结果见表6。
表6发酵装液量对Liu-g1菌株活菌数的影响
由表6可知，装液量在50mL时，发酵液中Liu-g1菌株活菌数量最高，达5.07×109CFU/mL，故确定凝结芽孢杆菌Liu-g1的发酵培养基装液量为50mL/250mL。
发酵接种量的确定：在优化发酵培养基的pH为自然(pH7.5)，以及三角瓶装液量为50mL基础上，分别以2％、3％、4％、5％、6％的接种量移种于优化发酵培养基中，以上述同样条件和方法进行发酵与活菌计数，结果见表7。
表7发酵接种量对Liu-g1菌株活菌数的影响
由表7可知，在接种量为2％时，发酵液中Liu-g1菌株活菌数量最高，为3.97×109CFU/mL；接种量在3％～5％之间时，发酵液活菌数逐渐升高；而在接种量为6％时，发酵液活菌数又开始降低。故确定凝结芽孢杆菌Liu-g1发酵接种量为2％。
发酵时间的确定：在优化发酵培养基的pH为自然(pH7.5)，三角瓶装液量为50mL，以及发酵接种量为2％的基础上，以上述同样条件和方法分别以12h、24h、36h、48h、60h的发酵时间进行发酵与活菌计数，结果见表8。
表8发酵时间对Liu-g1菌株活菌数的影响
由表8可知，不同发酵时间对发酵液活菌数影响较大，发酵时间在12～60h之间时，发酵液活菌数先升高后降低；发酵时间在48h时，发酵液活菌数最高，达3.53×109CFU/mL。故确定凝结芽孢杆菌Liu-g1的发酵时间为48h。
发酵温度的确定：在优化发酵培养基的pH为自然(pH7.5)，三角瓶装液量为50mL，发酵接种量为2％，以及发酵时间为48h的基础上，以上述同样条件和方法分别以35℃、40℃、45℃、50℃、55℃的发酵温度进行发酵与活菌计数，结果见表9。
表9发酵温度对Liu-g1菌株活菌数的影响
由表9可知，在温度为45℃时，发酵液活菌数最高，为2.57×109CFU/mL。在发酵温度为35～45℃之间时，发酵液活菌数逐渐升高，而在发酵温度在45～55℃之间时，发酵液活菌数差异不大。根据实际条件，确定凝结芽孢杆菌Liu-g1的发酵温度为45℃。
发酵转速的确定：在优化发酵培养基的pH为自然(pH7.5)，三角瓶装液量为50mL，发酵接种量为2％，发酵时间为48h，以及发酵温度为45℃的基础上，以上述同样条件和方法分别以140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min摇床转速进行发酵与活菌计数，结果见表10。
表10发酵转速对Liu-g1菌株活菌数的影响
由表10可知，发酵时摇床不同转速对发酵液中Liu-g1菌株活菌数影响差别不大，转速在140～220r/min之间时，发酵液活菌数先升高后降低，转速在180r/min时，发酵液活菌数量相对较高，为2.32×109CFU/mL。由此确定凝结芽孢杆菌Liu-g1摇床转速为180r/min。
(2)正交试验优化发酵条件
根据单因素多水平试验结果，选择发酵液初始pH为7.0、7.5、8.0，装液量为40mL、50mL、60mL，发酵温度为40℃、45℃、50℃，发酵时间为36h、48h、60h，设计四因素三水平[L9(34)]正交试验，以上述同样条件和方法进行发酵与活菌计数，结果见表11。
表11优化发酵条件[L9(34)]正交试验结果
由表11极差分析可知，影响发酵液中Liu-g1菌株活菌数的因素主次顺序为：B＞D＞C＞A，即装液量对活菌数的影响最大，发酵温度和发酵时间对活菌数的影响相对略小，而初始pH对活菌数的影响最小；由K值分析KA2＝KA3＞KA1，KB2＞KB3＞KB1，KC2＞KC3＞KC1，KD2＞KD1＞KD3可知，发酵条件的最优组合为A2B2C2D2，即优化发酵条件为：发酵液初始pH为7.5，装液量为50mL，发酵温度为45℃，发酵时间为48h。
(3)5L自动发酵罐高密度发酵试验
将上述1L优化发酵培养基装入5L自动发酵罐中进行高密度分批发酵，接种量为2％，控制发酵温度45℃，发酵液初始pH7.5，搅拌转速180～220r/min，发酵时间48h。同时在优化发酵培养基的pH为自然(pH7.5)，三角瓶装液量为50mL，发酵接种量为2％，发酵时间为48h，摇床转速为180r/min进行发酵对照试验，发酵液中Liu-g1菌株活菌计数结果见表12。
表12 5L自动发酵罐高密度发酵试验结果
由表12可知，采用自动发酵罐在优化发酵条件下进行高密度分批发酵，其发酵液中Liu-g1菌株活菌数量可达9.86×109CFU/mL，并略高于对照组的活菌数量。
4、离心浓缩与加入保护剂
将1L发酵液于4℃条件下，5000r/min离心20min，弃上清液，收集得到菌泥。将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有10.5％麦芽糊精、4％马铃薯淀粉和5.5％乳清粉冻干保护剂中，混合均匀后，得到凝结芽孢杆菌Liu-g1菌泥与冻干保护剂的混合物。
5、预冻和冻干 
将上述混合物于-36℃低温冰箱中预冻12h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.18mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂。
采用5L自动发酵罐小试发酵生产技术和冻干工艺所得到的产蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的活菌数量可达到1011CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。此种活菌制剂价格低廉，活菌含量高，可作为禽畜饲料生物添加剂及微生态制剂，具有提高动物生长速度、节省饲料用量、减少发病率、降低饲养成本等特点。它不仅有增强禽畜消化功能的效果，而且具有调节禽畜的肠道菌群平衡作用，同时凝结芽孢杆菌在肠道内产生的细菌素可抑制某些致病菌尤其是抑制单增李斯特菌的生长。
本专利所属项目1：科技部国家科技重大专项“抗病转基因羊新品种培育”子课题“抗病转基因羊扩繁体系完善、抗病转基因羊抗病及生物安全评价”
项目编号：2014ZX08008-005
项目起止时间：2014年1月1月—2015年12月31日
项目负责人：刘慧
本专利所属项目2：“十二五”农村领域国家科技计划课题“动物源食品HACCP体系建设及致病菌高通量检测技术”
项目编号：2012BAD28B02-01
项目起止时间：2012年1月1日—2015年12月31日
项目负责人：孔保华
本专利所属项目3：北京市属高等学校高层次人才引进与培养项目“天然乳酸菌素对畜产品中重要致病菌的抑菌机制及作用研究”
项目编号：CIT&TCD20140315
项目起止时间：2014年1月1月—2016年12月31日
项目负责人：张红星。

Claims (2)

1.凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1CGMCC No.10790。
2.一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法，其特征在于：发酵培养基配方为：1％玉米淀粉、1％大豆粕、0.2％碳酸钙，蒸馏水1000mL，pH7.5；将活化、扩大培养的凝结芽孢杆菌Liu-g1以2％接种量移种到1L发酵培养基中，利用5L自动发酵罐进行高密度发酵，控制发酵温度45℃，发酵液初始pH7.5，搅拌转速180～220r/min，发酵时间48h，得到凝结芽孢杆菌Liu-gl发酵液；将1L发酵液于4℃条件下，5000r/min离心20min，弃上清液，收集得到菌泥；将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有10.5％麦芽糊精、4％马铃薯淀粉和5.5％乳清粉冻干保护剂中，混合均匀后，得到凝结芽孢杆菌Liu-gl菌泥与冻干保护剂的混合物；将上述混合物于-36℃低温冰箱中预冻12h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂；利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.18m Bar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-gl活菌制剂。
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