CN107594086A - 一种用于哺乳期仔猪的复合微生物组合物和饲料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于哺乳期仔猪的复合微生物组合物和饲料。本发明所述复合微生物组合物包括以下两种菌株：保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌Zhang‑LL和保藏号为CGMCC No.10790的凝结芽孢杆菌Liu‑g1；所述植物乳杆菌Zhang‑LL与所述凝结芽孢杆菌Liu‑g1的活菌数比为1:0.5～2。本发明所述复合微生物组合物能够有效增加哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强哺乳期仔猪的消化机能和免疫力。

Description

一种用于哺乳期仔猪的复合微生物组合物和饲料
技术领域
本发明涉及微生物组合物领域，具体而言，涉及一种用于哺乳期仔猪的复合微生物组合物和饲料。
背景技术
仔猪是指从出生至70日龄左右的猪，仔猪还可以分为两个阶段，即哺乳阶段和断奶后的保育阶段。哺乳阶段仔猪是指从出生至断奶期间的仔猪，一般大约从出生到生长至1个月左右，其主要喂养方式是母猪哺乳或哺乳+饲料。而处于保育阶段的仔猪指的是断奶之后的仔猪阶段，其主要喂养方式是全饲料喂养。
哺乳阶段的仔猪和保育阶段的仔猪虽然都处于仔猪阶段，但二者的生理和发育状态却相差大。与处于保育阶段的仔猪相比，哺乳期仔猪的消化系统发育不完全，唾液淀粉酶的活性低，同时体温调节机能不健全、免疫力和胃肠道消化机能差，适应环境的能力差。稍有不慎，哺乳期仔猪的生长就会受阻，影响后期的生长、发育甚至是胴体的瘦肉率，并且容易爆发腹泻等疾病，死亡率高。
为了在猪生长阶段提高日增重量、减少腹泻和死亡率，单独喂食或在饲料中添加微生物组合物是现阶段比较常见的手段。目前，也有一些用于仔猪的微生物组合物，但是现有的微生物组合物主要针对于断奶后的仔猪，用于哺乳期仔猪的效果差，不能有效增重或减少腹泻率和死亡率。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种复合微生物组合物，所述组合物能够有效增加哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强消化机能和免疫力。
本发明的第二目的在于提供一种所述组合物的使用方法，通过该方法可以有效增加哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强消化机能和免疫力。。
本发明的第三目的在于提供所述组合物在制备用于增加哺乳期仔猪体重、增强哺乳期仔猪免疫力和/或防止哺乳期仔猪腹泻的制剂的用途。
本发明的第四目的在于提供一种哺乳期仔猪饲料，所述饲料能够有效哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强消化机能和免疫力。
本发明的第五目的在于提供一种所述饲料的使用方法，所述方法能够有效增加哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强消化机能和免疫力。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种复合微生物组合物，所述组合物包括以下两种菌株：保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌Zhang-LL和保藏号为CGMCC No.10790的凝结芽孢杆菌Liu-g1；
所述植物乳杆菌Zhang-LL与所述凝结芽孢杆菌Liu-g1的活菌数比为1:0.5～2；
优选地，所述组合物的剂型为液体制剂或固体制剂；
更优选地，所述液体制剂中所述植物乳杆菌植物Zhang-LL的活菌数为1.0×108～1010CFU/mL，所述凝结芽孢杆菌Liu-g1的活菌数为1.0×108～1010 CFU/mL；
更优选地，所述固体制剂中所述植物乳杆菌Zhang-LL的活菌数为1.0×108～1010CFU/g，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×108～1010CFU/g。
本发明所述植物乳杆菌Zhang-LL，其分类命名为植物乳杆菌植物亚种，拉丁学名为Lactobacillus plantarum subsp.planturm，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年12月4日，保藏编号为CGMCC No.6936。
本发明所述凝结芽孢杆菌Liu-g1，其分类命名为凝结芽孢杆菌，拉丁学名为Bacillus coagulans，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年5月8日，保藏编号为CGMCC No.10790。
本发明所述复合微生物组合物以植物乳杆菌Zhang-LL和凝结芽孢杆菌Liu-g1制备而成。本发明令人惊讶地发现，上述两种益生菌的复配制成的组合物对哺乳期的仔猪具有增加平均日增重、降低死亡率和腹泻率的效果。并且，根据本发明的实验例5可知，本发明所述复合微生物组合物的上述效果是由植物乳杆菌Zhang-LL和凝结芽孢杆菌Liu-g1的复配作用所决定的，单独使用植物乳杆菌Zhang-LL(对比例2)或凝结芽孢杆菌Liu-g1(对比例3)，或使用其他植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌的复配(对比例1)，都不能像本发明所述复合微生物组合物那样显著增加哺乳期仔猪的日增重量、降低腹泻率和死亡率。而根据本发明实验例1～4可知，本发明所述复合微生物组合物之所以能够增强哺乳期仔猪的日增重量、降低腹泻率和死亡率，很有可能是因为上述两株益生菌进行复配之后增强小肠指数、十二指肠和回肠的绒腺比，增加紧密连接蛋白的含量，降低血清尿素和谷丙转氨酶含量，提高血清IgM和IgG含量，起到了增强哺乳期仔猪的胃肠道消化功能、肝功能和免疫功能的作用。
在一些具体的实施方式中，所述液体制剂中所述植物乳杆菌的活菌数为1.0×109CFU/mL，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×109CFU/mL；或者，
所述固体制剂中所述植物乳杆菌的活菌数为1.0×109CFU/g，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×109CFU/g。
在一些具体的实施方式中，所述植物乳杆菌与所述凝结芽孢杆菌的活菌数比为1:0.8、1:1或1:1.5。
在一些具体的实施方式中，所述液体制剂中植物乳杆菌的活菌数为2.0×109CFU/mL、4.0×109CFU/mL、6.0×109CFU/mL、8.0×109CFU/mL或1.0×1010CFU/mL，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为2.0×109CFU/mL、4.0×109CFU/mL、6.0×109CFU/mL、8.0×109CFU/mL或1.0×1010CFU/mL；优选地，所述液体制剂中植物乳杆菌的活菌数为1.0×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×109CFU/mL。
在一些具体的实施方式中，所述固体制剂中植物乳杆菌的活菌数为2.0×109CFU/g、4.0×109CFU/g、6.0×109CFU/g、8.0×109CFU/g或1.0×1010CFU/g，凝结芽孢杆菌的活菌数为2.0×109CFU/g、4.0×109CFU/g、6.0×109CFU/g、8.0×109CFU/g或1.0×1010CFU/g；
优选地，所述固体制剂中植物乳杆菌的活菌数为1.0×109CFU/g，凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×109CFU/g。
本发明上述复合微生物组合物对植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌的配比和活菌数进行优化，优化之后的组合物的配比更合理，其协同增效作用也更强，相应地，在增加哺乳期仔猪的平均日增重、降低腹泻率和死亡率方面的效果更显著。
在一些具体的实施方式中，所述组合物还包括益生元，所述益生元选自低聚糖、乳果糖、α葡聚糖、β葡聚糖、右旋糖酐、膳食纤维、果胶、阿拉伯胶、魔芋胶、瓜儿胶、黄原胶、麦芽糊精、抗性淀粉和回生淀粉中的一种或多种；
优选地，所述低聚糖选自菊糖、低聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、低聚木糖醇、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、低聚乳糖、低聚甘露糖、低聚乳果糖、低聚龙胆糖、低聚壳聚糖、阿拉伯半乳聚糖、牛奶衍生低聚糖、N-乙酰化低聚糖、岩藻糖基化低聚糖、唾液酸化低聚糖、大豆低聚糖、洋蓟低聚糖、燕麦低聚糖、洋葱低聚糖、松木低聚糖、或芦笋低聚糖中的一种或多种；
优选地，所述膳食纤维包括水溶性膳食纤维或非水溶性膳食纤维。
在一些具体的实施方式中，所述液体制剂的剂型选自喷剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、滴剂、合剂或糖浆剂；优选地，所述喷剂选自喷雾剂或气雾剂；优选地，所述乳剂选自油包水型乳剂或水包油型乳剂；
所述固体制剂的剂型选自粉散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、或膏剂；优选地，所述粉散剂选自粉剂、颗粒剂或散剂；更优选地，所述粉散剂为冻干粉或由冻干粉制成；优选地，所述片剂选自肠溶片、分散片、速释片、缓释片、控释片、浸液片、咀嚼片或泡腾片；优选地，所述胶囊剂选自硬胶囊、软胶囊、肠深胶囊或控释胶囊。
在一些具体的实施方式中，所述组合物还包括药学上可接受的载体；
优选地，所述药学上可接受的载体包括填充剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、湿润剂和润滑剂中的一种或多种；
更优选地，所述填充剂选自甘露糖醇、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、山梨糖醇、木糖醇、粉末纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、淀粉、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、磷酸钙、碳酸金属盐、金属氧化物或铝硅酸金属盐中的一种或多种；
更优选地，所述稀释剂选自月桂基硫酸金属盐、聚乙二醇、脂肪酸酯的甘油酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯-烷基醚、烷基硫酸金属盐、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、脂肪酸糖酯、聚乙醇酸化甘油、季铵胺化合物、月桂酰基聚乙二醇甘油酯、辛基己酰基聚乙二醇甘油酯、硬脂酰基聚乙二醇甘油酯、亚油酰基聚乙二醇甘油酯、油酰基聚乙二醇甘油酯、聚乙氧基化植物油、聚乙氧基化固醇、聚乙氧基化胆固醇、聚乙氧基化甘油脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、磺基琥珀酸酯、牛磺酸酯或多库酯钠中的一种或多种；
更优选地，所述崩解剂选自交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交聚维酮、褐藻酸、褐藻酸钠、褐藻酸钾、褐藻酸钙、离子交换树脂、基于食物酸和碱性碳酸盐成分的泡腾系统、粘土、滑石粉、淀粉、预胶化淀粉、淀粉乙醇酸钠、纤维素屑、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硅酸钙、碳酸金属盐、碳酸氢钠、柠檬酸钙，或磷酸钙中的一种或多种；
更优选地，所述粘合剂选自聚乙烯吡咯啶酮、共聚维酮、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、交联聚(丙烯酸)、卵磷酯、酪蛋白、聚乙烯醇、凝胶或高岭土；
更优选地，所述湿润剂选自月桂基硫酸金属盐、聚乙二醇、脂肪酸酯的甘油酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯-烷基醚、烷基硫酸金属盐、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、脂肪酸糖酯、聚乙醇酸化甘油、季铵胺化合物、月桂酰基聚乙二醇甘油酯、辛基己酰基聚乙二醇甘油酯、硬脂酰基聚乙二醇甘油酯、亚油酰基聚乙二醇甘油酯、油酰基聚乙二醇甘油酯、聚乙氧基化植物油、聚乙氧基化固醇、聚乙氧基化胆固醇、聚乙氧基化甘油脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、磺基琥珀酸酯、牛磺酸酯或多库酯钠；
更优选地，所述润滑剂选自硬脂酸、硬脂酸金属盐、硬脂酰富马酸钠、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、山萮酸甘油酯、植物油、亮氨酸、二氧化硅、硅酸、滑石粉、丙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚亚烷基二醇或氯化钠。
本发明还涉及上述组合物的使用方法，所述方法包括向哺乳期仔猪喂食所述的复合物微生物组合物，优选地，所述复合微生物组合物的喂食量为1.5～2.5g/次，或1.5～2.5ml/次；更优选地，所述复合微生物组合物的喂食量为2g/次，或2ml/次。
本发明所述方法对哺乳期的仔猪具有增加平均日增重、降低死亡率和腹泻率的效果。
本发明还涉及上述组合物在制备用于增加哺乳期仔猪体重、增强哺乳期仔猪免疫力和/或防止哺乳期仔猪腹泻的制剂的用途；优选地，所述哺乳期仔猪为35日龄以下的仔猪，优选为1日龄仔猪、7日龄仔猪、14日龄仔猪、21日龄仔猪或28日龄仔猪。
本发明所述应用能够有效哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强消化机能和免疫力。
本发明还涉及一种哺乳期仔猪饲料，所述哺乳期仔猪饲料包括上述的复合微生物组合物和基料。本发明所述哺乳期仔猪饲料具有有效哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强消化机能和免疫力的作用。
在一些具体的实施方式中，所述饲料中所述组合物的质量分数为1～5％，优选地，所述组合物的质量分数为1％，2％，3％，4％或5％；最优选地，所述组合物的质量分数为4％。
本发明还涉及上述饲料的使用方法，所述方法包括向哺乳期仔猪喂食上述饲料，其中，所述饲料的喂食量为40～60g/次，优选地，所述饲料的喂食量为50g/次。
本发明所述方法能够有效增加哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强哺乳期仔猪的消化机能和免疫力。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所述组合物和饲料中的植物乳杆菌Zhang-LL和凝结芽孢杆菌Liu-g1具有协同增效的作用，能够增强哺乳期仔猪的免疫力和胃肠道消化功能，从而起到有效哺乳期仔猪的平均日增重，降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率，增强消化机能和免疫力的作用。
保藏信息
本发明涉及植物乳杆菌Zhang-LL，其保藏日期为2012年12月4日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6936；
本发明涉及凝结芽孢杆菌Liu-g1，其保藏日期为2015年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10790；
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1-A为复合微生物组合物对哺乳期仔猪体重(总重)的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图1-B为复合微生物组合物对哺乳期仔猪体重(平均日增重)的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图2为复合微生物组合物对哺乳期仔猪小肠绒腺比的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图3为哺乳期仔猪回肠形态HE染色成像图(40x)，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图4为复合微生物组合物对哺乳期仔猪血清谷丙转氨酶含量的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图5为复合微生物组合物对哺乳期仔猪血清尿素含量的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图6为复合微生物组合物对哺乳期仔猪血清Ig G含量的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图7为复合微生物组合物对哺乳期仔猪血清Ig M含量的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图8为复合微生物组合物对哺乳期仔猪十二指肠紧密连接蛋白的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图9为复合微生物组合物对哺乳期仔猪空肠紧密连接蛋白的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3；
图10为复合微生物组合物对哺乳期仔猪回肠紧密连接蛋白的影响，其中CK为对照组，L为实施例1，M为实施例2，H为实施例3。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例中使用的MRS培养液的具体制备方法为：葡萄糖20.0g、胰蛋白胨5.0g、酪蛋白胨5.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.6g、硫酸锰0.2g、吐温-80 1mL、琼脂15.0g，加水至1000mL，pH 6.5；115℃灭菌20min。
BHI培养液的具体制备方法为：大豆粕1％，碳酸钙0.2％，玉米淀粉1％，pH 7.5；121℃灭菌15min。
实施例1
参照以下方法制备微生物组合物：
(1)制备植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(CGMCC No.6936)冻干菌粉：①菌种活化：甘油保藏管中L.plantarum Zhang-LL菌种按2％接种量接种于10mL灭菌改良MRS培养液，37℃静置培养12h；②菌种发酵：将上述培养所得菌液按2％接种量接种到100mL灭菌改良MRS培养液，其他培养条件同上；③菌种发酵：将上述所得扩大培养液按2％接种量接种到1 000mL灭菌改良MRS培养液，发酵时间16h，其他培养条件同上；④菌体收集和冻干：发酵结束后，无菌操作条件下将发酵液分装于离心瓶，离心瓶两两配平后置于高速冷冻离心机8 000r/min离心20min；于超净台弃掉发酵上清，并将所得菌泥用1/10发酵液体积的脱脂奶粉保护剂复溶；将复溶的脱脂乳菌液分装于塑料器皿，-36℃冰箱预冻12h后，迅速转移到冷冻干燥机；冻干结束后收集菌粉于-36℃冰箱保存待用。
(2)制备凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1(CGMCC No.10790)冻干菌粉：①菌种活化：甘油保藏管中B.coagulans Liu-g1菌种按2％接种量接种于10mL灭菌BHI培养液，转速为180r/min，培养温度45℃，培养时间12h；②菌种扩大培养将上述培养所得菌液按2％接种量接种到50mL灭菌BHI培养液(250mL三角瓶)，培养条件同上；③菌种发酵：将上述所得扩大培养液按2％接种量接种到400mL灭菌B.coagulans Liu-g1发酵培养基(1L大三角瓶)，发酵时间48h，其他培养条件同上；④菌体收集和冻干：同L.plantarum Zhang-LL的收集和冻干。
(3)测定上述两种冻干菌粉的活菌数，按比例混合均匀后复溶于生理盐水中，得到L.plantarum Zhang-LL和B.coagulans Liu-g1的活菌数均为1.0×108CFU/mL的微生物组合物。
实施例2
参照实施1所述方法制备微生物组合物，区别仅在于，微生物组合物中L.plantarum Zhang-LL和B.coagulans Liu-g1的活菌数均为1.0×109 CFU/mL。
实施例3
参照实施1所述方法制备微生物组合物，区别仅在于，微生物组合物中L.plantarum Zhang-LL和B.coagulans Liu-g1的活菌数均为1.0×1010 CFU/mL。
实施例4
参照实施例1所述方法制备微生物组合物，区别仅在于，微生物组合物中L.plantarum Zhang-LL的活菌数为4.0×109CFU/mL，B.coagulans Liu-g1的活菌数为8.0×109CFU/mL。
实施例5
参照实施例1所述方法制备微生物组合物，区别仅在于，微生物组合物中L.plantarum Zhang-LL的活菌数为8.0×109CFU/mL，B.coagulans Liu-g1的活菌数为4.0×109CFU/mL。
实施例6
参照实施例1所述方法制备微生物组合物，区别仅在于，所述步骤(3)具体为：测定上述两种冻干菌粉的活菌数，按比例混合均匀，得到L.plantarum Zhang-LL和B.coagulansLiu-g1的活菌数均为1.0×109CFU/g的微生物组合物。
实施例7
参照以下方法制备含复合微生物组合物的饲料：
(1)参照实施例2所述方法制备微生物组合物；
(2)将所述微生物组合物与哺乳期仔猪饲料按重量比1:25的比例混合均匀，即得。
对比例1
参照专利申请CN201610269612.X说明书实施例1制备复合微生物组合物，用生理盐水复溶，使植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌的活菌数均为1.0×109 CFU/ml。
对比例2
参照以下方法制备复合微生物组合物：
(1)制备植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(CGMCC No.6936)冻干菌粉：①菌种活化：甘油保藏管中L.plantarum Zhang-LL菌种按2％接种量接种于10mL灭菌改良MRS培养液，37℃静置培养12h；②菌种发酵：将上述培养所得菌液按2％接种量接种到100mL灭菌改良MRS培养液，其他培养条件同上；③菌种发酵：将上述所得扩大培养液按2％接种量接种到1 000mL灭菌改良MRS培养液，发酵时间16h，其他培养条件同上；④菌体收集和冻干：发酵结束后，无菌操作条件下将发酵液分装于离心瓶，离心瓶两两配平后置于高速冷冻离心机8 000r/min离心20min；于超净台弃掉发酵上清，并将所得菌泥用1/10发酵液体积的脱脂奶粉保护剂复溶；将复溶的脱脂乳菌液分装于塑料器皿，-36℃冰箱预冻12h后，迅速转移到冷冻干燥机；冻干结束后收集菌粉于-36℃冰箱保存待用。
(2)测定上述冻干菌粉的活菌数，复溶于生理盐水中，得到L.plantarum Zhang-LL的活菌数均为2.0×109CFU/mL的微生物组合物。
对比例3
参照以下方法制备复合微生物组合物：
(1)制备凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)Liu-g1(CGMCC No.10790)冻干菌粉：①菌种活化：甘油保藏管中B.coagulans Liu-g1菌种按2％接种量接种于10mL灭菌BHI培养液，转速为180r/min，培养温度45℃，培养时间12h；②菌种扩大培养将上述培养所得菌液按2％接种量接种到50mL灭菌BHI培养液(250mL三角瓶)，培养条件同上；③菌种发酵：将上述所得扩大培养液按2％接种量接种到400mL灭菌B.coagulans Liu-g1发酵培养基(1L大三角瓶)，发酵时间48h，其他培养条件同上；④菌体收集和冻干：同L.plantarum Zhang-LL的收集和冻干。
(2)测定上述冻干菌粉的活菌数，复溶于生理盐水中，得到B.coagulans Liu-g1的活菌数均为2.0×109CFU/mL的微生物组合物。
实验例1
将36头新生仔猪随机分为四组，每组9头，经检验各组间仔猪初重无显著差异。各组仔猪自然母乳喂养；对照组(CK组)和实施例1～3(L、M和H组)分别口腔喷服2mL生理盐水，实施例1～3所述复合微生物组合物。所述喷服操作在仔猪第1、7、14、21日龄时进行，期间母猪和仔猪的管理及免疫按照养殖场常规流程进行。试验期28d。
各组仔猪出生后分别标记耳标，并对应各自耳标称量记录1日龄初重和28日龄末重，并计算日均增重量，具体结果参见图1；每日记录各组仔猪腹泻及死亡情况，统计腹泻率和死亡率，具体统计结果参见表1。
其中，腹泻率(％)＝试验期各组腹泻仔猪头次/(仔猪头数×试验天数)×100％；死亡率(％)＝各组死亡仔猪头数/仔猪头数×100％。
表1 哺乳期仔猪死亡率和腹泻率统计
根据图1所示结果可知，与对照组相比，本发明实施例2～3所述微生物组合物将平均末重分别提高45.47％、38.85％(P＜0.05)，将平均日增重分别提高53.33％、46.67％(P＜0.01)，与对照组相比，实施例1的平均末重和平均日重也有所增加，但在统计学上无显著差异(P＞0.05)。
根据表1所示数据可知，试验期间，对照组和实施例1各出现1例死亡，实施例2～3无死亡；与对照组相比，实施例1～3腹泻率明显降低，尤其是实施例2无腹泻情况，对照组腹泻率是实施例1、3的2.0倍和3.35倍。
实验例2
试验结束当天，每组随机选取5头仔猪现场前腔静脉采血后，装笼运输至北京农学院动物科学学院实验室进行屠宰。
1.将现场屠宰后的胃、肺、胰脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、小肠、大肠分别称重并记录，计算对应器官指数(具体检测结果参见表2)，其中，器官指数＝器官质量(g)/活体重(Kg)。
表2 哺乳期仔猪器官指数统计
2.将各组仔猪空肠、十二指肠、回肠分别截取1厘米左右肠段，屠宰现场立即用4℃PBS缓冲液淋洗干净后放入4％多聚甲醛溶液中固定，24h后更换新固定液。将固定的样本制成蜡块，并经HE染色后显微镜下测量绒毛长度和隐窝深度，并计算绒腺比(具体结果参见图2～3)，其中，绒腺比＝绒毛长度(μm)/隐窝深度(μm)。
根据表2所示结果可知，与对照组相比，实施例1～3小肠指数均有升高趋势，分别提高22.48％、26.42％、41.26％，其中，实施例3小肠指数显著提高(P＜0.05)，由此可推测复合微生物组合物有效促进了小肠生长发育，从而可促进哺乳期仔猪消化吸收。各组仔猪中胰腺、肝脏、脾脏等器官指数无差异，说明复合微生物组合物对仔猪安全无毒，不会导致其免疫器官的异常。
根据图2所示结果可知，与对照组相比，实施例2十二指肠和回肠的绒腺比极显著(P＜0.01)提高，实施例3十二指肠和回肠绒腺比显著(P＜0.05)提高。
根据图3所示结果可知，对照组和实施例1的仔猪回肠绒毛普遍短小，相比之下，实施例2～3绒毛高度明显增大，且绒毛的完整性良好。
实验例3
试验第28天早晨，每组随机选取5头仔猪，用10mL一次性注射器前腔静脉取血约5mL，45度角倾斜置于放有冰袋的保存容器。血清自然析出后经4000r/min转速离心10min后收集，相关指标委托中同蓝博检测临床检验所进行测定，检测仔猪血清谷丙转氨酶、血清尿素、血清IgG和IGM的含量，具体检测结果见图4～7。
根据图4～7所示结果可知，与对照组相比，本发明实施例1～3所述复合微生物组合物分别降低血清谷丙转氨酶含量25.4％、23.8％和11.9％，改善哺乳期仔猪的肝脏功能；同时降低仔猪血清尿素含量，提高仔猪对蛋白质的代谢利用，其中实施例2降低仔猪血清尿素明显，为17.3％；提高仔猪血清中IgG和IgM的含量。
实施例4
提取屠宰后经仔猪十二指肠、空肠、回肠样品中的蛋白，通过WB的方法检测紧密连接蛋白Claudin、Occludin-1和ZO-1的含量，具体检测结果参见图8-图10。
根据图8～图10所示结果可知，与对照组相比，本发明实施例1～3所述复合微生物组合物能够部分地或全部地增加仔猪十二指肠、空肠和回肠中紧密连接蛋白Claudin、Occludin-1和ZO-1的含量，其中，实施例2所述复合微生物组合物的效果最为突出。
实验例5
将100头新生仔猪随机分为五组，每组20头，经检验各组间仔猪初重无显著差异。各组仔猪自然母乳喂养；对照组(CK组)和实施例2、对比例1～3分别口腔喷服2mL生理盐水，实施例1～3所述复合微生物组合物和对比例1～3所述微生物组合物。所述喷服操作在仔猪第1、7、14、21日龄时进行，期间母猪和仔猪的管理及免疫按照养殖场常规流程进行。试验期28d。
各组仔猪出生后分别标记耳标，并对应各自耳标称量记录1日龄初重和28日龄末重，并计算日均增重量，具体结果参见表3；每日记录各组仔猪腹泻及死亡情况，统计腹泻率和死亡率，具体统计结果参见表3。
其中，腹泻率(％)＝试验期各组腹泻仔猪头次/(仔猪头数×试验天数)×100％；死亡率(％)＝各组死亡仔猪头数/仔猪头数×100％。
表3 哺乳期仔猪的平均日增重、腹泻和死亡率统计
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种复合微生物组合物，其特征在于，所述组合物包括以下两种菌株：保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌Zhang-LL和保藏号为CGMCC No.10790的凝结芽孢杆菌Liu-g1；
所述植物乳杆菌Zhang-LL与所述凝结芽孢杆菌Liu-g1的活菌数比为1:0.5～2；
优选地，所述组合物的剂型为液体制剂或固体制剂；
更优选地，所述液体制剂中所述植物乳杆菌植物Zhang-LL的活菌数为1.0×108～1010CFU/mL，所述凝结芽孢杆菌Liu-g1的活菌数为1.0×108～1010CFU/mL；
更优选地，所述固体制剂中所述植物乳杆菌Zhang-LL的活菌数为1.0×108～1010CFU/g，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×108～1010CFU/g。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述液体制剂中所述植物乳杆菌的活菌数为1.0×109CFU/mL，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×109CFU/mL；或者，
所述固体制剂中所述植物乳杆菌的活菌数为1.0×109CFU/g，所述凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×109CFU/g。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括益生元，所述益生元选自低聚糖、乳果糖、α葡聚糖、β葡聚糖、右旋糖酐、膳食纤维、果胶、阿拉伯胶、魔芋胶、瓜儿胶、黄原胶、麦芽糊精、抗性淀粉和回生淀粉中的一种或多种；
优选地，所述低聚糖选自菊糖、低聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、低聚木糖醇、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、低聚乳糖、低聚甘露糖、低聚乳果糖、低聚龙胆糖、低聚壳聚糖、阿拉伯半乳聚糖、牛奶衍生低聚糖、N-乙酰化低聚糖、岩藻糖基化低聚糖、唾液酸化低聚糖、大豆低聚糖、洋蓟低聚糖、燕麦低聚糖、洋葱低聚糖、松木低聚糖、或芦笋低聚糖中的一种或多种；
优选地，所述膳食纤维包括水溶性膳食纤维或非水溶性膳食纤维。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述液体制剂的剂型选自喷剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、滴剂、合剂或糖浆剂；优选地，所述喷剂选自喷雾剂或气雾剂；优选地，所述乳剂选自油包水型乳剂或水包油型乳剂；
所述固体制剂的剂型选自粉散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、或膏剂；优选地，所述粉散剂选自粉剂、颗粒剂或散剂；更优选地，所述粉散剂为冻干粉或由冻干粉制成；优选地，所述片剂选自肠溶片、分散片、速释片、缓释片、控释片、浸液片、咀嚼片或泡腾片；优选地，所述胶囊剂选自硬胶囊、软胶囊、肠深胶囊或控释胶囊。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体；
优选地，所述药学上可接受的载体包括填充剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、湿润剂和润滑剂中的一种或多种；
更优选地，所述填充剂选自甘露糖醇、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、山梨糖醇、木糖醇、粉末纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、淀粉、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、磷酸钙、碳酸金属盐、金属氧化物或铝硅酸金属盐中的一种或多种；
更优选地，所述稀释剂选自月桂基硫酸金属盐、聚乙二醇、脂肪酸酯的甘油酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯-烷基醚、烷基硫酸金属盐、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、脂肪酸糖酯、聚乙醇酸化甘油、季铵胺化合物、月桂酰基聚乙二醇甘油酯、辛基己酰基聚乙二醇甘油酯、硬脂酰基聚乙二醇甘油酯、亚油酰基聚乙二醇甘油酯、油酰基聚乙二醇甘油酯、聚乙氧基化植物油、聚乙氧基化固醇、聚乙氧基化胆固醇、聚乙氧基化甘油脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、磺基琥珀酸酯、牛磺酸酯或多库酯钠中的一种或多种；
更优选地，所述崩解剂选自交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交聚维酮、褐藻酸、褐藻酸钠、褐藻酸钾、褐藻酸钙、离子交换树脂、基于食物酸和碱性碳酸盐成分的泡腾系统、粘土、滑石粉、淀粉、预胶化淀粉、淀粉乙醇酸钠、纤维素屑、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硅酸钙、碳酸金属盐、碳酸氢钠、柠檬酸钙，或磷酸钙中的一种或多种；
更优选地，所述粘合剂选自聚乙烯吡咯啶酮、共聚维酮、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、交联聚(丙烯酸)、卵磷酯、酪蛋白、聚乙烯醇、凝胶或高岭土；
更优选地，所述湿润剂选自月桂基硫酸金属盐、聚乙二醇、脂肪酸酯的甘油酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯-烷基醚、烷基硫酸金属盐、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、脂肪酸糖酯、聚乙醇酸化甘油、季铵胺化合物、月桂酰基聚乙二醇甘油酯、辛基己酰基聚乙二醇甘油酯、硬脂酰基聚乙二醇甘油酯、亚油酰基聚乙二醇甘油酯、油酰基聚乙二醇甘油酯、聚乙氧基化植物油、聚乙氧基化固醇、聚乙氧基化胆固醇、聚乙氧基化甘油脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、磺基琥珀酸酯、牛磺酸酯或多库酯钠；
更优选地，所述润滑剂选自硬脂酸、硬脂酸金属盐、硬脂酰富马酸钠、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、山萮酸甘油酯、植物油、亮氨酸、二氧化硅、硅酸、滑石粉、丙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚亚烷基二醇或氯化钠。
6.权利要求1～5任一项所述的组合物的使用方法，其特征在于，所述方法包括向哺乳期仔猪喂食权利要求1～5任一项所述的复合物微生物组合物，优选地，所述复合微生物组合物的喂食量为1.5～2.5g/次，或1.5～2.5ml/次；更优选地，所述复合微生物组合物的喂食量为2g/次，或2ml/次。
7.权利要求1～5任一项所述的组合物在制备用于增加哺乳期仔猪体重、增强哺乳期仔猪免疫力和/或防止哺乳期仔猪腹泻的制剂的用途；优选地，所述哺乳期仔猪为35日龄以下的仔猪，优选为1日龄仔猪、7日龄仔猪、14日龄仔猪、21日龄仔猪或28日龄仔猪。
8.一种哺乳期仔猪饲料，其特征在于，所述哺乳期仔猪饲料包括权利要求1～5任一项所述的组合物和基料。
9.权利要求8所述的哺乳期仔猪饲料，其特征在于，所述饲料中所述组合物的质量分数为1～5％，优选地，所述组合物的质量分数为1％，2％，3％，4％或5％；最优选地，所述组合物的质量分数为4％。
10.权利要求8或9所述饲料的使用方法，其特征在于，所述方法包括向哺乳期仔猪喂食权利要求8或9所述的饲料，其中，所述饲料的喂食量为40～60g/次，优选地，所述饲料的喂食量为50g/次。
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